鑲嵌式高通量基因芯片檢測技術及試劑盒的制作方法

專利名稱：鑲嵌式高通量基因芯片檢測技術及試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種新型的鑲嵌式高通量基因芯片檢測技術及試劑盒的制備方法。該技術靈敏快速、信息量大，制備方法簡便、成本低，能同時檢測樣品中多種不同的核酸分子、生物化學分子、微生物或細胞等成分，可廣泛地用于生物學、醫藥學、預防醫學、動植物學、農牧業、食品與衛生、能源與化工、環境監測以及醫學診斷與檢測等領域。
固相吸附、分離與合成技術在樣品或樣品溶液、生物體液(如血液、血清、血漿、腦脊液、尿液等，淚液、汗液、消化液和精液等分泌液，組織液、滲出液、嘔吐物、糞便、組織/細胞勻漿液等)、微生物或細胞中的蛋白、核酸等生物化學分子的檢測、分析、分離、純化以及蛋白多肽、寡核苷酸、先導化合物和藥物的合成等方面已被廣為應用。
生物固相技術主要是利用不溶的固相基質材料，通過表面吸附或結合以捕獲液相被分析物和被純化物中的靶分子或固定新合成的靶分子，借助重力、壓力、離心、過濾、磁力、流體等，經過一步或多步操作很方便的將未結合的分子(液相、游離相或流動相)與結合分子(固相)分離，以便獲得純的目的分子，或將靶分子從復雜的樣品混合物或懸液中分離出來，用于進一步的分析研究。根據實驗的不同，固相基質可用多種不同的材料，如玻璃、塑料、乳膠、葡聚糖、瓊脂糖、磁性材料、陶瓷、金屬和非金屬等制成平板、多孔板、微顆粒和微孔顆粒等。
在樣品的檢測分析、分離純化、合成等實驗中，大部分情況下需要在同一個容器里、同時進行兩項或多項實驗，以便對樣品中多種不同成分的有無、含量和來源等做出平行的定性、定量、定位等檢測分析；或對單一種分子的多種不同特性(如單核苷酸多樣性)進行平行檢測與分析；或對多種物質同時進行分離純化，或同時進行多種不同分子的合成。在此情況下，傳統的固相吸附試驗所存在的問題是對超過3種以上的不同被檢測物，純化物或合成物由于難以區分，很難同時進行。也就是說，用傳統的固相技術或方法，在一個容器或試驗中被檢測物、合成物或分離物的數量受固相系統的限制或制約，更無法同時或連續進行合成、分離與檢測等操作。
在現代基因組學、蛋白質組學和功能組學的分析研究和技術開發中，需要同時對同一樣品中大量的、多種不同生物化學物質進行快速、靈敏的高通量合成、分離、純化與檢測，以分析生物化學物資的種類、數量、組成、變異以及多態性、翻譯后修飾、結構、氨基酸/核苷酸/糖基等的排列順序、不同生物分子間的相互作用，或個體的健康、感染狀態與用藥特性，個體免疫系統的功能狀態、遺傳差異等。傳統解決辦法是首先通過合成與分離純化等技術和工藝，分別合成或純化大量的各種不同的生物探針，如藥物分子、核酸分子、蛋白分子、生長因子與受體、抗原和各種不同特異性的抗體等，再分別將生物探針固相化在不同的微孔板或微珠等固相基質的表面，分別與樣品中對應的化學物質、抗體或/和抗原分別反應，再分別進行檢測分析，由于合成、分離純化與檢測分析等操作相互脫節，因此如要檢測十幾種成分就需進行十幾次不同的合成、分離純化與檢測分析實驗，異常繁瑣復雜。現有的生物芯片技術(如Affymatrix公司等提供的技術方案)雖將檢測分析集成為一體，使樣品的高通量檢測被簡化，但其生物探針的制備和固相化技術、工藝依然十分復雜，效率低。Illumina公司通過一種帶有電磁波發射裝置的微珠所建立的檢測技術，雖進一步簡化了生物探針的制備和固相化技術，但是由于電磁波發射裝置的存在，不僅制造成本較高，同時也使得微珠的大小和固相中生物探針的容量和檢測靈敏度等受到限制，同時還需解決電磁屏蔽等問題。本發明的目的就是要提供一種技術和工藝更為簡便靈敏、快速及時，又可同時檢測樣品中多種不同物質成分、特別是核酸與蛋白分子的生物合成、分離純化、檢測以及可以將三者有機結合，貫通一起的新的高通量生物技術。
本發明的主要技術特征是，將表面連接有不同核酸分子的微珠，分別鑲嵌在檢測板的不同微孔中，微孔間有微管相連，并與進/出液口形成微流路與外界相通，樣品通過微流路與微珠表面連接的核酸分子反應，各孔的反應結果可用目測或用儀器記錄分析，根據微珠在檢測板中的排列位置和順序，對樣品、細胞和微生物等生物標本中的化學物質、生物靶分子、核酸、寡核苷酸、藥物等多種不同成分的有無、性質、含量、來源、組織和細胞學定位等同時進行鑒定分析。
本項發明同時還提供了一種基于鑲嵌式高通量基因芯片檢測技術制備試劑盒的方法，其主要技術特征在于試劑盒由鑲嵌有微珠，帶有微流路的多孔檢測板及各種相關的配套試劑分別組成；根據檢測板各微孔反應的有無與強弱，以及各微孔在檢測板中的排列位置和順序，可對不同樣品中多種不同成分同時進行比對分析，利用試劑盒中所提供的試劑和方法還可對檢測板中各孔所捕獲的樣品成分，做分子克隆、分子結構、親和力、分子量、等電點、糖基化、磷酸化、核苷酸或氨基酸序列測定等進一步分析。該試劑盒不僅大大簡化了同一樣品進行多因素檢測分析的操作步驟，縮短了操作時間，降低了工作強度，更增加了檢測結果的精確性、靈敏度、重現性和可比性，而且還可同時對檢測樣品中多種不同的物質成分做進一步的不同分析，使用更方便，操作更快捷，并且可廣泛地應用于環境檢測、疾病診斷、新藥開發、疫苗研究、生物分子相互作用、基因組學、蛋白質組學和功能組學等技術、研究領域。
為了達到上述目的本發明所采用的技術方案其基本特征在于，鑲嵌式高通量基因芯片檢測技術及試劑盒的制備至少包括下述成分或步驟①一種由微孔板(1)、微珠(2)等組成的檢測板；微孔板由板體(3)、板蓋(4)、微孔(9)、和微流路等結構組成；微珠通過手臂分子(12)上的活性基團連接核酸(13)或寡核苷酸(14)分子探針形成表面分子涂層，并按一定的順序鑲嵌在不同的微孔中；②被檢樣品，如固/液體標本、生物體液、組織、細胞、微生物等經過處理，如稀釋、去除顆粒性物質、組織/細胞的裂解、分離純化、反轉錄、PCR擴增、標記等；或不處理直接由進液孔(5)進入微孔板、沿微槽和/或微管流經微孔與微珠表面連接的核酸分子相互作用，使樣品中的蛋白或序列互補的核酸分子與固相核酸分子探針在特定的條件下雜交或特異性結合，未結合的樣品成分經出液孔(6)流出；③用標記分子(15)，如熒光素、同位素、生物素和半抗原，膠體金、酶、稀土離子及其螯合物等物質或其衍生物(如Cy5-dCTP，32P-dCTP等)直接標記被檢樣品；或用標記分子的不同標記產物，如熒光抗體等標記物(16)標記被檢樣品；
④漂洗，去除微孔板中非特異性結合的或殘留的樣品或樣品標記物和標記物(16)、等；⑤目測或用掃描儀等檢測各微孔中標記分子(15)的有無與含量，如熒光、發光產物、放射性的有無，強弱或顯色產物的有無，顏色的深淺等，分析被檢樣品中被檢物的有無、含量、組成、來源、分子結構、親和力、組織/細胞學定位以及核苷酸或氨基酸序列等；⑥標記物為酶時，如HRP(辣根過氧化物酶)，AP(堿性磷酸酶)、熒光素酶(Luciferin)等，觀察結果前需先加入顯色劑或發光試劑等底物試劑，如OPD(鄰苯二胺)、DAB(二氨基聯苯胺)或發光試劑(如魯米諾、甲基傘形酮磷酸酯、對羥基苯乙酸)等。
本發明的特征還在于微孔板由板體、板蓋、微孔和微流路組成；板體和板蓋為任何可加工成型的、透光的、不透光的或反光的硬質或軟質材料，如玻璃、塑料、高分子合成材料、陶瓷、金屬、非金屬等多種不同材料或復合材料等，可加工成方形、長方形、園盤型或其它外觀形狀的實體結構；在板體和板蓋上可分別具有進液孔、出液孔、密封圈(7)、蠕動管(8)、微孔、微槽(10)、微管(11)、驅動孔、定位孔和視窗等部分或全部結構；微孔按一定的格式排列，其間有微槽或/和微管直接或間接兩兩相連，通過微流路與外界相通或形成閉合環路；板體和板蓋分別或共同經不同的化學修飾或表面處理，①產生反光層，反射光信號；②獲得惰性化學涂層，如辛胺、泰富隆(Teflon)涂層、硅化等處理以減少樣品和/或標記物等對板體和板蓋的非特異性吸附。
本發明的特征還在于微珠是由任何可加工成型的材質，如玻璃、塑料、葡聚糖、聚蔗糖、瓊脂糖、高分子合成材料、纖維素、乳膠、硅膠、層析基質、陶瓷、磁性材料、金屬或非金屬等多種不同材料或復合材料，經加工而成的，大小均一、具有不同外觀形狀的多孔或實心體；微珠經表面處理可獲得帶有不同活性基團的手臂分子；手臂分子上的活性基團可進一步與不同的核酸分子或寡核苷酸分子探針等連接，獲得具有不同結合特性的表面分子涂層。
本發明的特征還在于微流路由進液孔、出液孔、微槽、微管、密封圈、蠕動管等結構組成，可分別位于板體或板蓋上，也可全部位于板體或板蓋上，其在板體或板蓋上的不同位置與組合，可形成具有不同幾何特征，滿足不同實驗需求的微流路；微流路通過微槽或/和微管與微孔相連，并通過進液孔和出液孔與外界相通；蠕動管位于進/出液孔之間，將微流路連接成閉合環路，以便液相可與固相充分反應；蠕動管可位于檢測板上也可以外置，蜂巢式微孔板可無微槽和微管，亦或無進/出液孔等結構，使用時可通過視窗添加樣品和漂洗；蜂巢式微孔板可無微槽和微管，或也無進/出液孔等微流路結構；微流路經表面處理可獲得不同的惰性表面涂層。
本發明的特征還在于表面分子涂層是指通過手臂分子上的活性基團，分別連接的具有不同序列和長度的核酸分子或寡核苷酸分子探針，在微珠和微孔的固相基質表面形成的具有一定結合特性的核酸分子表面；分子涂層的種類和制備方法至少包括①通過核酸合成儀直接在微珠的固相基質表面合成，獲得小分子的寡核苷酸分子探針的表面分子涂層；②通過手臂分子上的活性基團，連接或吸附各種不同序列的核苷酸或寡核苷酸探針，形成表面分子涂層；
③以微珠表面的寡核苷酸分子探針為特異性引物，已知序列核酸為模板，在試管或微孔板中通過PCR反應延長寡核苷酸鏈并擴增，獲得長鏈核酸分子探針的表面涂層。
本發明的特征還在于被檢樣品和長鏈核酸分子探針，可用寡核苷酸引物，通過至少一個循環周期的PCR反應進行擴增或延長，擴增或延長反應可在微孔板中也可在試管中進行。該循環周期包括a)樣品核苷酸的加熱變性；b)引物與模板或樣品中的靶核苷酸退火雜交；c)用DNA聚合酶延長靶核苷酸鏈序列。
本發明的特征還在于以熒光染料(如FITC，Cy3，Cy5，Texas Red等熒光素)、同位素(125I，32P，35S，3H等)、生物素和半抗原，膠體金、酶(HRP，AP，半乳糖苷酶，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，尿素梅和熒光素酶等)、稀土離子(如Eu，Sm，Tb和Dy等)及其螯合物(如Eu3+-DTPA)等或其衍生物(如Cy5-dCTP，32P-dCTP等)直接標記被檢樣品；或用標記分子的不同標記產物，如熒光抗體、酶標抗體、生物素化抗體、生物素化酶、Eu3+-DTPA-抗體等能與樣品中的被檢物特異性結合的標記物(16)標記被檢樣品(間接標記)；標記反應可在微孔板中進行，也可以在試管中進行；但在微孔板中進行標記時只采用摻入標記，而不使用偶聯或修飾等標記方法。
8.本發明的特征還在于可采用下述方法進行定量分析①在同一塊微孔板上連接相同序列核酸分子的微孔或鑲嵌微珠的微孔數量可有1個或1個以上的復孔，當樣品沿微流路逐孔流經各微孔及其復孔時，對應的被檢物被不斷結合，并不斷地從樣品液中去除，因此，各微孔及其復孔的結合量，因前后排列順序的不同逐漸減少，即使進行PCR擴增，也因各微孔結合模板數量的不同，導致擴增量有明顯不同；因此可根據各微孔與復孔反應的有無與強弱變化，進行定量分析；②在進行定量分析時，可按此方法設定標準參照物，借助計算機分析可繪出標準參照物的濃度-反應孔數量或拷貝數與其強弱變化曲線，對照標準曲線，結合標本體積，獲得精確的定量分析結果。
9.本發明的特征還在于試劑盒至少裝有一塊檢測板，微孔中至少鑲嵌一粒微珠，微珠表面分別連接某種特定序列的核酸分子，并與下述成分分別或共同組成不同的試劑盒①至少有一管組織/細胞或微生物樣品處理液，用于DNA，RNA或蛋白質的提取；處理液可分別含有適量的去垢劑(如Triton X-100，NP40，Chaps等)、核酸酶抑制劑(如DNA酶和RNA酶抑制劑)、蛋白酶抑制劑，如PMSF，EDTA，TPCK，TLCK，aprotinin，leupeptin，antipain等，以保證樣品充分裂解和溶解，同時保證DNA、RNA或蛋白分子等不被降解；②至少有一管為dNTP(三磷酸脫氧核苷)，引物和用于PCR擴增的熱穩定的DNA聚合酶用于樣品的擴增或微珠捕獲的樣品成分的基因克隆；③至少有一管為dNTP和反轉錄酶，用于用于樣品mRNA互補cDNA的合成；④至少有一管含標記分子及其衍生物(如FITC，Cy3，Cy5，Texas Red，地高辛和生物素、Cy5-dCTP，32P-dCTP等)或標記物(如熒光抗體、酶標抗體等)用于對樣品的直接或間接標記；⑤在標記物為酶類時，至少有一種顯色底物或發光底物，如OPD或DAB與過氧化氫/脲、魯米諾，甲基傘形酮磷酸酯，ATP等；⑥至少有一管洗滌液或其濃縮液，如含有適量BSA或小牛血清、鮭精DNA，脫脂奶粉、去垢劑等的緩沖液，可用于檢測板的漂洗或流洗，以去除反應中的各種非特異性結合物；⑦至少有一管為蛋白質濃度檢測分析試劑，如Folin-酚試劑，Bradford試劑等；
⑧至少有一管為核酸內切酶(如EcoRI等)、蛋白水解酶(如胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，羧肽酶等)，用于微珠捕獲核酸或蛋白的消解，以便進行蛋白質的質譜分析、核苷酸或氨基酸序列分析；⑨至少有一管為電泳樣品緩沖液，如含適量SDS或尿素等不同蛋白質變性劑的SDS-PAGE電泳樣品緩沖液或含有尿素或Chaps等的IEF電泳樣品緩沖液及核酸電泳樣品緩沖液等用于電泳分析；⑩至少有一管為蛋白質糖基化或蛋白質磷酸化分析試劑，如PNGase F，磷酸酶(如細菌堿性磷酸酶，馬鈴薯磷酸酶等)。
本發明的特征還在于在完成基本檢測分析后，還可用試劑盒中的試劑通過下述不同的方法對檢測板各不同孔所結合的樣品成分分別做質譜分析、核苷酸/氨基酸序列測定、蛋白質磷酸化以及糖基化等進一步分析前的處理①直接在感興趣的各微孔中加入核酸內切酶、蛋白水解酶、磷酸酶或電泳樣品緩沖液或蛋白質糖基化分析等試劑，對微孔和微珠的結合物在原位做基因克隆或進一步分析前的樣品處理；②將微孔中的生物微珠取出，在微量反應器中分別加入對應試劑做基因克隆或進一步分析前的樣品處理；③將新鮮樣品分別與感興趣微孔的復本微珠共育，以同樣的條件重復微孔板的操作步驟，將樣品中感興趣的物質成分與樣品液分離，加入對應試劑，對結合物做基因克隆或進一步分析前的樣品處理。
本發明具有以下優點1信息量大。微珠的大小可從毫米到納米，目前各種商售的固相基質顆粒一般在幾十微米到數百微米之間，如按50微米計算，則每平方毫米至少可容納100枚，每平方厘米可容納約10萬枚，相當于人類全部基因的2-3倍。因此，如能將全部基因探針連接在微珠表面，用于基因表達的研究，經一次檢測分析，就可同時獲得數萬種不同表達基因平行檢測分析的結果與數據資料。2.易于制備、成本低。本發明所述的微珠可選用各種商售產品為原材料，如寡核苷酸固相合成用的基質材料多孔玻璃珠、聚苯乙烯珠、各種層析基質、硅膠珠等，本發明將核酸探針的擴增、PCR引物的合成、樣品的標記與擴增等固相合成、分離純化與生物微珠的制備融為一體，省略了繁雜的生物分離純化過程；3.自由組合，靈活易變。可完全依照使用目的的不同，自由組合，或靈活地改變微孔板中任何一孔鑲嵌微珠的種類和結合特性以改變檢測的內容，而無需變動全部排列順序和格式；4.靈敏度高。本技術方法所用的固相基質采用了三維立體結構，即微珠與微孔均可或分別作固相。每個微珠相當于固化了配基/配體的親和層析基質，與傳統方法相比，有更大的比表面積和比結合容量。同時由于通過手臂分子上的化學活性基團連接核酸分子，消除了空間位阻對分子雜交時的影響，進一步提高了比結合容量。為提高反應靈敏度，還可采用多孔微珠和微孔作固相，使比表面積遠遠超過現有技術和方法。當樣品逐孔流過串珠樣排列的微孔時，可與固相中的核酸探針雜交或特異結合(具有過濾、親和層析、分離與濃縮效用)；同時被固相吸附后的樣品液不再與樣品原液混合，減少了被檢測物(如抗原/抗體等)因反復擴散、平衡而被稀釋的影響，故更加靈敏；5.操作簡便，節省樣品與試劑。采用本發明所述的高密度微孔板進行檢測分析，樣品、標本、標記物、洗液和底物沿微流路逐一流經各孔，改變了傳統和現有技術分別反應、清洗或在較大的容器中反應和浸洗的操作方式，因此可解決因樣品不易獲得和標記物價格昂貴所帶來的困擾，可大量節約試劑，并且易于實現全自動化操作；6.定量分析更準確。本方法將數十種甚至數千種化學物質和生物分子的檢測分析集中在一塊檢測板上同時進行，根據檢測板中各微孔中熒光、膠體金沉積、發光的有無，或成色產物的生成與否，對照其排列位置，不僅可以確定樣品的組成及各組分的來源、含量，組織/細胞定位，同時又便于不同樣品間和同一樣品不同成分間的平行比對。微珠的表面分子的連接、擴增和標記可在同一試管中一次性大量制備，從而可保證各復孔和各檢測板之間的檢測結果的平行一致。在需要對某一成分進行定量分析時，通過增加相同包被物平行包被的復孔數量，配合微流路解決了定量分析的問題；7.保留了傳統和現有檢測方法重復性好，準確性高、可靠性強等優特點。8.結果易于分析。由于微珠的形狀和尺寸相同，封閉式鑲嵌立體結構可避免灰塵引起的噪聲信號，因而能獲得均勻和最小的圖像背景強度，同時每個微孔和微珠的排列可與光電信號轉換元件的排列一致，因此可獲得最佳的基因芯片圖像。9.用途更廣泛。本發明不僅可直接用于疾病的診斷、新藥的開發和蛋白質組學等現代生命科學的研究與開發；而且對感興趣的微孔還可直接在檢測板中進行基因克隆、核苷酸/氨基酸變異與序列分析、DNA結合蛋白的糖基化、磷酸化、以及分子結構、功能、親和力與組織/細胞及亞微或超微結構定位等進一步分析。
圖中所示為微孔板1，微珠2，板體3、板蓋4、進液孔5、出液孔6、密封圈7、蠕動管8、微孔9、微槽10，其中微珠2鑲嵌在微孔9中；各微孔間的微槽10將微孔9與進液孔5、出液孔6，相連并和密封圈7等結構組成微流路；圖中微孔9與微槽10、進液孔5、出液孔6和密封圈7形成微流路，再與蠕動管8構成閉合環路。圖2為3種典型檢測板的外觀結構示意中2A，2B，2C分別為3種典型檢測板的外觀結構示意圖，圖中所示為微孔板1、進液孔5、出液孔6，驅動孔20，定位孔21和視窗22等結構。圖2C所示的檢測板也可為蜂巢式，微孔間可無微槽或微管，但保留進液孔5，出液孔6；或者無進液孔5，出液孔6等結構，使用時直接經視窗22添加樣品和漂洗。圖3是圖2A中虛線框A部分的放大圖。
圖3A為平面圖，圖中所示為微孔板1、微孔9、不連續的微槽10，鑲嵌在微孔9中的微珠2，以及與微槽10相通的進液孔5、密封圈7；圖3B為圖3A的A-A剖面圖，圖中所示為板體3、板蓋4、微孔9、微槽10、微管11、鑲嵌在微孔9中的微珠2，進液孔5、密封圈7等；圖中微孔9上端的微槽10與板蓋4形成微管11，并與下端的微管11將微孔9兩兩相連，與進液孔5、出液孔6等形成完整的微流路。圖4是圖2A中虛線框B部分的放大圖。
圖4A為平面圖，圖中所示為微孔板1、微孔9、微槽10，鑲嵌在微孔9中的微珠2；
圖4B為圖4A的A-A剖面圖，圖中所示為板體3、板蓋4、微孔9，鑲嵌在微孔9中的微珠2；圖中微孔9兩端的微槽與板蓋形成微管11，將微孔9兩兩相連，與進液孔5，出液孔6等形成完整的微流路。圖5是具有不同微流路的檢測板的局部放大圖。
圖中所示為板體3、微孔9、微槽10，鑲嵌在微孔9中的微珠2；圖中兩個相鄰微孔的側壁上有微管11，其上端的開口與微槽10相通，微槽10與板蓋4形成微管11，微管11上下兩端的開口將微孔9兩兩相連，并可與進液孔，出液孔等形成完整的微流路。圖6是微珠2的結構示意圖。
圖6A顯示多面體微珠2，通過手臂分子12上的活性基團連接寡核苷酸分子探針14；圖6B是用纖維素膜或微孔膜制成的片狀微珠2，表面吸附核酸13分子探針。
圖6C是多面體微珠2的剖面圖，顯示多孔結構，微珠2的表面通過帶活性基團的手臂分子12連接核酸分子探針13；圖6D是球體微珠2的外觀結構示意圖，表面是手臂分子12上的寡核苷酸14分子探針引物，經PCR延長、擴增反應獲得產物25和嵌合分子核酸分子探針23。圖7固相PCR制備長鏈核酸分子探針原理示意圖。
圖中微珠2的表面是固相合成的或通過帶活性基團的手臂分子12連接的寡核苷酸分子探針14。寡核苷酸14分子探針與已知序列的模板27雜交，在DNA聚合酶的催化下延長，獲得與模板27堿基序列互補的長鏈核酸分子23(擴增產物25與寡核苷酸分子14的嵌合分子)；或以寡核苷酸分子探針14為引物與寡核苷酸引物26配對，通過PCR反應擴增，最終在微珠表面獲得足量的長鏈單股核酸分子探針23或雙股核酸分子探針28。圖8鑲嵌式基因芯片核酸分子探針工作原理示意圖。
圖8A，樣品核酸分子24在試管中經標記分子15標記后，與微珠2表面手臂分子12上的核酸分子探針13雜交，未雜交的樣品核酸分子經漂洗去除，檢測標記物獲得分析結果。
圖8B，樣品中的核酸分子24，24’24”等在試管中經標記分子15標記后，分別與鑲嵌在不同微孔中的微珠2，2’2”等表面手臂分子12上的核酸分子探針13，13’13”等雜交，未雜交的核酸分子經漂洗去除，檢測標記物獲得高通量分析結果。
圖8C，在試管中樣品中的核酸分子24用5’端帶有標記分子15的引物，經至少一個循環的PCR擴增后，擴增產物25與微珠2表面手臂分子12上的核酸分子探針13雜交，未雜交的樣品核酸分子經漂洗去除，檢測標記物獲得分析結果。
圖8D，樣品中的核酸分子24，24’24”等在試管中用5’端帶有標記分子15的引物，經至少一個循環的PCR擴增后，擴增產物25，25’25”等與鑲嵌在不同微孔中的微珠2，2’2”等表面手臂分子12上的核酸分子探針13，13’13”等雜交，未雜交的樣品核酸分子經漂洗去除，檢測標記物獲得高通量分析結果。圖9是鑲嵌式基因芯片寡核苷酸分子探針工作原理示意圖。
圖9A，樣品中的核酸分子24在試管中經標記分子15標記后，與微珠2表面手臂分子12上的寡核苷酸分子探針14雜交，未雜交的樣品核酸分子24經漂洗去除，檢測標記物獲得分析結果。
圖9B，樣品中的核酸分子24，24’24”等在試管中經標記分子15標記后，與鑲嵌在不同微孔中的微珠2，2’2”等表面手臂分子12上的不同核酸分子14，14’14”等雜交，未雜交的樣品核酸分子可經漂洗去除，檢測標記物獲得高通量分析結果。
圖9C，在試管中，樣品中的核酸分子24用5’端帶有標記分子15的引物，經至少一個循環的PCR擴增后，擴增產物25與微珠2表面手臂分子12上的寡核苷酸分子探針14雜交，未雜交的樣品核酸分子可經漂洗去除，檢測標記物獲得分析結果。
圖9D，在試管中，樣品中的核酸分子24，24’24”等用5’端帶有標記分子15的引物，經至少一個循環的PCR擴增后，擴增產物25，25’25”等與2，2’2”等微珠表面手臂分子12上的寡核苷酸分子探針14，14’14”等雜交，未雜交的樣品核酸分子經漂洗去除，檢測標記物獲得高通量分析結果。
圖9E，樣品中的核酸分子24與微珠2表面的寡核苷酸分子探針14雜交；以樣品中的核酸分子為模板，微珠2表面的寡核苷酸分子探針14和5’端帶有標記分子15的寡核苷酸26為引物，經至少一個循環的PCR擴增后，擴增產物25與微珠2表面手臂分子12上的寡核苷酸分子探針14或寡核苷酸引物26形成嵌合分子，未雜交的樣品核酸分子經漂洗去除，檢測標記物獲得分析結果。
圖9F樣品中的核酸分子24，24’24”等與檢測板中微珠2，2’2”等表面的寡核苷酸分子探針14，14’14”等雜交，以樣品中的核酸分子為模板，以微珠2表面的寡核苷酸分子探針14，14’14”和5’端帶有標記分子15的寡核苷酸26，或/和26’26”等為引物，經至少一個循環的PCR擴增后，擴增產物25，25’25”等與微珠2表面的寡核酸分子探針14，14’14”等，寡核苷酸26或/和26’26”等形成嵌合分子，未雜交的樣品核酸分子經漂洗去除，檢測標記物獲得高通量分析結果。

圖10固相PCR擴增長鏈核酸分子探針工作原理示意10A和圖10B在試管或在檢測板中，以已知序列的核酸分子27為模板，微珠2表面的寡核苷酸分子探針14和寡核苷酸26為引物，經至少一個循環的PCR延長、擴增后，擴增產物與微珠2表面的寡核苷酸分子探針14或寡核苷酸26嵌合，形成的單鏈嵌合分子23或雙鏈的嵌合分子28，被固定在微珠2的表面；樣品中的核酸分子24經標記，或用5’端帶有標記分子15的寡核苷酸分子引物經至少一個循環的PCR擴增，產物25與微珠2表面的嵌合分子23或28雜交，未雜交的樣品核酸分子經漂洗去除，檢測標記物獲得分析結果。
圖10C和圖10D在試管或在檢測板中，以N個已知不同序列的核酸分子27，27’27”等為模板，微珠表面的不同寡核苷酸分子探針14，14’14”和寡核苷酸26或26’26”等為引物，經至少一個循環的PCR延長、擴增，獲得的擴增產物與微珠2表面的寡核苷酸分子探針14，14’14”或寡核苷酸26或26’26”嵌合，形成不同的單鏈嵌合分子23或雙鏈的嵌合分子28等固定在微珠的表面；樣品中不同的核酸分子24，24’24”等經標記，或用5’端帶有標記分子15的寡核苷酸分子引物經至少一個循環的PCR擴增的產物25，25’25”與微珠2，2’2”表面的不同嵌合分子23或28雜交，未雜交的樣品核酸分子經漂洗去除，檢測標記物獲得高通量分析結果。圖11酶標記法技術原理示意11A，樣品中的核酸分子24經生物素分子(30)標記后，與微珠2表面手臂分子12上的核酸分子探針13雜交，未雜交的樣品核酸分子經漂洗可去除，加入酶(18)標記的親合素或鏈親合素(31)與生物素(30)結合，未結合的酶標記物經漂洗去除；在酶(18)的催化下，加入的底物(19)生成有色產物或發光產物(32)，檢測各孔有色產物或發光產物的有無及顏色的深淺或發光的強弱，獲得分析結果。
圖11B，樣品中的核酸分子24經生物素分子(30)標記后，與微珠2表面的核酸分子探針13雜交，未雜交的樣品核酸分子經漂洗可去除，加入酶(18)標記的抗生物素抗體(33)與生物素(30)結合，未結合的酶標記抗體經漂洗去除；在酶(18)的催化下，底物(19)生成有色產物或發光產物(32)，檢測各孔有色產物或發光產物的有無及顏色的深淺或發光的強弱，獲得分析結果。圖12核酸-蛋白質相互作用檢測分析原理圖12A，樣品中的蛋白分子34經熒光素分子(15)標記后，與微珠2表面的核酸分子探針13或寡核苷酸14結合，未結合的樣品蛋白分子經漂洗去除，檢測熒光的有無及強弱，獲得分析結果。
圖12B，樣品中的蛋白分子34經生物素分子(30)標記后，與微珠2表面的核酸分子探針13或14結合，未結合的樣品蛋白分子經漂洗去除，加入酶(18)標記的抗生物素抗體(33)與生物素(30)結合，未結合的酶標記抗體經漂洗去除；在酶(18)的催化下，底物(19)生成有色產物或發光產物(32)，檢測各孔有色產物或發光產物的有無及顏色的深淺或發光的強弱，獲得分析結果。
本發明在實施中的基本操作步驟和方法如下一.檢測板的制備檢測板的制備方法包括以下基本方法和步驟1.表面處理微孔板和微珠的表面處理因所選材料的不同而略有不同，每種材料其具體處理方法和條件都有多種，本發明在此將《生物分子固定化技術及應用》(蔣中華等，1998年，化學出版社)及中國專利號為01207812.3和申請號為00120798.9的專利為主要參考文獻。運用公知的各種生物大分子固相化技術，處理各種材料的微珠和微孔板，使其表面帶有特定的活性基團，與核酸分子上的活性基團反應，而具有特定的吸附能力。如用2％丙氨基-三乙基硅烷無水丙酮溶液(APES，3-Aminopropyltriethoxysilane，Sigma公司，目錄號A3648)處理的多孔玻璃微珠(Weetall，H.H.，Biochem.Biophys.Acta，1970；2121)。或商售的經表面處理的各種層析基質(如溴化氰活化的Sepharose-4B)，寡核苷酸固相合成用的聚苯乙烯珠或控孔玻璃珠(美國應用生物系統公司，Sigma公司)等。
微孔板也可依據實驗要求做不同的表面處理。如進行硅化處理或泰富隆(Teflon)涂層處理，僅僅作為反應容器或微流路，以減少實驗中的非特異性吸附。2.固相涂層將不同的核酸分子分別與微珠或微孔板表面的活性基團連接，或在微珠或微孔板表面進行原位固相合成以獲得不同核酸分子的表面涂層。表面涂層的獲得方法主要是①修飾連接。利用固相表面手臂分子上的活性基團將核酸分子或寡核苷酸分子通過化學鍵連接在固相基質表面；②固相合成。運用固相化學合成技術，直接在微珠表面進行寡核苷酸分子的固相合成(Edge R.Wang等，1998，核酸探針的合成、標記及應用，科學出版社)；合成反應可以在試管中或裝填于合成儀的專用柱體中進行，也可以在微孔板中進行；③PCR固相擴增。以已知序列的核苷酸分子為模板，將其成對引物中的一個引物連接在微珠上，或以固相合成的寡核苷酸分子為引物進行PCR擴增，擴增產物通過固相化的引物連接并固相化在微珠或微孔的表面，擴增時可分別在不同的試管中同時進行不同的或相同的模板擴增，也可在微孔板中同時進行不同的或相同的模板擴增；3.鑲嵌微珠人工或用全自動機械手系統，將固相涂層處理的微珠按一定順序分別嵌入微孔板的各個微孔中，各微孔中的微珠具有不同的結合特性；在蜂巢式微孔板中，微珠也可具有相同的結合特性，以便對不同的樣品標本同時進行相同的檢測分析。4.封蓋使微孔、微槽與進/出液孔形成微流路，并只能通過進/出液孔與外界相通。5.封閉經進/出液孔用封閉緩沖液以封閉去除微珠、微孔板或微流路等表面可能殘留的活性基團或非特異性結合位點，以減少檢測中可能出現的非特異性結合。由此即獲得能與化學分子、生物分子、抗體和/或抗原，酶、核酸或寡核苷酸分子等特異性結合，并可用于對結合物進行檢測的三維立體鑲嵌式高通量基因芯片。常用的封閉液添加劑有鮭精或酵母DNA聚蔗糖、肝素、聚乙烯吡咯烷酮、牛血清白蛋白(0.5-5％)、脫脂奶粉(0.1-6％)、酪蛋白(0.5-2％)、白明膠(0.1-0.5％)，正常動物血清(0.5-5％)和去垢劑等(如Tween 20，NP40，Triton X-100、SDS)等。但蜂巢式檢測板無微管、微槽或也無進/出液孔，需封蓋前封閉，使用時揭掉粘封的蓋膜或除去板蓋即可使用，漂洗方式采用浸洗。二.樣品的檢測分析 樣品的檢測分析一般包括以下基本步驟和方法1.樣品的制備根據檢測目的的不同，生物樣品在檢測前將分別進行不同的處理。常見樣品處理方法包括①核酸提取物用DNA或RNA抽提液處理各種生物樣品、生物體液或標本以提取樣品中的DNA或RNA等；②蛋白等生物成分提取物用組織細胞裂解液配合勻漿或超聲粉碎等處理使組織細胞裂解獲得真性蛋白溶液或生物樣品、生物體液或生物標本等的分離提取物；③人工合成產物運用各種人工合成技術獲得的藥物前體、先導化合物以及多肽合成儀、核酸合成儀等的合成產物等；④反轉錄合成cDNA；⑤PCR或RT-PCR擴增。2.樣品的標記①直接標記。運用公知的生物分子標記技術，分別用生物素、酶、熒光素、膠體金、同位素或稀土離子及其螯合劑等物質或其衍生物等標記分子作為指示劑直接標記樣品或生物標本；②采用間接標記。運用生物分子的相互作用，用標記分子的標記產物(如熒光抗體，生物素-HRP等標記物)標記樣品；③摻入標記，運用各種合成技術，如固相合成技術、PCR擴增等將標記分子或標記物摻入被標記分子中。3.加待檢樣品①將樣品或處理樣品經進液孔加入檢測板中，使之與各孔中的微珠表面已固相化的不同核酸分子或寡核苷酸分子等雜交或結合。被檢樣品中與互補或對應的生物分子被固相捕獲或特異結合，剩余的和未結合的部分經出液孔流出檢測板。②將寡核苷酸引物、dNTP，可摻入標記物和耐熱DNA聚合酶等與微量的核酸樣品加入微孔板中，進行至少一個循環的PCR或RT-PCR擴增反應。4.漂洗借助檢測板的微流路，用洗液流洗，蜂巢式檢測板可經進/出液孔流洗或通過視窗(22)浸洗，以去除檢測板中殘留的被檢樣品(未結合物或稱游離物)或標記物等。5.結果分析根據標記分子的不同，目測或用掃描儀等儀器觀察并記錄各孔反應的有無以及強弱(如生成產物顏色的深淺、膠體金沉積、熒光強度、放射強度等的強弱變化)。對照微珠的排列位置，借助計算機分析即可以確定該樣品中，被檢測物的組成以及各組分的含量，核酸序列，蛋白結合或識別的核酸序列。但是在標記物為蛋白酶時，操作中必須增加添加底物等操作步驟才能觀察檢測結果，其檢測結果為呈色反應或發光反應。
本發明在實施中，上述操作步驟依據固相探針、被檢測物、標記物和顯示結果等的不同，可有多種不同的組合方式。各種生化反應可在微孔板中進行，也可部分或全部在試管中進行。在微孔板中進行時，各微孔中鑲嵌的微珠表面分子涂層可以相同(蜂巢式微孔板)，用于檢測不同樣品中的相同成分；也可以不同，用于對同一樣品中的不同成分進行高通量的檢測分析。
下面結合實施例對本發明做進一步的說明。實施例I鑲嵌式高通量基因芯片在預防先天畸形和宮內感染中的應用。
風疹病毒、巨細胞病毒、單純皰疹病毒、柯薩基病毒、弓形體是引起宮內感染并導致胎兒畸形的主要病原體；乙肝、梅毒和艾滋病等是可以通過垂直傳播引起新生兒感染的傳染性疾病的病原體。對育齡和妊娠婦女開展上述病原體感染的檢測診斷是預防先天性畸形和新生兒感染的重要手段，在實施中的具體操作步驟如下1.微珠的制備①寡核苷酸探針微珠的制備將病原微生物特異核酸分子探針的PCR擴增引物通過固相合成分別連接在微珠的手臂分子上，獲得具有不同互補序列的寡核苷酸分子表面涂層。
②核酸探針微珠的制備將上述病原微生物的特異核酸分子探針分別連接在微珠的手臂分子上，獲得具有不同互補序列的分子表面涂層。
③PCR擴增以微珠手臂分子上固相合成的寡核苷酸分子為引物，病原微生物特異核酸分子探針為模板，通過PCR擴增反應，獲得具有不同互補序列的核酸分子探針表面涂層。2.檢測板的制備從進液孔端開始，將上述封閉處理的微珠依序嵌入微孔板的微孔中，加蓋封板。經進液孔加入預雜交液封閉非特異性結合位點。3.檢測樣品待檢者血清加入核酸抽提液，提取病原體核酸，以多對末端帶有標記分子的病原微生物特定序列的寡核苷酸分子為引物；①核酸提取物經進液孔加入檢測板中，與微珠表面固相化的寡核苷酸分子雜交；核酸提取物作為模板在檢測板中進行PCR擴增和摻入標記；②核酸提取物作為模板，在試管中進行PCR擴增和摻入標記，去除殘留的引物、dNTP等，經進液孔加入檢測板中，與微珠表面固相化的核酸分子雜交；流洗去除未結合的及非特異性結合的雜質等。4.觀察結果檢測板置熒光顯微鏡或掃描儀分析結果。陽性孔表示有感染，處于帶毒狀態，有傳染性，不宜妊娠。實施例II鑲嵌式高通量基因芯片在細胞差異表達研究中的應用。1.微珠的制備
①寡核苷酸探針微珠時制備用核酸固相合成儀，以mRNA起始密碼加其后面的3-12個隨機堿基N的方式，在微珠表面合成一套PCR擴增引物。通過這種合成方式，根據起始密碼后面所加的堿基長度，就可以將擴增的總mRNA分成4n個組別，如有8個堿基的寡核苷酸可有45個不同序列的寡核苷酸分子，并可獲得45種具有不同互補序列的寡核苷酸分子表面涂層的微珠。2.檢測板的制備從進液孔端開始，將上述4n種合成微珠微珠依序嵌入微孔板的微孔中，加蓋封板。經進液孔加入預雜交液封閉非特異性結合位點，就可獲得已知起始密碼端部分堿基序列的寡核苷酸基因芯片檢測板。3.檢測樣品待檢樣品加入核酸抽提液，提取mRNA。以oligo dT后面加1-8個隨機堿基N為引物，每一位上的隨機堿基N除oligo dT后的第一位不能有T外，均可分別為A，T，G，C四種不同堿基的同位排列，如以12個胸腺嘧啶核苷后面加2個隨機堿基的寡核苷酸分子為第二引物，oligo dT后面第1和2位的NN堿基排列為dT-AA，dT-AC，dT-AG，dT-ATdT-CA，dT-CC，dT-CG，dT-CTdT-GA，dT-GC，dT-GG，dT-GT由此可獲得12種不同排列的通配引物。用以此方式獲得的帶有末端熒光標記的oligodT引物對提取的mRNA進行反轉錄，然后再以所得到的cDNA為模板，以同樣的oligo dT和微珠表面的寡核苷酸分子為引物，加入檢測板中進行PCR擴增，為保證流洗去除殘留的引物、dNTP，未結合的及非特異性結合的雜質等。4.觀察分析結果檢測板置熒光顯微鏡或掃描儀檢測分析各孔熒光的有無和強弱，并與不同來源的樣品作比較，就可以發現差異表達的基因。5.克隆與測序對照差異表達基因在檢測板中的位置可以查知起始密碼端的核酸堿基序列，通過PCR擴增獲得差異表達的基因克隆，并可進一步測序。實施例III鑲嵌式高通量基因芯片在核酸-蛋白質相互作用研究中的應用。
用寡核苷酸篩選核酸結合蛋白、細胞生長因子、激素小肽等生物活性分子已經在基礎醫學、臨床診斷及藥物篩選等方面得到廣泛應用。運用本發明所述的基因芯片技術，以控孔玻璃或聚苯乙烯等固相合成專用基質為鑲嵌微珠，應用固相寡核苷酸合成技術很容易構建庫容足夠大，序列確定的單鏈寡核苷酸文庫，而每個微珠表面所結合的該種寡核苷酸分子的絕對數量遠大于光控標址并行合成技術。1.微珠的制備按需要在固相合成專用基質上合成特定序列的單鏈寡核苷酸分子，建立組合化學寡核苷酸微珠庫2.檢測板的制備
從進液孔端開始，將寡核苷酸微珠依序嵌入高密度微孔檢測板的微孔中，加蓋封板，經進液孔加入封閉液，獲得單鏈寡核苷酸文庫基因芯片檢測板。3.檢測樣品組織、細胞、細菌、病毒或噬菌體等或經裂解處理的蛋白抽提液，用直接標記技術或間接標記技術進行標記后，取適量經進液孔緩慢加入檢測板中，孵育，流洗以去除殘留的或非特異性結合的雜質。4.觀察結果掃描儀分析結果，①比較不同流洗條件以及競爭結合物或拮抗劑對各陽性孔結合強度及結合量的影響，并給出各孔寡核苷酸的堿基序列；②比較不同來源或經不同處理的組織、細胞或細菌等的蛋白質結合譜，分析差異譜帶與結構、功能、基因調控或與疾病等的關系。5.質譜分析對分析中感興趣的反應孔，取出相應的微珠置微量反應試管中，加入解吸附液，然后取適量進行質譜分析以測定蛋白質的分子量；或在原反應孔中加入胰蛋白酶(蛋白質水解酶)，室溫或37℃反應2-6小時或消化過夜，取適量點樣進行質譜分析，獲得蛋白指紋圖譜，通過計算機檢索以分析蛋白質的氨基酸順序。6.蛋白質磷酸化分析取適量酶水解液，加入適量體積的細菌堿性磷酸酶(溶于HEPES 20mmol/L，pH7.0，含NaCl 150mmol/L，0.1％Triton X-100，10％甘油)，30℃反應60分鐘，取適量進行質譜分析；或將復孔中的微珠取出置微量反應試管中，加入磷酸酶，待反應徹底后加入解吸附液，然后取適量進行質譜分析，對照未經磷酸酶處理的微珠分析結果，以測定和分析蛋白質有無磷酸化以及磷酸化的可能部位。7.蛋白質糖基化分析將微珠取出置微量反應試管中或在原孔中，加入PNGase試劑(溶于Tris-HCl緩沖液中，20mmol/L，pH7.2，含50mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA)適量，37℃反應60-120分鐘，取適量進行質譜或色譜分析，以測定和分析蛋白質有無糖基化及糖基化的程度。8.蛋白質等電點和分子量測定取適量細胞裂解液，根據步驟4的分析結果，與對應微珠反應，充分漂洗后，分裝于不同的微量試管中，分別加入專用等電聚焦和SDS-PAGE電泳樣品緩沖液，取出適量分別電泳，以測定等電點和分子量。9.基因克隆以該寡核苷酸分子為特異性引物，應用PCR技術進行上下游核酸片段的擴增，以克隆全長或長鏈核酸分子片段。
本發明把固相合成技術和吸附層析、毛細管電泳等分離技術與生物芯片等分析技術相結合，是一種全新概念的生物學分析檢測技術，集數種技術的優點于一身，具有信息量大、定量準確、靈敏度高、制造成本低，用途廣等突出優點，可廣泛用于生物學、醫學、藥物學，環境科學等領域。
權利要求
1.一種可檢測樣品中的核酸、蛋白與化學分子的鑲嵌式高通量基因芯片檢測技術及試劑盒的制備方法，該技術和試劑盒至少包括下述成分或步驟①一種檢測板由微孔板和微珠組成；微孔板由板體、板蓋、微孔和微流路等結構組成；微珠通過手臂分子上的活性基團連接不同或相同的核酸或寡核苷酸分子探針形成表面分子涂層，并按一定的順序鑲嵌在不同的微孔中；②樣品經過處理或不經處理直接由進液孔進入微孔板，流經微孔時與微珠表面連接的各種核酸分子相互作用，被檢分子與固相分子雜交或特異性結合；未結合的樣品成分經出液孔流出；③標記被檢樣品；④漂洗；⑤目測或用掃描儀等對各微孔中標記分子的有無、強弱或含量進行檢測和分析；⑥標記物為酶時，觀察結果前需加入底物。
2.根據權利要求1所述的微孔板由板體、板蓋、微孔和微流路等結構組成；板體和板蓋為任何可加工成型的、透光的、不透光的或反光的硬質或軟質材料，可加工成方形、長方形、園盤型或其它外觀形狀；在板體和板蓋上可分別具有微孔、微流路、驅動孔、定位孔和視窗等部分或全部結構；微孔按一定的格式排列，通過微流路與外界相通或形成閉合環路。
3.根據權利要求1所述的微珠是由任何可加工成型的材質，經加工而成的，大小均一、具有不同外觀形狀的多孔或實心體；微珠經表面處理可獲得帶有不同活性基團的手臂分子；手臂分子上的活性基團可進一步與不同的核酸或寡核苷酸分子探針等連接，獲得具有不同結合特性的表面分子涂層。
4.根據權利要求1所述的微流路由進液孔、出液孔、微槽或/和微管、密封圈、蠕動管等結構組成，可分別位于板體或板蓋上，也可全部位于板體或板蓋上；微流路通過微槽或/和微管與微孔相連，并通過進液孔和出液孔與外界相通；蠕動管位于進液孔和出液孔之間，將微流路連接成閉合環路；蠕動管可位于檢測板上也可以外置；蜂巢式微孔板可無微槽和微管，或也無進/出液孔等微流路結構；微流路經表面處理可獲得不同的惰性表面涂層。
5.根據權利要求1和權利要求3所述的表面分子涂層，是指通過手臂分子上的活性基團，分別連接的具有不同序列和長度的核酸分子或寡核苷酸分子探針，在微珠和微孔的固相基質表面形成的具有一定結合特性的表面分子；分子涂層的種類和制備方法至少包括①通過DNA合成儀直接在微珠的固相基質表面合成，獲得連接寡核苷酸分子探針的表面分子涂層；②通過手臂分子上的活性基團，連接各種不同序列的核苷酸或寡核苷酸分子探針；③以微珠表面的寡核苷酸分子探針為特異性引物，已知序列核酸為模板，在試管或微孔板中通過聚合酶鏈反應(PCR)延長寡核苷酸鏈并進一步擴增，獲得長鏈核酸分子探針表面分子涂層。
6.根據權利要求1和權利要求5所述的樣品和長鏈核酸分子探針，可用寡核苷酸引物，通過至少一個循環周期的PCR反應進行延長或擴增；延長或擴增反應可在微孔板中也可在試管中進行，引物均可溶于液相中，或通過手臂分子連接在微珠等固相基質表面；PCP反應循環周期包括a)熱變性；b)退火，引物與模板或樣品中的靶核苷酸雜交；c)用DNA聚合酶延長靶核苷酸鏈序列。
7.根據權利要求1所述的標記是指，用熒光染料、酶類、生物素、半抗原、膠體金、同位素、稀土離子及其螯合劑等標記分子或其衍生物直接標記樣品；或用能與樣品中被檢物特異性結合的標記物標記樣品；標記反應可在試管中進行，也可以在微孔板中進行。
8.根據權利要求1所述的檢測方法，可采用下述方法進行定量分析在同一塊微孔板上連接相同序列核酸分子的微孔或鑲嵌微珠的微孔數量可有1個或1個以上的復孔；當樣品逐孔流經各微孔及其復孔時，對應的被檢測物被不斷結合，并不斷地從標本液中去除，因此，各微孔及其復孔的結合量，因前后排列順序的不同逐漸減少；根據各微孔與復孔反應的有無與強弱變化，即可進行定量分析；在進行定量分析時，可按此方法設定標準參照物，借助計算機分析繪出標準參照物濃度-反應孔數量及其強弱變化曲線，對照標準曲線結合標本體積，獲得定量分析結果。
9.根據權利要求1所述的試劑盒，至少裝有一塊檢測板，微孔中至少鑲嵌一粒微珠，微珠表面分別連接某種特定序列的核酸分子，并與下述成分分別或共同組成不同的試劑盒①至少有一管為樣品處理液；②至少有一管為dNTP、引物和用于PCR擴增的熱穩定的DNA聚合酶；③至少有一管為dNTP和反轉錄酶；④至少有一管為含標記分子或標記物的標記試劑；⑤在標記物為酶類時，至少有一種顯色底物或發光底物；⑥至少有一管為洗滌液或其濃縮液；⑦至少有一管為蛋白質濃度檢測分析試劑；⑧至少有一管為核酸內切酶或蛋白水解酶；⑨至少有一管為電泳樣品緩沖液；⑩至少有一管為蛋白質糖基化或蛋白質磷酸化分析試劑；
10.根據權利要求1和權利要求9所述的檢測方法和試劑盒，可以用試劑盒中的試劑通過下述不同的方法對微孔板各不同孔所結合的樣品成分分別做基因克隆、質譜分析、序列測定、蛋白質磷酸化、糖基化或電泳等進一步分析前的處理(1)直接在感興趣的微孔中加入PCR試劑或核酸內切酶、蛋白水解酶、磷酸酶或電泳樣品緩沖液、蛋白質糖基化等分析試劑，對結合物在原位做進一步分析前的樣品處理；(2)將微孔中的微珠取出，在微量反應器中加入PCR試劑或核酸內切酶、蛋白水解酶、磷酸酶或電泳樣品緩沖液或蛋白質糖基化分析等試劑做進一步分析前的樣品處理；(3)將新鮮樣品分別與感興趣微孔的復本微珠共育，以同樣的條件重復微孔板的操作步驟，將樣品中感興趣的物質成分吸附在微珠上，充分漂洗去除未結合的樣品混合物，加入PCR試劑、核酸內切酶或蛋白水解酶、磷酸酶或電泳樣品緩沖液或蛋白質糖基化分析等試劑，對結合物做進一步分析前的樣品處理。
全文摘要
本發明公開了一種鑲嵌式高通量基因芯片檢測技術及試劑盒的制備方法，該技術靈敏快速、信息量大，制造簡便、成本低，可對樣品中多種不同的核酸、蛋白和化學分子等同時進行檢測分析。主要特征在于將連接不同序列核酸分子的微珠，分別鑲嵌在檢測板的不同微孔中，微孔間有微管相連，并同進/出液口形成微流路與外界相通，樣品經微流路可與微珠表面的核酸分子雜交或結合。檢測結果可用目測或儀器記錄分析。本發明可廣泛地用于環境檢測、醫藥研究、疾病診斷基因組·/蛋白質組學和分子文庫等領域的研究與開發。
文檔編號C12Q1/68GK1464071SQ0212377
公開日2003年12月31日 申請日期2002年6月27日 優先權日2002年6月27日
發明者趙翀 申請人:趙翀