專利名稱：大鼠淋巴細胞cd4基因定量表達測試用引物、探針的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種大鼠淋巴細胞CD4基因定量表達測試用引物、探針技術背景器官移植是20世紀醫學領域中發展最快的醫學技術之一。許多病人晚期往往伴有心臟、肺臟、胰腺、肝臟、腎臟等大器官功能的衰竭，通過器官移植將正常器官代替這些病變或功能衰竭的器官，已成為最有效的治療手段。
CD4分子是一個糖蛋白，其在T細胞的活化中主要有以下兩種功能充當細胞與細胞的黏附分子，和在與II類MHC分子結合時可能傳遞信號或促進TCR復合物介導的信號傳導。由于CD4分子在T淋巴細胞的活化中起重要作用，因此，對免疫系統疾病及器官移植后CD4分子及基因表達水平的檢測是監測免疫排斥反應和診斷某些疾病的理想手段。
有報道指出，移植心臟的慢性排斥反應與CD4+淋巴細胞有關，并依賴于CD8+淋巴細胞。
已有的免疫分子基因表達的測定方法包括基因差異顯示灰度掃描方法、原位雜交(sorthen blot)技術，但上述方法較復雜、精確性和重復性差、且有同位素污染等問題，因此有必要提供一種適應快速精確定量測定的引物和探針。
發明內容
本發明的目的是提供一種大鼠淋巴細胞CD4基因定量表達測試用引物及探針，利用該引物及探針可對大鼠淋巴細胞CD4基因作熒光PCR實時定量檢測，由于本引物、探針具有與待測基因同源的高特異性和高親合性，可獲得高靈敏度、高精確性的結果。
為達到上述目的本發明采用以下技術方案本發明提供的引物和探針序列為cDNA探針140-FT5’CCCCTTCCTTCCCCAGCACCACG 3’引物123U5’GTCACCCAAGGAAAGACCGT 3’213L5’TTTTGGTCAGAGGACTTCCACGC 3’CD4基因全序及其探針、引物位置見附件一其中123U為上游引物，是正鏈140-FT為探針，是反鏈213L為下游引物，是反鏈
圖1實時熒光定量PCR測定的5個不同樣本的CD4和β-actin的擴增曲線(實驗中某一時間點)圖2為大鼠心臟移植術前后不同時間移植心肌組織中CD4+淋巴細胞浸潤、外周血淋巴細胞免疫分子CD4表達及其基因定量表達曲線的比較
圖3同一樣本的不同模板濃度的擴增曲線比較4CD4特異性引物的擴增產物的瓊脂糖電泳5PCR反應中CD4特異性引物工作原理6CD4特異性探針示意圖大鼠CD4基因特異性引物及探針的基本工作原理PCR反應中CD4特異性引物工作原理(見圖5)。
CD4基因特異性引物在PCR反應中的退火溫度時與逆轉錄后開鏈CD4的cDNA核苷酸鏈的特定區域完全互補結合，并在延伸溫度時引導相應CD4核苷酸鏈的復制擴增。過程如圖示。其特點由于引物的特異性，實現了PCR反應時只進行CD4基因cDNA的復制與擴增，沒有非特異性基因的擴增。CD4基因的特異性探針(見圖6)。
本實驗所設計的探針為Taqman探針，探針5’連接一個Fam熒光基團(此熒光基團在520-740um波長范圍內均能檢測到)，3’端連接1個Tamra淬滅基團，此兩基團均為DNA合成儀自動標記。PCR反應時特異探針首先與前次逆轉錄生成的CD4 cDNA特定區域核苷酸序列實現完全互補結合，但由于此時，熒光報告基團被淬滅基團所控制不發熒光。在下一次循環擴增時，Taq酶在特異性引物引導下與模板結合延伸至特異性探針與模板結合的位置時，其中的Taq酶在60℃時將特異性探針切斷，熒光報告基團與淬滅基團分開，致使熒光基團發光，同時定量PCR儀記錄熒光強度，用于定量此次擴增前cDNA的模板數。
本發明中采用了以β-actin作為參照物的起始拷貝數的相對定量方法。
由于淋巴細胞β-actin mRNA的表達水平只與細胞數有關，且其在細胞中含量恒定，所以本實驗以β-actin作為參照物。利用實時熒光定量PCR技術對同一樣本總RNA中的β-actin和CD4基因表達水平同時進行測定。設每個基因在40個擴增循環中，熒光強度從基線開始增加的循環數為Ct。即Ct值表示基因開始擴增時的起始循環數，(反映模板基數)。因為cDNA的模板基數每增加10倍，開始擴增的循環數(Ct值)減少3.33，故不同樣本模板基數的差可由公式10(CtA-CtB)/3.33計算。CD4相對于β-actin模板數的倍數為10(CD4-β-actin)/3.33.，倍數越大，說明CD4基因的起始模板數越低，即數字增加表示負調表達。圖1中，實時熒光定量PCR測定的CD4與β-actin(見圖1)的反應曲線，下箭頭為β-actin，上箭頭為CD4。其中以大鼠心臟移植術前某一時間點為例，見表1表1編號 CD4(Ct值) β-actin(Ct值) 10(CD4-β-actin)/3.331 12.87 8.124 26.6212 12.93 8.295 24.6543 13.33 8.640 25.6104 13.72 8.983 26.4565 18.55 14.57 15.675均值 23.8±4.61上述表中，均值23.8±4.61表示五例外周血淋巴細胞CD4基因對β-actin編碼基因的相對起始模板倍數，數字增加表示負調表達。外周血淋巴細胞CD4免疫分子表達、CD4基因表達和移植心肌組織中CD4+淋巴細胞浸潤等三者比較結果見表2和圖2。
作為對比實驗的外周血淋巴細胞CD4免疫分子表達測定1.單克隆抗體(mAb)標記取200μL抗凝血，根據Immunotech公司的說明書，加入熒光標記的抗RAT CD4 mAb 10μL，混勻，于4℃暗箱孵育30min。標記后，用紅細胞裂解液裂解紅細胞(室溫放置4min)，離心1500rpm/min 3min，棄上清，在相同離心條件下，用含2％小牛血清的0.01mol/L PBS滌洗白細胞2遍，加PBS至0.5mL，制成白細胞懸液。
2，流式細胞分析白細胞懸液過濾后，用XL A27153型流式細胞儀，測定被抗CD4單抗標記的淋巴細胞百分數(％)。
作為對比實驗的移植心肌組織中免疫熒光細胞染色分別取移植前SD大鼠的原位心臟和移植后各時間組的移植心臟，冰凍后于中遠1/3處橫段面切片，95％乙醇固定30min，PBS洗滌3次，每次5min，用熒光標記的抗CD4單克隆抗體標記，37℃恒溫孵育30min，PBS洗滌3次，每次5min，甘油封片后4℃避光保存，熒光顯微鏡下進行CD4+淋巴細胞記數。
外周血淋巴細胞CD4基因表達水平與外周血淋巴細胞CD4免疫分子表達水平、免疫組化方法測定移植心肌中CD4+淋巴細胞浸潤數的比較(見表2和圖2)。表2大鼠心臟移植前后移植心肌組織中CD4+淋巴細胞浸潤數、外周血淋巴細胞CD4分子表達與CD4基因表達的比較。
術前術后24h 72h 7d 10d12dCD4+浸潤15.54.8 5.3 11.89.211.8CD4分子 65.443.7 49.850.451.7 46.5CD4基因 46.16 31.6658.49 56 45.7 57.1表中CD4基因表達的數字為外周血淋巴細胞CD4基因對β-actin編碼基因的模板倍數，數字增加表示負調表達。
圖2中，有三條曲線，1為CD4+淋巴細胞浸潤曲線，曲線上的A點表示浸潤量出現峰值的時間為7天；2為CD4免疫分子表達，曲線上的B點表示表達量出現峰值的時間為72小時；3為CD4基因定量表達，曲線上的C點表示表達量出現峰值的時間為術后72小時。
從圖2可以看到，以大鼠心臟移植術前后不同時間移植心肌組織中CD4+淋巴細胞浸潤數、外周血淋巴細胞CD4免疫分子表達水平與淋巴細胞CD4基因表達水平的比較為例于心臟移植后第7天，移植心肌中CD4+淋巴細胞浸潤達術后峰值，外周血淋巴細胞CD4免疫分子在移植術后第72小時，其表達水平升至峰值，比心肌中CD4+淋巴細胞浸潤峰值時間提前了4天。CD4基因相對表達量于術后第72小時時亦上升達到移植后峰值，與免疫分子表達峰值時間相一致，但其上升幅度較大，比移植心肌中CD4+淋巴細胞浸潤峰值早4天。
從圖3、圖4可以看到本發明的特異性和敏感性。圖3中，1表示模板濃度為3.288ug/ml，2表示模板濃度為3.288×10-1ug/ml，3表示模板濃度為3.288×10-2ug/ml，4表示模板濃度為3.288×10-3ug/ml，5表示模板濃度為3.288×10-4ug/ml。在圖3中，當模板濃度稀釋到3.288×10-4ug/ml時同樣能得到很好的Ct和擴增反應曲線。圖4中，是CD4特異性引物擴增產物的瓊脂糖電泳結果，具有單一擴增帶，其中1、2、3、4、5表示五個樣品。
本發明的優點本基因的探針和引物的靈敏度和特異性好，實時熒光相對定量分析，準確性高，操作簡單，只需一步，所需樣本量小。采用實時相對定量分析方法檢測到CD4基因表達水平峰值與流式細胞儀檢測到CD4免疫分子表達峰值時間相一致，較移植心肌中CD4+淋巴細胞浸潤峰值。
附件一1 agaagaaagg actggccaga gactcagatc cccatccgct caagcaggcc accatgtgcc61 gaggcttctc tttcaggcac ttgctgccgc tgctgctcct gcagctgtca aaactcctag 241 ttctgggata taagaacaag ttattgatta aaggttcact tgagctgtat agtcgttttg301 attccagaaa aaatgcatgg gagagaggat catttcccct catcatcaat aaacttagga361 tggaggactc tcagtcttat gtctgcgagc tggagaacaa gaaagaggag gtggagttgt421 gggtcttcag agtgaccttc aatccgggta ccagactgtt gcaggggcag agcctgaccc481 tgatcttgga tagcaaccct aaggtctctg accccccgat agagtgcaaa cacaaaagca541 graacattgt caaggactcc aaagctttct ccacgcacag cctaaggatt caggacagtg601 gcatctggaa ctgcaccgtg accctgaacc agaagaagca ctcatttgac atgaaactct661 cagtgctggg ctttgcgagc acatccatca cggcctataa gagtgagggg gagtcagcgg721 agttctcctt cccactcaac cttggagagg aaagcctgca gggagagttg agatggaagg781 cagagaaggc tccttcttcc cagtcctgga tcaccttctc cctaaagaac caaaaggtgt841 ctgtgcagaa gtctactagc aaccccaagt tccagctgtc cgaaacgctc ccactcaccc901 ttcagatacc ccaggtctcc cttcagtttg ctggttctgg caacctgacc ctgactctgg961 acagagggat actgtatcag gaagtgaacc tggtggtgat gaaagtgact cagcccgaca1021 gcoacacttt gacctgtgag gtgatgggac ccacctcacc caagatgaga ctgatcttga1081 agcaggagaa tcaggaggcc agggtctcca ggcaggagaa agtgattcaa gtgccggccc1141 ctgaagcagg ggtgtggcaa tgtctactga gtgaaggtga agaggtcaag atggactcca1201 agatccaggt tttatccaaa gggttgaacc agacaatgtt cctggctgtc gtgctgggga1261 gcgccttcag ctttctggtt ttcacggggc tctgcatcct attctgtgtc aggtgccggc1321 accaacagcg ccaggcagca cggatgtctc agatcaagag gcttctcagt gagaagaaga1381 cttgccagtg ctcccaccgg atgcagaaaa gccacaatct catatgaggc ctgggcccca1441 cctgcagccc tgcctgtgtc ctgtcgctga cccaggcctg tggaccagat gaatgtagcc1501 cacacagtgc ctctggcctc ctgcttttct cttccacaac tggccacggt ttctctgcct1561 cigttcccaa gcccgttggc tgagcttgcg ctcggctgtg tttcagacac tcaagcacac1621 ccagccaggt tattgatcct ccgtagctgc ctttacgcca gagcccagcc cttctctgac1681 taacatcctg gatcktcttt ccagctgtct gcttggatct aagggcacct gacctggatg1741 gtgggactg
序列表<110>北京市心肺血管疾病研究所<120>大鼠淋巴細胞CD4基因定量表達測試用引物、探針<130><160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>23<212>DNA<213>人工合成<400>1ccccttcctt ccccagcacc acg23<210>2<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>2gtcacccaag gaaagaccgt20<210>3<211>23<212>DNA<213>人工合成<400>3ttttggtcag aggacttcca cgc2權利要求
1.一種大鼠淋巴細胞CD4基因定量表達測試用引物、探針，其特征在于所述的引物序列中，上游引物123U的序列為5’GTCACCCAAGGAAAGACCGT 3’，下游引物213L的序列為5’TTTTGGTCAGAGGACTTCCACGC 3’；探針140-FT的序列為5’CCCCTTCCTTCCCCAGCACCACG 3’。
全文摘要
一種大鼠淋巴細胞CD4基因定量表達測試用引物、探針，其特征在于所述的引物序列中，上游引物123U的序列為5’GTCACCCAAGGAAAGACCGT 3’，下游引物213L的序列為5’TTTTGGTCAGAGGACTTCCACGC 3’；探針140－FT的序列為5’CCCCTTCCTTCCCCAGCACCACG 3’。本發明的優點本基因、探針和引物的靈敏度和特異性好，實時相對定量分析，準確性高，操作簡單，只需一步，所需樣本量小。采用實時相對定量分析方法檢測到外周血淋巴細胞CD4基因表達水平峰值與流式細胞儀檢測到CD4免疫分子表達峰值時間一致，比免疫組化測定到移植心肌組織中CD4+淋巴細胞浸潤峰值提前4天。
文檔編號C12P19/34GK1475579SQ0214613
公開日2004年2月18日 申請日期2002年11月1日 優先權日2002年8月16日
發明者黃益民, 顧云, 張穎, 朱文斯 申請人:北京市心肺血管疾病研究所