專利名稱：利用轉化檸檬酸合成酶基因培育磷高效水稻的方法
技術領域：
本發明屬于基因工程和水稻分子育種技術領域。具體地說涉及到應用轉基因方法將外源檸檬酸合成酶基因(CS)導入水稻受體，通過增加檸檬酸的合成與分泌，增強水稻對低磷的耐性，培育一種磷高效水稻新品種或者創造新資源的方法。
背景技術：
世界范圍內土壤有效磷的缺乏已不同程度地影響了作物的生長和產量。長期以來，植物營養與施肥研究多采用改土、施肥等措施提高土壤肥力，這不但增加了農業的成本，而且化肥的大量施用也加重了環境，尤其是水體的污染。常規的磷高效水稻資源篩選及雜交育種也是當今磷高效水稻育種的主要方法，但由于其受有性雜交親本資源的限制，應用這種育種方法培育磷高效水稻品種的困難越來越大。基因工程方法的應用，使人們得以在基因資源的利用上突破了生物學上物種的界限。雖然植物基因工程在改良作物的抗病、抗蟲、抗逆、抗除草劑、品質、雜交制種技術等方面取得了較大的成功，但在提高作物對土壤磷的高效利用方面至今仍未找到有效途徑。利用轉基因手段培育低投入、高產出，能大范圍推廣應用的磷高效水稻新品種，已成為我國農業持續發展的一個重要的戰略措施。
植物本身具有耐低磷脅迫的機制，主要涉及根系對難溶性磷的活化、對低濃度有效磷的高效吸收以及對吸收的磷的有效利用等。根系對難溶性磷的活化的機制較多，但主要有兩種一是利用土壤中的難溶性有機磷的機制，即根系分泌酸性磷酸酶(Apase)和RNA酶(Rnase)以釋放PO43-；二是利用難溶性無機磷(FePO4，AlPO4等)有關的機制，即根系分泌有機酸(主要是檸檬酸、蘋果酸、草酰乙酸、琥珀酸等)以螯合Fe、Al、ca等金屬離子從而釋放PO43-。其中，根系分泌有機酸以活化土壤中難溶性無機磷，這是植物較為有效的解除磷脅迫的途徑(Lipton等，Citrate，malate and succinate concentration in exudatesfrom P-sufficient and P-stressed Medicago sativa L.Seedlings.Plant Physiol，1987，85315-317)。在羽扇豆(Gardner等，.The acquisition of phosphorus by Lupinus albusL.III The probable mechanism by which phosphorus movement in the soil/root interfaceis enhanced.Plant soil，1983，70107-124)、牧草(Lipton等.Citrate，malate andsuccinate concentration in exudates from P-sufficient and P-stressed Medicagosativa L.Seedlings.Plant Physiol，1987，85315-317)、油菜(Hoffland等，Biosynthesis and root exudation of citric and malic acids in phosphate starved rapeplants.New Phytol.1992，122675-680)等作物中，都發現有機酸的分泌與磷釋放及抗鋁毒的相關性。Dinkelaker等(Dinkelaker等，Citric acid excretion and precipitationof calcium citrate in the rhizosphere of white lupin(Lupinus albus L.).Plant CellEnviron，1989，12285-292)報道了土壤在缺磷條件下可誘導白羽扇豆形成簇生根，光合作用同化碳的23％以檸檬酸的形態從簇生根區分泌進入根際，這些檸檬酸一方面提高了土壤中難溶性磷化合物的溶解度，使難溶性磷得以釋放；另一方面，檸檬酸與Al3+的穩定的螯合也減輕或消除了鋁對植物根系的毒害。1997年，de la Fuente等人將假單孢桿菌(Pseudomonas aeruginosa)的檸檬酸合成酶基因導入到煙草和木瓜中超表達(de la FuenteJ M，Ramirez-Rodrigez V，Cabrera-Ponce J S，Herrera-Esterella L.Aluminum tolerancein transgenic plants by alteration in citrate synthesis.Science，1997，2761566-1568)，其根系檸檬酸合成能力比對照提高10倍以上，根系分泌的檸檬酸比對照高出4倍以上，轉基因植株在300μm鋁濃度的培養基上生根并正常生長，而對照植株在50μm鋁濃度下就不能生根。2000年，JoséLópez-Bucio等人在煙草中超量表達檸檬酸合成酶基因(JoséLópez-Bucio，Octavio Matínez de la Vega，Arturo Guevara-Barcía，and LuisHerrera-Estrella.Enhanced phosphorus uptake in transgenic tobacco plants thatoverproduce citrate.Nature Biotechnology 2000，18(4)450-453)，結果表明，轉基因植株對磷的吸收能力大大增強，植株株高、果實干重、葉面積以及生物學產量等指標都顯著強于對照；Koyama等(Koyama等，Overexpression of mitochondrial citrate synthasegene improve the growth of carrot cells in Al-phosphate medium.Plant Cell Physiol，1999，40482-488)在胡蘿細胞中超表達線粒體檸檬酸合成酶后發現，在AlPO4的培養基上，植株對Pi的吸收顯著提高。2000年，Koyama等再次將線粒體檸檬酸合成酶基因導入擬南芥(Koyama等，Overexpression of mitochondrial citrate synthase in Arabidopsisthaliana improved growth on a phosphorus-limited soil.Plant cell physiol，2000，41(9)1030-1037)，發現根部分泌的檸檬酸比對照高出3倍，對Pi的吸收能力也大大提高，在對Al3+毒害的耐性方面，轉基因植株也顯著強于對照。
然而，與其它作物相比，水稻在酸性土壤或缺磷環境下根系分泌的檸檬酸很少(Takashi Otani等.，)。因而，通過轉基因技術，將外源檸檬酸合成酶基因導入到水稻中，將會有效提高水稻對低磷的耐性。
發明內容
本發明的目的就是通過轉基因技術，從細菌中克隆檸檬酸合成酶基因(Citratesynthase，CS)將改造后的外源檸檬酸合成酶基因導入到水稻受體中，然后通過雜交育種的方法篩選對低磷有耐性和提高檸檬酸合成的水稻新品種或新種質。
本發明通過以下技術方案實現以聚合酶鏈式反應(PCR)擴增的方法，從假單孢桿菌(Pseudomonas aeruginosa)基因組中克隆檸檬酸合成酶基因的氨基酸編碼序列，加以遺傳改造后，通過轉基因方法，將目的基因轉入水稻受體中，獲得大量的轉基因植株，結合PCR和分子雜交方法，生理生化分析方法和缺磷盆栽及相關農藝性狀的考查，在自交后代中選育有效分蘗數明顯增多，單株產量較大提高的轉基因株系，選育磷高效品種和創造育種新資源。其操作步驟如下
一種培育磷高效水稻的方法，其特征在于a.利用聚合酶鏈式反應(PCR)的方法從假單孢桿菌(Pseudomonas aeruginosa)中克隆檸檬酸合成酶(Citrate synthase，CS)基因的編碼序列；b.通過基因工程的方法構建適合于在植物中表達的重組基因的表達載體；c.利用轉基因方法將外源檸檬酸合成酶基因導入水稻受體，獲得轉化植株；d.借助報告基因和PCR方法鑒定陽性轉化株，進一步用分子雜交方法鑒定陽性轉化株的整合拷貝數，將含1至少數幾個拷貝的轉化株自交結實，分單株收種；e.對上季選留的種子進行磷脅迫種植，挑選有希望的株系，利用PCR方法鑒定陽性單株，自交留種；f.對收獲的種子進行磷脅迫種植，進一步考察其耐低磷的能力和農藝性狀，從表型穩定、耐低磷及農藝性狀有較大改善的2-3個株系中選擇其純合的單株；g.進一步培育成新品系或育種新資源。
本發明的優點在于1、利用超表達外源檸檬酸合成酶基因提高植株對低磷的耐性，創造一種磷高效水稻育種的新方法；2、本方法可以直接應用于其它磷高效作物新品種和新資源的創造；3、采用轉基因方法，結合分子生物學技術，品種選育的周期短、效率高。
詳細的技術細節由以下實施例給出，但并不是限制本發明的保護范圍。
具體的實施方式實施例1檸檬酸合成酶基因編碼序列的克隆a.根據Lynda等(Lynda，Gilles F.Molgat and Harry W.Duckworth.Cloning，sequencing，and expression of the gene for NADH-sensitive citrate synthase ofPseudomonas aeruginosa.J Bacteriol，1989，171(10)5542-5550)報道的假單孢桿菌(Pseudomonas aeruginosa)檸檬酸合成酶基因編碼序列設計引物P1(5’-GCGGA TCCATGGCT GAC AAA AAA GCG-3’)和P2(5’-CGGGA TCCTCA GCC GCG ATC CTT GAG-3’)。
引物中分別設計了一個BamHI內切酶識別位點，以便于基因的改造；b.用PCR克隆的方法從假單孢桿菌(編號為Pa 1.112，該菌株由中國科學院微生物研究所購得)基因組中克隆檸檬酸合成酶基因編碼序列(實施例1的a部分已公開了該基因的核苷酸序列)；c.經BamHI酶切，連入載體pBluescript-SK，命名為pBS-CS；d.利用編碼序列中5’端的一個KpnI酶切位點，選擇正向插入的pBS-CS(正向插入時多克隆位點上的SmaI和XbaI酶切位點分別位于編碼序列的5’端和3’端)，命名為pBS-CS1，測序驗證。
實施例2重組基因及表達載體的構建
a.用SmaI和XbaI酶對質粒pBS-CS1進行雙酶切，回收酶切產物；b.同時將含有增強表達的雙35S啟動子及3’端調控序列的載體pRTL2-NS用SmaI和XbaI酶進行雙酶切，回收酶切產物；c.兩種酶切產物用T4 DNA連接酶進行連接，重組質粒命名為pRTL2-Cs；d.對重組質粒pRTL2-CS用HindIII酶切，回收酶切產物；同時用HindIII酶切雙元Ti質粒載體pCAMBIA1301，并作去磷酸化處理，回收酶切產物；e.兩種酶切產物用T4 DNA連接酶進行連接，將重組的雙元Ti質粒載體命名為p1301-CS；f.將p1301-CS導入農桿菌EHA105菌株，用于侵染植物愈傷。
實施例3盆栽用缺磷土壤有效磷含量的測定用鉬銻抗法(華中農業大學教學實驗用書《土壤化學實驗指導書》，1993年，華中農業大學教材科)測定盆栽用缺磷土壤中有效磷的含量為2.25mg/kg。為了提高土壤中全磷的含量，我們在土壤中按1/1000的比例增施磷礦粉。經測定，磷礦粉中有效磷的含量為11.76mg/kg。
實施例4水稻品種“合江19”的耐磷性鑒定將水稻品種“合江19”進行盆栽，實驗設33ppm和66ppm 2個磷梯度，4次重復，每個重復3棵苗，分蘗后期(約播種后50天)進行分蘗數調查，結果如下表1 水稻品種“合江19”在不同磷梯度下分蘗數統計
實施例5農桿菌Ti質粒介導的遺傳轉化a.將水稻品種“合江19”的成熟胚在N6培養基上誘導愈傷組織，并用N6培養基繼代培養20天；b.將生長旺盛、鮮黃色的顆粒性愈傷組織接入含1％葡萄糖和100μM乙酰丁香酮的1/2N6培養基上預培養4-5天；c.將新活化的處于對數生長期的農桿菌菌液浸泡經過預培養的愈傷組織，30分鐘后用滅菌的吸水紙吸干愈傷組織上的菌液，再接入新的預培養基上，置19℃-21℃溫度下培養2-3天；d.用無菌水充分洗滌共培養后的愈傷組織，吸干后接入含250mg/L羧芐青霉素和50mg/L潮霉素選擇培養基上進行抗性篩選，每兩星期繼代一次；e.將新長出的抗性愈傷轉入含50mg/L潮霉素的分化培養基上再生植株；f.再生植株移入1/2 MS培養基上生根，然后移入缽中盆栽，一星期后再移入大田。
實施例6轉基因植株的篩選及理想轉基因新材料的培育a.對移入大田的“合江19”的抗性再生植株取葉片作GUS報告基因分析；同時取葉片抽提DNA，作PCR檢測及分子雜交方法鑒定轉基因植株，將拷貝數為1-3個的轉基因株自交結實，單株收種；b.將上季選留的種子進行磷脅迫(phosphorus stress)種植，利用PCR方法鑒定陽性單株，結合植株耐低磷能力和農藝性狀的考察，得到12個合江19的轉化株系，自交留種；c.繼續從上季收獲的種子按株系和單株編號進行磷脅迫種植。進一步對植株耐低磷能力和農藝性狀進行考察，從中選擇表型穩定、耐低磷能力和農藝性狀有較大改善的2-3個純合單株；d.進一步培育成新品系或用于回交育種的供體親本。
實施例7磷脅迫種植水稻植株的農藝性狀考察將表型穩定、耐低磷能力和農藝性狀有較大改善的純合候選單株種子再進行磷脅迫全生育期盆栽，考種結果如下表2檸檬酸合成酶轉基因水稻(本發明)與對照的農藝性狀比較 注設計4次重復，每個重復3株苗
權利要求
1.一種培育磷高效水稻的方法，其特征在于a.利用聚合酶鏈式反應(PCR)的方法從假單孢桿菌(Pseudomonas aeruginosa)中克隆檸檬酸合成酶(Citrate synthase，CS)基因的編碼序列；b.通過基因工程的方法構建適合于在植物中表達的重組基因的表達載體；c.利用轉基因方法將外源檸檬酸合成酶基因導入水稻受體，獲得轉化植株；d.借助報告基因和PCR方法鑒定陽性轉化株，進一步用分子雜交方法鑒定陽性轉化株的整合拷貝數，將含1至少數幾個拷貝的轉化株自交結實，分單株收種；e.對上季選留的種子進行磷脅迫種植，挑選有希望的株系，利用PCR方法鑒定陽性單株，自交留種；f.對收獲的種子進行磷脅迫種植，進一步考察其耐低磷的能力和農藝性狀，從表型穩定、耐低磷及農藝性狀有較大改善的2-3個株系中選擇其純合的單株；g.進一步培育成新品系或育種新資源。
全文摘要
本發明公開了一種利用轉基因技術培育磷高效水稻的方法，屬于基因工程和植物新品種選育技術領域。其特征在于將來源于細菌的檸檬酸合成酶基因(Citrate synthase，CS)導入水稻受體，借助報告基因、聚合酶鏈式反應(PCR)檢測和分子雜交鑒定出轉基因植株，考查后代植株對土壤無效磷的吸收情況和農藝性狀，選育分蘗數明顯增多、產量有較大提高、耐低磷的轉基因水稻株系，進而培育磷高效水稻品種和創造育種新資源。
文檔編號C12N15/09GK1500875SQ02149378
公開日2004年6月2日 申請日期2002年11月15日 優先權日2002年11月15日
發明者張啟發, 周澤民, 林擁軍, 賀立源, 徐才國 申請人:華中農業大學