專利名稱：一種黑曲霉及用其酵解人參皂甙制備稀有低極性人參皂甙的方法
技術領域：
本發明涉及由人參皂甙大量制備稀有低極性人參皂甙及其甙元的方法，特別提供了一種人工馴化的YLY菌(黑曲霉Aspergillus niger v.Tiegh)，及用其發酵和制備稀有人參皂甙的方法。
本發明還提供了一種用上述黑曲霉酵解人參皂甙制備稀有低極性人參皂甙的方法。
本發明黑曲霉酵解人參皂甙制備稀有低極性人參皂甙的方法中，黑曲霉培養條件粗曠，營養要求不嚴格；可生長于任何培養基中如選擇性強的查氏瓊脂、查氏酵母膏瓊脂、麥芽汁瓊脂、高氏培養基或普通、非選擇性的各種培養基。優選查氏瓊脂、查氏酵母膏瓊脂、麥芽汁瓊脂、高氏培養基。
本發明黑曲霉酵解人參皂甙制備稀有低極性人參皂甙的方法中，培養基中人參皂甙所占的比例為0.1～30％，酵解溫度25-45℃，酵解時間2小時～7天。
本發明黑曲霉酵解人參皂甙酵制備稀有低極性人參皂甙的方法中，可以通過酵解天然人參二醇型皂甙，得到稀有人參皂甙CK；通過酵解人參皂甙Rb2，得到稀有人參皂甙CY；通過酵解人參皂甙Rc，得到稀有人參皂甙Mc；通過酵解人參皂甙Re，得到稀有人參皂甙Rg1；通過酵解人參皂甙Rg3，得到稀有人參皂甙Rh2；通過酵解人參皂甙Rg2、Rf，得到稀有人參皂甙Rh1；通過酵解人參總皂甙，得到人參皂甙甙元原人參二醇和原人參三醇；通過酵解人參皂甙Rk1、Rg5，得到人參皂甙Rk2、Rh3，及甙元3β-O-達瑪烷-20(22)，24-二烯、3β-O-達瑪烷-20(21)，24-二烯。
實施以上操作過程，本發明所提供的黑曲霉菌還可用于酵解其它糖甙類化合物如三七皂甙、絞股藍皂甙、芍藥甙、柴胡皂甙、黃芩甙、黃芪甙、去羥梔子甙等，制備相應的水解產物。
本發明所用黑曲霉菌是將各種來源的黑曲霉菌轉入含有人參皂甙的培養基中，經傳代培養、馴化、篩選得到的能夠酵解產生稀有人參皂甙及其甙元的菌株，經中國科學院微生物研究所鑒定為黑曲霉Aspergillus niger v.Tiegh.。該菌為好氧型，孢子生殖的革蘭氏陽性桿菌；菌絲體為白色，全部落于培養基內部。鏡檢結果表明，該菌分生孢子梗發生于基質，在CA上發生于表面菌絲，分子孢子初為球形；孢梗莖120-300×9-10.8μm，壁平滑；頂囊球形，近球形，36-72μm，全部表面可育；產孢結構雙層，梗莖14.4-21.6×5.4-7.2μm，瓶梗安瓿形，8.1-10.8×2.5-3.0μm；分生孢子球形，直徑3.6×6.4μm，表面明顯棘刺狀。在查氏瓊脂(CA)上，25℃，7天，菌落直徑25-27mm，較厚，表面輻射狀溝紋較多；質地絨狀兼稍絮狀；分生孢子結構少量，黃橄欖色；菌絲體白色；無滲出液和可溶性色素；反面黃白色。在查氏酵母膏瓊脂(CYA)上，25℃，7天，菌落直徑70-72mm，較厚，表面具有較多輻射狀溝紋；質地絨狀；分生孢子結構大量，褐黑色；菌絲體全部于培養基內部；無滲出液和可溶性色素，反面淺黃。在麥芽瓊脂(WA)上，25℃，7天，菌落直徑70-72mm，較厚，表面具有大量輻射狀皺紋；質地絨狀；分生孢子結構大量，褐黑色；菌絲體全部于培養基內部；無滲出液和可溶性色素；反面褐色。
本發明為人參二醇類皂甙的發酵水解、制備低極性人參皂甙提供了一種來源方便、價格低廉的黑曲霉菌，用該菌株制備低極性人參皂甙工藝便捷、成本低、回收率高。使用本方法制備的低極性人參皂甙含量≥95％，甙元收率≥80％。
實施例1從潮濕的軟木上分離得到暗黑色的菌苔，無菌取下；在查氏平板上涂板，分出單菌落。將菌落接種到查氏液體培養基中，傳代三次后，轉入含有人參皂甙的培養基中，傳代、馴化，經36代培養，得到能夠酵解人參皂甙、產生稀有人參皂甙及甙元的菌株---YLY菌，送中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為CGMCC 0751，保藏日為2002年6月14日。
實施例2將YLY菌接種于加入30克人參皂甙Rb1的無糖查氏培養基(1000ml)中培養，37℃下培養24小時，培養混合液經高溫滅活。用水飽和的正丁醇萃取混合液三次，蒸干正丁醇相后，經正相制備色譜(流動相為氯仿/甲醇的混合液)分離純化；遠紅外干燥，得到人參皂甙CK 10克，經檢驗人參皂甙CK含量≥95％。
實施例3YLY菌接種于加入30克人參皂甙Rd的無糖查氏培養基(1000ml)中培養，37℃下培養24小時，培養混合液經高溫滅活。用水飽和的正丁醇萃取混合液三次，蒸干正丁醇相后，經正相制備色譜(流動相為氯仿/甲醇的混合液)分離純化；遠紅外干燥，得到純品人參皂甙CK 15克，經檢驗人參皂甙CK含量≥95％。
實施例4YLY菌接種于加入30克人參皂甙Rb2的無糖查氏培養基(1000ml)中培養，37℃下培養24小時，培養混合液經高溫滅活，用水飽和的正丁醇萃取混合液三次，蒸干正丁醇相后，經正相制備色譜(流動相為氯仿甲醇的混合液)分離純化；遠紅外干燥，得到人參皂甙CY 18克，經檢驗人參皂甙CY含量≥95％。
實施例5YLY菌接種于加入30克Rc的無糖查氏培養基(1000ml)中培養，37℃下培養24小時，培養混合液經高溫滅活，用水飽和的正丁醇萃取混合液三次，蒸干正丁醇相后，經正相制備色譜(流動相為氯仿/甲醇的混合液)分離純化，遠紅外干燥，得到人參皂甙Mc16克，經檢驗人參皂甙Mc含量≥95％。
實施例6YLY菌接種于加入30克Re的無糖的查氏培養基(1000ml)中培養，37℃下培養24小時，培養混合液經高溫滅活，用水飽和的正丁醇萃取混合液三次，蒸干正丁醇相后，經正相制備色譜(流動相為氯仿/甲醇的混合液)分離純化；遠紅外干燥，得到人參皂甙Rg120克，經檢驗人參皂甙Rg1含量≥95％。
實施例7YLY菌接種于加入30克Rg2的無糖的查氏培養基(1000ml)中培養，37℃下培養24小時，培養混合液液經高溫滅活，用水飽和的正丁醇萃取混合液三次，蒸干正丁醇相后，經正相制備色譜(流動相為氯仿/甲醇的混合液)分離純化；遠紅外干燥，得到人參皂甙Rh119克，經檢驗人參皂甙Rh1含量≥95％。
實施例8YLY菌接種于加入30克Rg3的無糖的查氏培養基(1000ml)中培養，37℃下培養3日，培養混合液經高溫滅活，用水飽和的正丁醇萃取混合液三次，蒸干正丁醇相后，經正相制備色譜(流動相為氯仿/甲醇的混合液)分離純化；遠紅外干燥，得到人參皂甙Rh211克，經檢驗人參皂甙Rh2含量≥95％。
實施例9YLY菌接種于加入30克Rg5的無糖的查氏培養基(1000ml)中培養，37℃下培養24小時，培養液經高溫滅活，用水飽和的正丁醇萃取混合液三次，蒸干正丁醇相后，經正相制備色譜(流動相為氯仿/甲醇的混合液)分離純化；遠紅外干燥，得到人參皂甙Rh310克，經檢驗Rh3含量≥95％。
實施例10YLY菌接種于在加入30克Rk1的無糖的查氏培養基(1000ml)中培養，37℃下培養24小時，培養混合液經高溫滅活，用水飽和的正丁醇萃取混合液三次，蒸干正丁醇相后，經正相制備色譜(流動相為氯仿/甲醇的混合液)分離純化；遠紅外干燥，得到人參皂甙Rk29克，經檢驗Rk2含量≥95％。
實施例11YLY菌接種于在加入30克Rg3的無糖的查氏培養基(1000ml)中培養，37℃下培養5日，培養混合液經高溫滅活，用水飽和的正丁醇萃取混合液三次，蒸干正丁醇相后，經正相制備色譜(流動相為氯仿/甲醇的混合液)分離純化；遠紅外干燥，得到原人參二醇10克，經檢驗原人參二醇含量≥95％。
實施例12YLY菌接種于加入30克Rg1的無糖的查氏培養基(1000ml)中培養，37℃下培養5日，培養混合液經高溫滅活，用水飽和的正丁醇萃取混合液三次，蒸干正丁醇相后，經正相制備色譜(流動相為氯仿/甲醇的混合液)分離純化；遠紅外干燥，得到原人參三醇12克，經檢驗原人參三醇含量≥95％。
實施例13YLY菌接種于加入30克Rk1的無糖的查氏培養基(1000ml)中培養，37℃下培養5日，培養混合液經高溫滅活，用水飽和的正丁醇萃取混合液三次，蒸干正丁醇相后，經正相制備色譜(流動相為氯仿/甲醇的混合液)分離純化；遠紅外干燥，得到3β-O-達瑪烷-20(22)，24-二烯6克，經檢驗3β-O-達瑪烷-20(22)，24-二烯含量≥95％。
實施例14YLY菌接種于加入30克Rg5的無糖的查氏培養基(1000ml)中培養，37℃下培養5天，培養混合液經高溫滅活，用水飽和的正丁醇萃取混合液三次，蒸干正丁醇相后，經正相制備色譜(流動相為氯仿/甲醇的混合液)分離純化；遠紅外干燥，得到3β-O-達瑪烷-20(21)，24-二烯5克，經檢驗3β-O-達瑪烷-20(21)，24-二烯含量≥95％。
權利要求
1.一種由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏的黑曲霉，保藏號為CGMCC 0751，保藏日為2002年6月14日。
2.一種用權利要求1所述黑曲霉酵解人參皂甙酵制備稀有低極性人參皂甙的方法。
3.按照權利要求2所述黑曲霉酵解人參皂甙制備稀有低極性人參皂甙的方法，其特征在于所述培養基為查氏瓊脂、查氏酵母膏瓊脂、麥芽汁瓊脂或高氏培養基。
4.按照權利要求3所述黑曲霉酵解人參皂甙制備稀有低極性人參皂甙的方法，其特征在于培養基中，人參皂甙所占的比例為0.1～30％，酵解溫度25-45℃，酵解時間2小時～7天。
5.按照權利要求2所述黑曲霉酵解人參皂甙制備稀有低極性人參皂甙的方法，其特征在于黑曲霉酵解天然人參二醇型皂甙，得到稀有人參皂甙20-O-β-D-吡喃葡萄糖基原人參二醇，簡稱CK。
6.按照權利要求2所述黑曲霉酵解人參皂甙制備稀有低極性人參皂甙的方法，其特征在于黑曲霉酵解人參皂甙Rb2，得到稀有人參皂甙20-O-α-L-吡喃阿拉伯糖-β-D-吡喃葡萄糖基原人參二醇，簡稱CY。
7.按照權利要求2所述黑曲霉酵解人參皂甙制備稀有低極性人參皂甙的方法，其特征在于黑曲霉酵解人參皂甙Rc，得到稀有人參皂甙20-O-α-L-呋喃阿拉伯糖-β-D-吡喃葡萄糖基原人參二醇，簡稱Mc。
8.按照權利要求2所述黑曲霉酵解人參皂甙制備稀有低極性人參皂甙的方法，其特征在于黑曲霉酵解人參皂甙Re，得到稀有人參皂甙Rg1。
9.按照權利要求2所述黑曲霉酵解人參皂甙制備稀有低極性人參皂甙的方法，其特征在于黑曲霉酵解人參皂甙Rg3，得到稀有人參皂甙Rh2。
10.按照權利要求2所述黑曲霉酵解人參皂甙制備稀有低極性人參皂甙的方法，其特征在于黑曲霉酵解人參皂甙Rg2、Rf，得到稀有人參皂甙Rh1。
11.按照權利要求2所述黑曲霉酵解人參皂甙制備稀有低極性人參皂甙的方法，其特征在于黑曲霉酵解人參總皂甙，得到人參皂甙甙元原人參二醇和原人參三醇。
12.按照權利要求2所述黑曲霉酵解人參皂甙制備稀有低極性人參皂甙的方法，其特征在于；黑曲霉酵解人參皂甙Rk1、Rg5，得到人參皂甙Rk2、Rh3，及甙元3β-O-達瑪烷-20(22)，24-二烯、3β-O-達瑪烷-20(21)，24-二烯。
13.一種用權利要求1所述黑曲霉酵解糖甙的方法，包括三七皂甙、絞股藍皂甙、芍藥甙、柴胡皂甙、黃芩甙、黃芪甙、去羥梔子甙等各種植物糖甙。
全文摘要
一種保藏號為CGMCC 0751的黑曲霉，及用該黑曲霉酵解人參皂甙酵制備稀有低極性人參皂甙的方法。培養基選自查氏瓊脂、查氏酵母膏瓊脂、麥芽汁瓊脂、高氏培養基。培養基中，人參皂甙所占的比例為0.1～30％，酵解溫度25－45℃，酵解時間2小時～7天。本發明為人參二醇類皂甙的發酵水解、制備低極性人參皂甙提供了一種來源方便、價格低廉的黑曲霉菌，用該菌株制備低極性人參皂甙工藝便捷、成本低、回收率高。使用本方法制備的低極性人參皂甙含量≥95％，甙元收率≥80％。
文檔編號C12N1/14GK1465694SQ0213240
公開日2004年1月7日 申請日期2002年6月20日 優先權日2002年6月20日
發明者楊凌, 何克江, 楊義, 李芳 , 都絳英, 楊 凌 申請人:中國科學院大連化學物理研究所