專利名稱：發酵法生產脂肪酶的方法
技術領域：
本發明涉及一種發酵生產脂肪酶的方法，更確切地說是涉及一種采用酵母菌作為菌種的發酵生產脂肪酶的方法。
背景技術：
酶是一種作用范圍廣、反應條件溫和、催化效率高、立體選擇性及底物專一性強的生物催化劑，在醫藥工業、農業、環保、精細化工及食品工業等方面均有著較為廣泛的應用。而在應用于工業生產的酶中，無論從市場價值還是從應用的范圍來說，脂肪酶都是最為重要的酶之一。
脂肪酶除可以催化酯化反應外，還可以催化多種反應。脂肪酶(三酰基甘油酯水解酶)廣泛存在于高等動物、微生物和植物中，現在用來生產工業脂肪酶酶制劑的微生物主要有假單胞桿菌(Pseudomonas)、毛霉菌(Mucor)、地霉菌(Geotrochum)、根霉(Rhizopus)、念珠菌(Candida)等，其中皺褶假絲酵母(Candida rugosa)就是廣泛應用于工業生產的脂肪酶產生菌之一。
盡管皺褶假絲酵母(Candida rugosa)脂肪酶的生化、結構和催化特性已經有文獻報道，但是關于控制脂肪酶合成和分泌因素及條件的報道較少。另外遺傳研究證實在皺褶假絲酵母中有七種基因編碼不同的脂肪酶，Lotti等研究表明，編碼各種同功酶基因的表達可能存在不同的控制機制，所以培養基的組成就影響著所產生的脂肪酶中同功酶種類及比例。Gordillo等通過實驗表明在發酵過程中采用不同的操作條件也影響所產生的同功酶種類及比例。所以在用發酵法生產皺褶假絲酵母脂肪酶過程中，為了保證發酵結果具有確定性和可重復性，選擇合適的培養條件特別是培養基組成是非常重要的。
現有技術中，利用微生物生產酶制劑所采用的培養基中主要成分為碳源和氮源。由于氮元素是構成微生物細胞蛋白質的重要成分，亦是構成細胞內核酸的重要成分，同時也是細胞合成蛋白質、酶和氨基酸等重要代謝物的成分，因此，在酶制劑工業中，氮源是不可缺少的重要原料。
當前酶制劑工業生產中常用的氮源可分為無機氮源和有機氮源。前者有硫酸銨、硝酸銨和尿素，而常用的有機氮源大多為酵母膏和胨類。從文獻報道來看，應用于皺褶假絲酵母脂肪酶生產的氮源主要是無機氮源如硫酸銨和尿素，而尚未有采用油料餅粕特別是黃豆餅粉作為氮源的報道。在國內，宋慶訓等以尿素作為唯一氮源進行發酵實驗，發酵水平為19.5U/ml；吳國平等采用有機氮源魚胨和酵母膏進行發酵實驗，每毫升發酵液酶活力為4.2U。在國外，Laksmi等和Obradors等用尿素作為氮源進行發酵生產脂肪酶，發酵水平分別為4.43U/ml和8.0U/ml。Rao等同樣以尿素作為唯一氮源進行固態發酵實驗，發酵水平為24.4U/克米糠。但是Montesinos等在用油酸和尿素進行連續發酵生產中發現尿素與油酸之間在培養基中存在乳化現象。由于酵母細胞無法正常的吸收氮源，導致細胞合成蛋白質的能力降低，同時脂肪酶的生產也受到抑制，所以在發酵生產中尿素逐漸被硫酸銨所取代。Gordillo等和Dalmau等均以硫酸銨作為唯一氮源進行發酵實驗，發酵水平分別為12.1U/ml和5.3U/ml。最近， 等利用有機氮源酵母膏結合蛋白胨進行發酵實驗，發酵水平達5.58U/ml。
發明內容
本發明的目的是提供一種發酵生產脂肪酶的方法，本發明是這樣實現的。本發明的發酵生產脂肪酶的方法主要包括以皺褶假絲酵母為菌種，經過斜面培養和發酵培養，培養后的發酵液離心后取得離心液即包含所需的脂肪酶，所述的在發酵培養時，以油料餅粕作為培養基唯一氮源。
本發明方法所述的發酵培養基是油酸1～3g/L，磷酸二氫鉀 2～7g/L，硫酸鎂MgSO4·7H2O 0.1～1.2g/L，氯化鐵FeCl3·6H2O 5～15mg/L，肌醇 2～6mg/L，生物素 0.005～0.012mg/L，維生素 0.1～0.4mg/L，油料餅粕 16～90g/L。
所述的油料餅粕是以花生、大豆、油菜籽、棉籽、葵花籽、芝麻以及紅花為原料的油料餅粕，較佳的油料餅粕是以大豆、芝麻為原料的油料餅粕。發酵培養時的培養條件是在28～32℃下培養48～50小時，培養時搖床轉速可以控制在180～240轉/分鐘。
本發明方法所述的斜面培養基是蛋白胨0.2～0.5g，瓊脂1.5～4g，然后加入麥芽浸出液至100mL。斜面培養條件是在28～30℃下培養24～26小時。
本發明的發酵生產脂肪酶的方法針對現有培養基的發酵水平不高的情況，以油料餅粕作為氮源，如黃豆餅粉。黃豆餅粉含有粗淀粉、粗蛋白、粗脂肪、粗纖維和灰分等微生物生長所必需的營養成分。當以黃豆餅粉作為發酵培養基唯一氮源與硫酸銨、硝酸銨、尿素、酵母膏、蛋白胨、牛肉膏和玉米蛋白等氮源相比，皺褶假絲酵母發酵水平有了大幅度的提高，最高可達94U/mL，遠遠高于國內外文獻所報道的皺褶假絲酵母發酵水平，同時，還進一步降低了皺褶假絲酵母發酵生產脂肪酶的成本。
具體實施例方式
下面將針對對本發明方法的具體實施例的詳細描述來進一步說明本發明，但實施例不是對本發明的限制。
實施例1①菌種皺褶假絲酵母(Candida rugosa)。
②斜面培養基蛋白胨0.3g，瓊脂2.5g，加麥芽浸出液至100mL。
③發酵培養基油酸2.0g/L，磷酸二氫鉀6.0g/L，硫酸鎂(MgSO4·7H2O)1.0g/L，氯化鐵(FeCl3·6H2O)10mg/L，肌醇4mg/L，生物素0.008mg/L，維生素B10.2mg/L，大豆餅粉16g/L。
④接種與培養條件首先取皺褶假絲酵母(Candida rugosa)菌種在斜面上劃線，28℃培養24小時；然后挑取菌體兩環接種到50mL發酵培養基(種子培養基)，30℃培養12小時，搖床轉速為220轉/分鐘；取1mL種子培養基接種到50mL發酵培養基，30℃培養48小時，搖床轉速為220轉/分鐘。培養結束后，發酵液離心取得離心液即包含所需的脂肪酶。
測定脂肪酶酶活力發酵液在4℃、3000倍的重力加速度下離心15分鐘后測定脂肪酶酶活力，測得脂肪酶酶活力是33.33U/mL。
實施例2①菌種皺褶假絲酵母(Candida rugosa)。
②斜面培養基蛋白胨0.2g，瓊脂1.5g，加麥芽浸出液至100mL。
③發酵培養基油酸1.0g/L，磷酸二氫鉀2.0g/L，硫酸鎂(MgSO4·7H2O)0.1g/L，氯化鐵(FeCl3·6H2O)5mg/L，肌醇2mg/L，生物素0.005mg/L，維生素B10.1mg/L，花生餅粕75g/L。
④接種與培養條件首先取皺褶假絲酵母(Candida rugosa)菌種在斜面上劃線，28℃培養24小時；然后挑取菌體兩環接種到50mL發酵培養基(種子培養基)，30℃培養12小時，搖床轉速為220轉/分鐘；取1mL種子培養基接種到50mL發酵培養基，28℃培養48小時，搖床轉速為220轉/分鐘。培養結束后，發酵液離心取得離心液即包含所需的脂肪酶，測得脂肪酶酶活力是73U/mL。
實施例3①菌種皺褶假絲酵母(Candida rugosa)。
②斜面培養基蛋白胨0.5g，瓊脂4.0g，加麥芽浸出液至100mL。
③發酵培養基油酸3.0g/L，磷酸二氫鉀7.0g/L，硫酸鎂(MgSO4·7H2O)1.2g/L，氯化鐵(FeCl3·6H2O)15mg/L，肌醇6mg/L，生物素0.012mg/L，維生素B10.4mg/L，大豆餅粉90g/L。
④接種與培養條件首先取皺褶假絲酵母(Candida rugosa)菌種在斜面上劃線，28℃培養24小時；然后挑取菌體兩環接種到50mL發酵培養基(種子培養基)，30℃培養12小時，搖床轉速為220轉/分鐘；取1mL種子培養基接種到50mL發酵培養基，28℃培養48小時，搖床轉速為220轉/分鐘。培養結束后，發酵液離心取得離心液即包含所需的脂肪酶，測得脂肪酶酶活力是94U/mL。
實施例4除油料餅粕是以芝麻為原料的油料餅粕，發酵培養基內加入量為40g/L外，其余同實施例1，分析離心液，其脂肪酶酶活力是35U/mL。
權利要求
1.一種發酵法生產脂肪酶的方法，主要包括以皺褶假絲酵母為菌種，經過斜面培養和發酵培養，發酵液離心后取得離心液即包含所需的脂肪酶，其特征在于發酵培養時，以油料餅粕作為培養基唯一氮源。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的發酵培養基是油酸 1～3g/L，磷酸二氫鉀2～7g/L，硫酸鎂MgSO4·7H2O 0.1～1.2g/L，氯化鐵FeCl3·6H2O 5～15mg/L，肌醇 2～6mg/L，生物素 0.005～0.012mg/L，維生素 0.1～0.4mg/L，油料餅粕16～90g/L。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的油料餅粕是以花生、大豆、油菜籽、棉籽、葵花籽、芝麻以及紅花為原料的油料餅粕。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的油料餅粕是以大豆、芝麻為原料的油料餅粕。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的斜面培養基是蛋白胨0.2～0.5g，瓊脂1.5～4g，然后加入麥芽浸出液至100mL。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的發酵培養條件是在28～32℃下培養48～50小時。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的斜面培養條件是在28～30℃下培養24～26小時。
全文摘要
一種發酵法生產脂肪酶的方法，是以皺褶假絲酵母為菌種，經過斜面培養和發酵培養，發酵培養時，以油料餅粕作為培養基唯一氮源，發酵液離心后取得離心液即包含所需的脂肪酶。以油料餅粕作為培養基唯一氮源與硫酸銨、硝酸銨、尿素、酵母膏、蛋白胨、牛肉膏和玉米蛋白等氮源相比，發酵水平有了大幅度的提高，最高可達94U/mL，降低了皺褶假絲酵母發酵生產脂肪酶的成本。
文檔編號C12N9/18GK1454993SQ0215101
公開日2003年11月12日 申請日期2002年12月4日 優先權日2002年12月4日
發明者童海寶, 趙相國, 蔡揚, 劉華文, 徐靜安 申請人:上海化工研究院