專利名稱：Hla高分辨基因測序試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學領域，涉及用于人類白細胞抗原(Human Leucocyte Antigen, HLA)_A，B, DRBl基因的擴增和分型方法，以及所述方法中使用的特異性引物。
背景技術：
HLA是調控人體特異性免疫應答和決定疾病易感性個體差異的主要基因系統，其 在抗原識別、抗原遞呈、免疫應答與調控、破壞外來抗原靶細胞等方面發揮重要的作用，是 引起免疫排斥反應的主要物質基礎。移植物細胞表面HLA-I類和HLA-II類抗原都是強移植 抗原，體液免疫和細胞免疫都參與了對移植物的排斥反應，無論是異基因造血干細胞移植， 還是器官移植，供受體之間HLA相配程度是決定移植成功的關鍵。目前國際標準的HLA分型技術有PCR-SSP(序列特異引物聚合酶鏈式反應)， PCR-SSO (聚合酶鏈式反應寡核苷酸探針雜交)和PCR-SBT (聚合酶鏈式反應產物直接測序 分型)。PCR-SSO(sequence specific oligonucleotide) ik 禾爾 PCR-ASO(allele specific oligonuceotide)，用以同位素或非放射性標記的探針與PCR擴增的目標片斷產 物雜交，根據陽性斑點判斷個體基因型。由于HLA等位基因非常多，就需要很多的探針對每 個DNA樣品要進行多次雜交(甚至十幾次)才能完成定型分析操作也十分繁瑣。于是在此 基礎上又發展起來一種反向雜交法(reverse hybridization) 0將各種不同的探針固定于 同一張膜上，再將PCR產物標記，以PCR產物(待檢測基因DNA)反過來與探針雜交。這樣一 次雜交即可完成多個等位基因分析。此方法具有靈敏度、特異性強、需樣本量少等優點，但 不同探針的雜交條件的須嚴格統一(如溫度，離子強度)，易出現誤差；不能檢測新等位基 因，試劑盒需不斷升級；對某些雜合子分辨率也不好。很多HLA基因型含有相同的多態性， 而僅僅由于排列方式不同，因此分辨率不及SSP和SBT。此方法適宜大量和高純度樣本，雜 交條帶將作為書面原始記錄長期保存(三種效果比較)。PCR-SSP :PCR/SSP方法用乃設計出一整套等位基因組特異性引物(sequence specific primer, SSP)，借助PCR技術獲得HLA型別特異的擴增產物，可通過電泳直接分析 帶型決定HLA型別，從而大大簡化了實驗步驟。優點是簡單易行，分辨率可從低到高，成本 低。缺點是不易自動化；不能檢測新的等位基因，試劑盒需不斷升級。此方法適宜零散和 純度低樣本，重復實驗時要重提DNA和必須使用紫外凝膠成象儀保留原始資料，增加實驗 成本(三種效果比較)。PCR-SSP和PCR-SSO均需大量試劑(引物)，且不能識別非經典的 HLA基因和假基因(綠)。針對HLA外顯子和內含子序列精心設計引物可避免這些問題。PCR-SBT 以PCR擴增所要分析的基因片斷，然后對DNA序列進行分析，可以直接得 到基因型。分辨率高，可大規模進行，精確度高，能直接發現新的等位基因。因此，應用SBT 技術進行HLA高分辨基因分型是目前國際上公認的HLA基因分型金標準。
目前進口的HLA-SBT試劑只對HLA外顯子(Exon 2，3)進行測序，當幾個等位基因 核苷酸區別在這些區域之外時，就無法進行區分，從而造成實驗結果中有許多無法明確的 組合(模棱兩可的結果)。另外，SBT的試劑全部是從國外進口，試劑成本高。因此，需要進 一步提高HLA測序的分辨率和精確性，同時降低測序試劑的成本。
發明內容
本發明目的是提供一種人類白細胞抗原(Human Leucocyte Antigen, HLA)基因的 分型方法，包括以下步驟(1)按照常規技術提取待測基因組DNA，使用PCR擴增引物擴增所要分析的目的基 因片段；(2)使用測序引物對步驟⑴所得PCR產物進行擴增，擴增各外顯子，然后對擴增 出的各外顯子進行測序，并將測序結果與數據庫中的標準序列進行比較，從而確定基因分 型結果；其中，步驟(1)中所述目的基因片段包括HLA-A的2，3，4外顯子，HLA-B的2，3，4 外顯子和HLA-DRB1位點2外顯子；相應的PCR擴增引物對包括HLA_A位點擴增引物，HLA-B位點擴增引物和 HLA-DRB1位點擴增引物；其中，所述HLA-A位點擴增引物包括正義引物，SEQID No. 1 :CCATTGGGTGTCGGGTTTC(-105 -87)；反義引物，SEQID No. 2 :CAGCAATGATGCCCACGATG(1973 1992)；所述HLA-B位點擴增引物包括正義引物1，SEQ ID No. 3 :CCCTGAGTTTCACTTCTTCTCCCA(-183 -160)；正義引物2，SEQ ID No. 4 :CCACGAGTTTCACTTCTTCTCCCA(-183 -160)；反義引物，SEQID No. 5 :CCAGCAACAATGCCCACGAT(1962 1981)；上述HLA-B位點擴增引物一起組合使用；
所述HLA-DRB1位點擴增引物包括Gl, SEQ ID No. 6 :TGTAAAACGACGGCCAGTTCTTGTGGCAGCTTAAGTT(8101 8119)；G2, SEQ ID No. 7 :TGTAAAACGACGGCCAGTTCCTGTGGCAGCCTAAGAGG(8101 8120)；G3, SEQ ID No. 8 :TGTAAAACGACGGCCAGTTCTTGGAGTACTCTACGT(8101 8118)；G4, SEQ ID No. 9 :TGTAAAACGACGGCCAGTTCTTGGAGCAGGTTAAAC(8101 8118)；G7, SEQ ID No. 10 :GTAAAACGACGGCCAGTTCCTGTGGCAGGGTAAGTATA(8101 8121)；G8, SEQ ID No. 11 :TGTAAAACGACGGCCAGTTCTTGGAGTACTCTACGG(8101 8118)；G9, SEQ ID No. 12 :TGTAATACGACGGCCAGTTCTTGAAGCAGGATAAGTT(8101 8119)；G10, SEQ ID No. 13 :TGTAATACGACGGCCAGTTCTTGGAGGAGGTTAAGTT(8101 8119)；R, SEQ ID No. 14 :CAGGAAACAGCTATGACCGCTCACCTCGCCGCTGCAC(8352 8370)；R * 09, SEQ ID No. 15 :CAGGAAACAGCTATGACCGCTTACCTCGCCTCTGCAC (8352 8370)；上述HLA-DRB1位點擴增引物一起組合使用，并且SEQ ID No. 6 13為正義引物， SEQ ID No. 14 15為反義引物；
步驟(2)中，相應的測序引物包括=HLA-A位點的第2、3、4外顯子測序引物，HLA-B 位點的第2、3、4外顯子測序引物和HLA-DRBl位點的第2外顯子測序引物；所述HLA-A位點的第2外顯子測序引物包括A2F, SEQ ID No. 16 :CGGGGAGAAGCAASGG (107 122)；A2R, SEQ ID No. 17 :CGGACCCGGAGACTGTG(539 555)；所述HLA-A位點的第3外顯子測序引物包括A3F, SEQ ID No. 18 :GGTTTCATTTTCAGTTTAGGC (622 642)；A3R, SEQ ID No. 19 :TTGTCTCCCCTCCTTGTGG (1048 1066)；所述HLA-A位點的第4外顯子測序引物包括A4F, SEQ ID No. 20 :GGTGTCCTGTCCATTCTCAAG (1475 1495)；A4R, SEQ ID No. 21 :CAGAGAGGCTCCTGCT (1884 1899)；所述HLA-B位點的第2外顯子測序引物包括B2F, SEQ ID No. 22 :CCCAGGCTCCCACTCCAT (197 214)；B2R, SEQ ID No. 23 :GGGGAGTCGTGACCTGC(494 510)；所述HLA-B位點的第3外顯子測序引物包括B3F, SEQ ID No. 24 :GGCCAGGGTCTCACAC(711 726)；B3R, SEQ ID No. 25 :GGCGACATTCTAGCGC (1078 1093)；所述HLA-B位點的第4外顯子測序引物包括B4F, SEQ ID No. 26 :AGATGCAAAGCGCCTGAA (1528 1545)；B4R, SEQ ID No. 27 :GGCTCCTGCTTTCCCTGA(1875 1892)；所述HLA-DRBl位點的第2外顯子測序引物包括M13F, SEQ ID No. 28 :TGTAAAACGACGGCCAGT ；M13R, SEQ ID No. 29 :CAGGAAACAGCTATGACCCodon 86，SEQ ID No. 30 :CTGCACTGTGAAGCTCTCCA。上述技術方案中，所述引物方向均從5’到3’ ；HLA-A設計模板為A女01010101, HLA-B設計模板為B * 070201 ,HLA-DRBl設計模板為DRBl * 03010101，所有等位基因序列 均參照歐洲 IMGT/HLA 專業網站數據庫http://www. ebi. ac. uk/imgt/hla/index. html。同時，本發明還提供了一種HLA高分辨基因測序試劑盒，含有上述PCR擴增引物和 測序引物，所述PCR擴增引物分別具有SEQ ID No. 1至SEQ ID No. 15所述的堿基序列，所 述測序引物分別具有SEQ ID No. 16至SEQ ID No. 30所述的堿基序列。上述技術方案中，所述HLA高分辨基因測序試劑盒還包括緩沖液(buffer)，鎂離 子(Mg2+)，dNTP和Taq酶；所述Taq酶優選為QIAGENHotStarTaq熱啟動酶。優選的技術方案中，步驟(1)中所述PCR擴增反應條件為1. 95°C, 15min ；2. 94°C，0. 5min — 64°C，0. 5min — 72°C，2. 5min (重復 15 個循環)；3. 94°C，0. 5min — 60°C，0. 5min — 72°C，2. 5min (重復 15 個循環)；4. 94°C，0. 5min — 58°C，0. 5min — 72V, 2. 5min (重復 6 個循環)；5. 72°C,7min ；6.4°C 保持。
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本發明的基本原理是HLA的多態性復雜，HLA-A等位基因965個，HLA-B等位基因 1543個，HLA-DRB1等位基因762個，因此，要在有限的保守區的設計能擴增HLA_A，B位點的 2，3，4外顯子和HLA-DRB1位點2外顯子的PCR引物，并分別針對不同的HLA-A，B, DRB1位 點的外顯子再設計測序引物。由于上述技術方案運用，本發明與現有技術相比具有下列優點1.由于本發明HLA基因測序試劑盒以及測試條件的優化組合，有效地擴增HLA-A， B位點的2，3，4外顯子和HLA-DRB1位點2外顯子，并對相應外顯子進行測序，因此在進一 步進行分型時，能夠避免當某幾個等位基因核苷酸位于擴增區域之外時無法進行有效分型 的問題，提高了對HLA基因分型的分辨率和精確性。2.由于本發明HLA基因測序試劑盒中主要試劑自行配置并優化，大大降低的試劑 成本。3.現有的國外進口試劑只對HLA第2、3外顯子進行檢測，分型結果組合多；本發 明對HLA第2、3、4外顯子進行測序，分型結果組合少。4.現有國外進口試劑是針對美國高加索和美國黑人的常見HLA等位基因設計的 引物序列，可能會造成中國人群的HLA等位基因發生漏檢，而本發明在測試過程中檢測對 象均為我國人群，經過驗證證明使用本發明所述試劑盒進行檢驗的結果可靠，能更好地彌 補上述不足，得到正確結果。
圖1是實施例一-中HLA-A，B結構圖上PCR擴增引物，測序引物位置示意圖
圖2是實施例一-中HLA-DRB1結構圖上PCR擴增引物，測序引物位置示意圖
圖3是實施例一-中HLA-A基因第2外顯子測序圖4是實施例一-中HLA-A基因第3外顯子測序圖5是實施例一-中HLA-A基因第4外顯子測序圖6是實施例一-中HLA-B基因第2外顯子測序圖7是實施例一-中HLA-B基因第3外顯子測序圖8是實施例一-中HLA-B基因第4外顯子測序圖9是實施例一-中HLA-DRB1基因第2外顯子測序圖10是實施例—二試驗組中HLA-A基因第2外顯子測序圖11是實施例—二試驗組中HLA-A基因第3外顯子測序圖12是實施例—二試驗組中HLA-A基因第4外顯子測序圖13是實施例—二試驗組中HLA-B基因第2外顯子測序圖14是實施例—二試驗組中HLA-B基因第3外顯子測序圖15是實施例—二試驗組中HLA-B基因第4外顯子測序圖16是實施例—二試驗組中HLA-DRB1基因第2外顯子測序圖17是實施例—二對照組中HLA-A基因第2外顯子測序圖18是實施例—二對照組中HLA-A基因第3外顯子測序圖19是實施例—二對照組中HLA-A基因第4外顯子測序圖20是實施例—二對照組中HLA-B基因第2外顯子測序圖21是實施例二對照組中HLA-B基因第3外顯子測序圖；圖22是實施例二對照組中HLA-B基因第4外顯子測序圖；圖23是實施例二對照組中HLA-DRB1基因第2外顯子測序圖；圖24是實施例一所得HLA-A PCR產物電泳圖；圖25是實施例一所得HLA-B PCR產物電泳圖；圖26是實施例一所得HLA-DRB1 PCR產物電泳圖。
具體實施例方式下面結合附圖及實施例對本發明作進一步描述實施例一采用核苷酸序列表所述PCR擴增引物和測序引物(所述引物的位置如圖1、2所 示)，對人血樣進行HLA-A，B, DRB1位點的高分辨率基因分型，具體步驟如下(1)提取基因組DNA按照Promaga公司基因組DNA抽提試劑盒操作說明書進行抽提。(2)PCR 擴增分別使用不同的引物對步驟(1)中提取的基因組DNA。使用HLA-A位點擴增引物 (SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2)進行HLA-A分型的擴增；使用HLA-B位點擴增引物(SEQ ID No. 3，SEQ ID No. 4，SEQ ID No. 5)進行HLA-B分型的擴增；使用HLA-DRB1位點擴增引物 (SEQ ID No. 6 SEQ ID No. 15)進行HLA-DRB1分型的擴增；上述擴增過程和擴增反應體 系均如下所述PCR擴增反應條件為1. 95°C, 15min ；2. 94°C，0. 5min — 64°C，0. 5min — 72°C，2. 5min (重復 15 個循環)；3. 94°C，0. 5min — 60°C，0. 5min — 72°C，2. 5min (重復 15 個循環)；4.94°C，0.5min —58°C，0.5min —72°C，2.5min (重復 6 個循環)；5. 72°C,7min ；6.4°C 保持；所述PCR反應體系為50 iU，其組成如下表所示， 其中，IOX擴增緩沖液、5 X Q buffer、Mg2+(25mM)、Taq DNA 聚合酶購自 Qiagen 公 司，dNTPs (IOmM)、引物購自上海生工。擴增所得PCR產物的電泳圖如圖24、25、26所示，結果表明得到目的基因片段。按照常規技術對PCR擴增產物進行純化。(3)使用測序引物進行測序擴增。分別使用不同的引物對步驟(2)中純化的PCR產物進行測序擴增，使用HLA-A位 點(第2、3、4外顯子)測序引物(SEQ ID No. 16 SEQ ID No. 21)分別擴增HLA-A的第2、 3、4外顯子；使用HLA-B位點(第2、3、4外顯子)測序引物(SEQ ID No. 22 SEQ ID No. 27) 分別擴增HLA-B的第2、3、4外顯子；使用HLA-DRBl位點(第2外顯子)測序引物(SEQ ID No. 28 SEQ ID No. 30)擴增HLA-DRBl的第2外顯子；上述測序擴增過程和測序擴增反應 體系均如下所述測序擴增反應條件為94°C，0.5min — 50°C,0. 5min — 60°C，2. 5min (重復 25個循環)所述測序擴增反應體系為10μ 1，其組成如下表所示， 其中，BigdyeV3.1 購自 ABI 公司。按照常規方法純化測序擴增產物。(4)進行外顯子測序。使用ABI公司3730測序儀對經過純化的測序擴增產物進行測序，測序結果如圖3 至圖9。實施例二分別采用美國Abbott公司的HLA測序試劑盒，實施例一中的HLA測序試劑盒及方 法對同一血樣進行HLA-A，B, DRBl位點的高分辨率基因分型。分別得到HLA-A(第2、3、4外顯子)測序圖，HLA-B(第2、3、4外顯子)測序圖，HLA-DRBl第2外顯子測序圖。采用實施例一中的HLA測序試劑盒及方法得到的測序圖(試驗組)為圖10到圖 16 ；采用美國Abbott公司的HLA測序試劑盒得到的測序圖(對照組)為圖17到圖23。對比HLA-A基因第2、3、4外顯子測序圖可知 對照組HLA-A Exon2正反向測序峰圖的信號強度:A2F A (232) G (227) C (279) T(345) ；A2R A(155)G(361)C (276)T (217)；實驗組HLA-A Exon2正反向測序峰圖的信號強度A2F A (461) G (705) C (545) T(275) ；A2R A(51)G(133)C(105)T(91)；對照組HLA-A Εχοη3正反向測序峰圖的信號強度A3F A(758)G(1336) C(1058) T(827 ；A3R A(440)G(903)C (696)T (502)；實驗組HLA-A Εχ0η3正反向測序峰圖的信號強度A3F A(495)G (918) C(663) T(514) ；A3R A(195)G(430)C (358)T (258)；對照組HLA-A Εχοη4正反向測序峰圖的信號強度A4F A(774)G(1142) C(674) T(583) ；A4R A(712)G(1233)C (870)T (962)；實驗組HLA-A Exon4正反向測序峰圖的信號強度:A4F A (506) G (716) C (469) T(421) ；A4R A(325)G(551)C(390)T (405)；從以上測序圖分析可以得出，實驗組HLA-A位點信號質量與對照組基本一致，實 驗組的信號強度整體比對照組稍弱，但兩組數據通過軟件分析所得基因分型結果一致。對比HLA-B基因第2、3、4外顯子測序圖可知對照組HLA-B Εχοη2正反向測序峰圖的信號強度B2F A(725)G(1210) C(955) T(795) ；B2R A(451)G(1100)C (957)T (1001)；實驗組HLA-B Exon2正反向測序峰圖的信號強度B2F A(699)G(1056)C(1002) T(839) ；B2R A(343)G(839)C (787)T (923)；對照組HLA-B Εχ0η3正反向測序峰圖的信號強度B3F A(410)G(715)C(568) T(419) ；B3R A(166)G(331)C (247)T (222)；實驗組HLA-B Εχοη3正反向測序峰圖的信號強度B3F A(726)G(1076) C(896) T(717) ；B3R A(319)G(608)C (527)T (437)；對照組HLA-B Εχοη4正反向測序峰圖的信號強度B4F A(720)G(1086) C(848) T(870) ；B4R A(208)G(380)C (243)T (323)；實驗組HLA-B Εχ0η4正反向測序峰圖的信號強度B4F A(310)G(433) C(364) T (417) ；B4R A (203) G (364) C (236) T (340)；從以上測序圖分析可以得出，實驗組HLA-B3R信號強度比對照組強一倍，其余實 驗組HLA-B位點信號質量和對照組基本相近，并且兩組數據通過軟件分析所得基因分型結
果完全一致。對比HLA-DRBl基因第2外顯子測序圖可知對照組HLA-DRBlExon2正反向測序峰圖的信號強度DRB2F A(403)G(574) C(478) T(627) ；DRB2R A(353)G(539)C (534)T (723)；實驗組HLA-DRBl Exon2正反向測序峰圖的信號強度DRB2F A(271)G(575)C(258) T(302) ；DRB2R A(286)G(463)C (338)T (337)；
從以上測序圖分析可以得出，實驗組HLA-DRBl位點信號質量與對照組基本一致， 實驗組的信號強度整體比對照組稍弱，但兩組數據通過軟件分析所得基因分型結果一致。實施例三，美國UCLA大學的國際質控和中華骨髓庫質控的實驗結果中華骨髓庫HLA質控樣本基本上是選擇中國人常見的等位基因組合，而用本發明 試劑也未發現漏檢現象，與對照試劑結果完全一致。美國UCLA大學的HLA質控樣本包括 了世界范圍內各人種的HLA等位基因組合，特別是中國人群十分罕見的等位基因比如A * 0260，B女1535等，其結果也與對照試劑相符合。
權利要求
一種人類白細胞抗原基因的分型方法，包括以下步驟(1)按照常規技術提取待測基因組DNA，使用PCR擴增引物擴增所要分析的目的基因片段；(2)使用測序引物對步驟(1)所得PCR產物進行擴增，擴增各外顯子，然后對擴增出的各外顯子進行測序，并將測序結果與數據庫中的標準序列進行比較，從而確定基因分型結果；其特征在于，其中，步驟(1)中所述目的基因片段包括HLA A的2，3，4外顯子，HLA B的2，3，4外顯子和HLA DRB1位點2外顯子；相應的PCR擴增引物對包括HLA A位點擴增引物，HLA B位點擴增引物和HLA DRB1位點擴增引物；其中，所述HLA A位點擴增引物包括正義引物，SEQ ID No.1CCATTGGGTGTCGGGTTTC；反義引物，SEQ ID No.2CAGCAATGATGCCCACGATG；所述HLA B位點擴增引物包括正義引物1，SEQ ID No.3CCCTGAGTTTCACTTCTTCTCCCA；正義引物2，SEQ ID No.4CCACGAGTTTCACTTCTTCTCCCA；反義引物，SEQ ID No.5CCAGCAACAATGCCCACGAT；所述HLA DRB1位點擴增引物包括G1，SEQ ID No.6TGTAAAACGACGGCCAGTTCTTGTGGCAGCTTAAGTT；G2，SEQ ID No.7TGTAAAACGACGGCCAGTTCCTGTGGCAGCCTAAGAGG；G3，SEQ ID No.8TGTAAAACGACGGCCAGTTCTTGGAGTACTCTACGT；G4，SEQ ID No.9TGTAAAACGACGGCCAGTTCTTGGAGCAGGTTAAAC；G7，SEQ ID No.10GTAAAACGACGGCCAGTTCCTGTGGCAGGGTAAGTATA；G8，SEQ ID No.11TGTAAAACGACGGCCAGTTCTTGGAGTACTCTACGG；G9，SEQ ID No.12TGTAATACGACGGCCAGTTCTTGAAGCAGGATAAGTT；G10，SEQ ID No.13TGTAATACGACGGCCAGTTCTTGGAGGAGGTTAAGTT；R，SEQ ID No.14CAGGAAACAGCTATGACCGCTCACCTCGCCGCTGCAC；R＊09，SEQ ID No.15CAGGAAACAGCTATGACCGCTTACCTCGCCTCTGCAC；步驟(2)中，相應的測序引物包括HLA A位點的第2、3、4外顯子測序引物，HLA B位點的第2、3、4外顯子測序引物和HLA DRB1位點的第2外顯子測序引物；所述HLA A位點的第2外顯子測序引物包括A2F，SEQ ID No.16CGGGGAGAAGCAASGG；A2R，SEQ ID No.17CGGACCCGGAGACTGTG；所述HLA A位點的第3外顯子測序引物包括A3F，SEQ ID No.18GGTTTCATTTTCAGTTTAGGC；A3R，SEQ ID No.19TTGTCTCCCCTCCTTGTGG；所述HLA A位點的第4外顯子測序引物包括A4F，SEQ ID No.20GGTGTCCTGTCCATTCTCAAG；A4R，SEQ ID No.21CAGAGAGGCTCCTGCT；所述HLA B位點的第2外顯子測序引物包括B2F，SEQ ID No.22CCCAGGCTCCCACTCCAT；B2R，SEQ ID No.23GGGGAGTCGTGACCTGC；所述HLA B位點的第3外顯子測序引物包括B3F，SEQ ID No.24GGCCAGGGTCTCACAC；B3R，SEQ ID No.25GGCGACATTCTAGCGC；所述HLA B位點的第4外顯子測序引物包括B4F，SEQ ID No.26AGATGCAAAGCGCCTGAA；B4R，SEQ ID No.27GGCTCCTGCTTTCCCTGA；所述HLA DRB1位點的第2外顯子測序引物包括M13F，SEQ ID No.28TGTAAAACGACGGCCAGT；M13R，SEQ ID No.29CAGGAAACAGCTATGACC；Codon 86，SEQ ID No.30CTGCACTGTGAAGCTCTCCA。
2. —種HLA高分辨基因測序試劑盒，含有PCR擴增引物和測序引物，其特征在于，所述 PCR擴增引物分別具有SEQ ID No. 1至SEQ ID No. 15所述的堿基序列，所述測序引物分別 具有SEQ ID No. 16至SEQ ID No. 30所述的堿基序列。
全文摘要
本發明公開了一種人類白細胞抗原基因的分型方法，包括以下步驟(1)按照常規技術提取待測基因組DNA，使用PCR擴增引物擴增所要分析的目的基因片段HLA-A的2，3，4外顯子，HLA-B的2，3，4外顯子和HLA-DRB1位點2外顯子；(2)使用測序引物對步驟(1)所得PCR產物進行擴增，擴增各外顯子，然后對擴增出的各外顯子進行測序，并將測序結果與數據庫中的標準序列進行比較，從而確定基因分型結果；由于本發明HLA基因測序試劑盒以及測試條件的優化組合，有效地擴增HLA-A，B位點的2，3，4外顯子和HLA-DRB1位點2外顯子，并對相應外顯子進行測序，因此在進一步進行分型時，能夠避免當某幾個等位基因核苷酸位于擴增區域之外時無法進行有效分型的問題，提高了對HLA基因分型的分辨率和精確性。
文檔編號C12Q1/68GK101892317SQ20101023960
公開日2010年11月24日 申請日期2010年7月29日 優先權日2010年7月29日
發明者邱橋成 申請人:蘇州大學;蘇州大學附屬第一醫院