專利名稱：酶多聚體及其生產方法
技術領域：
本發明涉及具有改善的性能和應用特性的酶聚集體的生產。更具體地說，本發明涉及酶多聚體，它包括相互以共價鍵結合的同源的或異源的單體單元。本發明的酶多聚體具有這樣的優點，例如在活性、變應原性或酶-底物相互作用方面具有改善了的性能。
已有人建議利用多酶聚集體通過增大它們的尺寸以減小成分酶的變應原性。例如，PCT公開No.94/10191公開了比單體親代蛋白質顯示更低變應原性的低聚蛋白質并提出了增大親代酶尺寸的幾種基本方法。此外，酶聚集體在分離的環境下表現出改善的特性。例如Naka等在化學通訊(Chem.Lett.),vol.8,pp.1303-1306(1991)中公開了辣根過氧化物酶聚集體，它是通過2-丁基-2-噁唑啉和2-甲基-2-噁唑啉之間經由2步嵌段共聚形成嵌段共聚物而制備的。該聚集體在水飽和的氯仿中的活性比天然酶高200倍以上。
已有人建議把通過添加戊二醛制備的交聯酶作為穩定酶的方法。然而，交聯通常導致與天然酶相比活性的降低。例如，Khare等在生物技術和生物工程(Biotechnol.Bioeng),vol.35,no.1,pp.94-98(1990)中公開了用戊二醛生產的大腸桿菌(E.coli)β-半乳糖苷酶的聚集體。該酶聚集體雖然在55℃下表現出熱穩定性的改善，但活性只有天然酶活性的70.8％，然而它被認為在交聯后可良好地保持活性。
如從上述理解的那樣，本領域技術人員研究出了幾種備擇方法，試圖為了減小變應原性或改變活性參數而生產聚集的酶。然而，這些方法的每一種中常見的問題是，當按這些現有技術的啟示制備聚集的酶時，認為不容易預測某些酶呈聚集形式時將表現如何。此外，按這些現有技術的啟示形成酶聚集體是高度依賴于偶然性的不嚴格科學，因此構成對制備具有預定活性的多酶聚集體的重大障礙。
為了克服這些問題，研究者們開發了包括預定的融合蛋白的酶聚集體。在典型的融合蛋白中，將一種蛋白質的基因與第二種蛋白質的基因融合，所得復合酶作為整體單元表達。這類應用于酶的融合蛋白，雖然從提供結合多種酶活性的單一蛋白質方面來看具有重要的優勢，但從在合適的宿主細胞中表達和/或分泌方面來看尚有問題。例如，產生于或由于大小或三級結構引起的蛋白酶解、細胞內不適當的折疊和分泌問題反映了融合酶技術的重大缺點。
因此，希望開發一種制備適用于醫療、診斷或工業用途的多酶系統的新方法，就包括的酶活性和那些酶的相互位置關系而論本方法是專用的，可使特定應用的動力學達最大值。還希望開發一種制備在融合蛋白的表達和分泌特性中沒問題的多酶系統的新方法，并且它能靈活地測定生成的多酶的構象。然而，現有技術不能提供一種生產具有這些特性的多酶系統的方法。
本發明的一個目的是提供一種酶多聚體，它具有改變了的活性、改變了的活性曲線圖、改變了的環境要求或其它改變了的性能特征。
本發明的一個目的是提供一種酶多聚體，它可被容易地生產并被結合入現存的方法和產物中。
本發明的一個目的是提供一種可具有很多種酶活性的酶多聚體。
本發明的一個目的是提供一種可具有改善了的變應原性特征的酶活性。
按本發明，提供了由很多單體單元構成的酶多聚體，它包括具有酶活性的第一種單體單元和具有酶活性的第二種單體單元，其中所述第一種單體單元和第二種單體單元中的每種都包括半胱氨酸殘基，并且所述半胱氨酸殘基通過硫間接的鍵相互以共價鍵結合，致使所述第一種單體單元與第二種單體單元以共價鍵連接。
圖1說明了從GG36單體單元的實際晶體結構測量結果推定的二聚體的三級結構模型。該單體單元的活性位點稱為“A”區，鈣離子稱為“B”區，引入的半胱氨酸和硫間接的共價鍵位置稱為“C”區。
圖2說明了在DTT存在下S24C(單體)和GG36(單體)在4ppm和8ppm下的脫脂奶蛋白質水解活性結果比較。
圖3說明了GG36-S24C二聚體和GG36(單體)在4ppm和8ppm下的脫脂奶蛋白質水解活性結果比較。
圖4說明了用S24C(二聚體)和GG36(單體)在8ppm下使角蛋白水解120分鐘的時間過程。
圖5說明了120分鐘后S24C(二聚體)和GG36(單體)在0～8ppm下對角蛋白的活性。
本發明提供了由很多單體單元構成的酶多聚體，它包括具有酶活性的第一種單體單元和具有酶活性的第二種單體單元，其中第一種單體單元和第二種單體單元中的每種都包括半胱氨酸殘基，并且各種單體單元的半胱氨酸殘基通過二硫鍵而相互以共價鍵結合，致使第一種單體單元與第二種單體單元以共價鍵連接。意外地，申請人發現本發明的酶多聚體顯示提高了的活性。
“酶多聚體”表示由以共價鍵結合在一起的至少兩種酶構成的單一蛋白質分子。因此，本發明的酶多聚體將具有至少兩個能催化化學反應的不同位點，即至少兩個活性位點。在本文稱為“單體單元”的單獨的酶可以包括具有酶活性的任意蛋白質或肽，且不限于已知的或現有的酶。合適的單體單元包括水解酶如蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶、酯酶、脂肪酶或半纖維素酶；催化氧化還原反應的酶(氧化還原酶)如過氧化物酶、微過氧化物酶、漆酶、木質素酶、氧化酶、NADH還原酶、2,5DKG還原酶；轉移酶；異構酶如葡糖異構酶或木糖異構酶；裂合酶；或者連接酶或合成酶。預計該多聚酶的單體單元可能是相同的酶，得自不同酶蛋白的相同活性，或完全不同的酶。所以，單體單元可以是“同源的”或“異源的”。在一個優選的實施方案中，單體單元包括細菌蛋白酶或淀粉酶，更優選是得自芽孢桿菌屬(Bacillus)的細菌蛋白酶或淀粉酶，最優選得自地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)或解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)。
本文應用的“同源蛋白”或“同源酶”表示得自分類學上相同的有機體的或具有相同性能的兩種或多種蛋白質或酶。例如，得自芽孢桿菌屬特定菌株的兩種相同的纖維素酶應是同源的。反之，本文應用的“異源蛋白”或“異源酶”表示得自分類學上不同的有機體的兩種或多種蛋白質或酶。例如，得自不同屬如大腸桿菌和地衣芽孢桿菌的蛋白質在本文被認為是異源的。此外，本發明認為得自分類學上不同的種如解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的蛋白質是異源的。正如本文應用的，得自相同微生物的兩種不同酶例如得自T.longibrachiatum的EGⅠ纖維素酶和EGⅡ纖維素酶被認為是異源的。
預計同源多聚體可能適合于這類目的，例如與單獨的前體酶相比改善催化活性或效率或者減小變應原性。例如，在從兩種同源蛋白酶生產的酶二聚體中，所得蛋白酶二聚體可表現出比起蛋白酶單體來說改善了的活性或減小了的變應原性。另外，可能生成這種多聚體，即其中一種單體單元表現出不同于第二種單體單元的酶特性，但它們以互補的方式起作用。例如，在美國專利No.4,933,279中，據稱得自地衣芽孢桿菌的野生型淀粉酶和得自解淀粉芽孢桿菌的野生型淀粉酶的混合物提供的效能有利于淀粉的液化。因此，預計包括得自地衣芽孢桿菌淀粉酶的第一種單體單元和得自嗜熱脂肪芽孢桿菌的第二種單體單元的酶二聚體應具有特殊的價值。類似地，得自前體脂肪酶的第一種單體單元和得自前體蛋白酶的第二種單體單元應在洗衣洗滌劑中具有特別的益處，這是因為它們對包括蛋白質/脂質基質的污斑具有期望的互補活性。
本發明的多聚酶不同于包括兩種或數種亞單位的天然酶。這些天然酶通常特征在于，為產生酶活性所有亞單位必須呈特定取向并且在亞單位復合體中只含一個活性位點。事實上，有些酶的活性取決于呈多聚形式的酶，因為構成多聚體的單體本身不具有酶活性。構成該多聚體的特定單體通常通過離子相互作用或疏水相互作用保持在一起，而不是通過如本發明中的共價二硫化物分子間相互作用或經由半胱氨酸硫反應間接的其它化學鍵而保持在一起。此外，本發明預計通過二硫鍵結合不同的酶單元(本文稱為單體單元)從而形成具有多個活性位點的多聚酶。
在一個優選的實施方案中，該酶多聚體包括第一種單體單元，該單體單元已從相應的前體酶修飾以包括處于適當位置上的半胱氨酸殘基。優選地，該第一種單體單元是前體酶的衍生物且因其中的位點特異性取代或添加至少一個半胱氨酸殘基而不同。“衍生物”表示該前體包括已從其祖代或親代序列修飾的氨基酸序列，通過生化的、基因的或化學的方法而實現一個或多個氨基酸的取代、缺失或插入。屬于該定義范圍的“衍生物”應具有一定程度的在天然或親代形式中觀察到的所需酶性能以致該衍生物適用于同前體一樣的用途。前體酶可以是具有所需酶活性的任意酶或其變體。
應這樣選擇酶中添加的或取代的半胱氨酸殘基所處的位置保證不干擾活性位點的反應機制。因此，在一個優選的實施方案中，所選擇的添加或取代的半胱氨酸殘基的位置不能緊鄰活性位點上的殘基或對于底物結合很重要的殘基，更優選地，就總的分子尺寸來說，添加的或取代的半胱氨酸在離活性位點和/或底物結合位點較大的表面位移處。因此，在一個實施方案中，二硫鍵將包括處于或接近該單體單元表面的兩個半胱氨酸殘基，這兩個殘基沿該蛋白質表面的位移相對于活性位點殘基或底物結合殘基的位置達最大值。不同的酶將具有不同的三級結構，這將改變添加或取代半胱氨酸的最適距離以便限制催化或底物結合干擾。然而，對于酶例如得自遲緩芽孢桿菌、一般尺寸為45×45×45的蛋白酶，應能在至少為10埃、優選為15埃且最優選為20埃的距離處放置一個添加的或取代的半胱氨酸。雖然通過X射線結晶學顯示的三級結構的存在將有助于選擇對于添加的或取代的半胱氨酸的位置，但有可能不用這些資料而獲得這種位置信息。例如，可以通過交聯或其它技術認可的方法如酪氨酸修飾隨后進行活性測定而描繪活性位點或底物結合位點的位置，如Svendsen,Carlsberg Res.Communication,vol.41,no.5,pp.237-291(1976)中描述的那樣。從該資料，將可能選擇蛋白質表面上的已知非活性位點氨基酸。
通常，需要增大的活性時，單體單元的活性位點應以適當的方式排列以允許單體單元的活性位點最大程度地接觸底物。例如，打算作用于高分子量或擴散性差的底物如角蛋白的多聚蛋白酶應優選產生使得單體單元的活性位點同樣地排列以便最大程度地對平底物暴露活性位點。同樣，預計當活性位點排成得能接觸同一底物表面時，多聚的α淀酚酶對淀粉、纖維素酶對纖維素或半纖維素酶對木漿的活性將會增強。可被包括于多聚酶內的多種活性具有協同的或互補的效用。例如，用于洗滌劑、包括過氧化物酶和纖維素酶的多聚酶將適用于雙重用途即用纖維素酶處理纖維素織物并應用過氧化物酶的漂白活性防止從纖維素除去染料而發生的染料轉移。在該情況下，最好這樣定位過氧化物酶活性位點由纖維素酶從織物釋出的染料通過過氧化物酶漂白。
通過特定的實例，本發明人發現通過將遲緩芽孢桿菌GG36蛋白酶分子中位置+24上的絲氨酸殘基變成半胱氨酸，有可能改善該蛋白酶的活性分布曲線。參照圖1，顯然引入的半胱氨酸殘基的位置是這樣的，即相對于催化位點的位置它位于該分子的背面。
從單個的單體單元形成多聚酶可在便于兩個半胱氨酸殘基間形成硫間接的鍵的、本領域中已知的氧化條件下進行。一般地，二硫鍵將在熟知的適當條件(例如與氧或空氣接觸)下自發地形成，此時各單體單元上取代的或添加的半胱氨酸能形成二硫鍵。屬于本發明的其它硫間接的鍵包括N-乙基馬來酰亞胺、N,N′-對亞苯基二馬來酰亞胺或雙馬來酰亞氨基己烷產生的連接基的應用。
預計本發明的多聚酶將適用于應用酶的任意用途。例如，多聚酶會適用于任意公認的酶應用中。例如，降解纖維素或淀粉而成寡糖或葡萄糖，用于清潔的洗滌劑，紡織品的制造和洗滌，烘烤，動物飼料添加劑以及紙漿和紙的制造，這些都是酶在其中有應用價值的工業上重要生產方法和產品的熟知實例，因此，本發明會給它們提供優勢。
本發明的特別意外的結果在于，特定的一種或多種酶的活性可通過形成包括所需的一種或多種活性的多聚酶而提高。如下述實施例中所示，按本發明的啟示有可能與相等濃度的單體酶活性位點相比就反應速度而論生產具有改善了的活性的多聚酶。同樣，預計同單體單元酶或衍生它的前體酶相比，多聚酶的整體活性、半壽命以及性能特征如pH和溫度依賴性可被改變。
如下實施例旨在闡述本發明但不能認為是限定本發明的范圍。
實施例實施例1蛋白酶二聚體GG36的制備用于表達得自遲緩芽孢桿菌的枯草蛋白酶基因(GG36)的克隆和構建方法基本上如美國專利No.5,185,258中所述，該公開并入本文作參考。GG36的S24C變體的構建是按描述于美國專利No.5,185,258和PCT公開No.WO95/10615(Genencor International,Inc．)中的標準寡核苷酸指導的誘變進行的，它應用寡核苷酸引物5′CGTGGATTGACCGGTTGTGGTGTAAAAGTT3′來產生成熟枯草蛋白酶序列的位置24上Ser到Cys的變化。下劃線的C殘基產生限制酶Agel的識別序列，而下劃線的G表示從TCT(Ser)密碼子到TGT(cys)密碼子的變化。制備突變型酶和野生型酶的發酵條件如US5,185,258中所述。然后使上述制備的GG36-S24C突變體接觸空氣以形成二聚化突變體。
實施例2蛋白酶GG36二聚體的純化將實施例1中制備并用DTT處理過的GG36-S24C發酵液的超濾液濃縮物脫鹽(G-25柱)，再在pH8.0下通過陽離子交換色譜(BioCadHS/M柱)。SDS-Phast凝膠系統的分析揭示了一個級分含有分子量大約是野生型單體GG36蛋白酶的2倍的二聚化酶，它指示GG36-S24C的二聚化形式的存在。在陽離子交換色譜之后，充分分離發酵液中的二聚體與任何非二聚化蛋白酶以致在天然凝膠和SDS凝膠上只提供單一條帶。
實施例3蛋白酶二聚體、突變型單體和野生型酶在脫脂奶水解中的比較酪蛋白是脫脂奶中約占總蛋白質的80％的主要蛋白質。脫脂奶的水解是定量分析蛋白酶活性的極好方法，因為脫脂奶中除了酪蛋白外還存在很多種蛋白質。在酪蛋白水解分析中測試實施例1和2中獲得和純化的GG36-S24C二聚體并與GG36單體比較。分別制備同樣濃度(通過蛋白酶活性測定)的野生型GG36和GG36-S24C，并在4℃下將各溶液與50mM DTT在100mM Tris-HCl(pH8.6)中混合。將不含酶而含有50mM DTT的10mM Tris-HCl(pH8.6)用作對照物。應用DTT分裂GG36-S24C二聚體中存在的任何二硫鍵。
用NaOH將脫脂奶調節到pH為10～10.3，取180μl等分樣與20μl適當的酶溶液(加有或未加DTT的GG36以及加有或未加DTT的GG36-S24C)組合至濃度為2、4或8ppm。也應用加有和未加DTT的對照物。然后將這些混合物置于96孔微量滴定板中并在37℃下振蕩。在動態微量板讀數儀(Molecular Devices,Inc.Mountain View,CA)中在650nm處每15分鐘測一次溶液的濁度達1小時。濁度的降低指示脫脂奶中蛋白質的水解。
結果示于圖2和3。圖2說明S24C單體的性能等于GC36單體的性能。這是必要的，因為在相同條件下即兩種情況下不存在或存在DTT時，不可能對S24C二聚體測試S24L單體。因此，如圖3中所示，當不存在DTT時，將S24C二聚體與GC36單體比較。在實驗過程中GG36-S24C二聚體的性能一直優于GG36單體。尤其值得注意的是將該二聚體達到特定的濁度降低程度所需時間與GG36野生型達到相同的濁度降低程度所需時間進行比較。例如，圖3中在15分鐘時，2ppm濃度的GG36-S24C二聚體導致濁度降低約20％。GG36野生型酶達到濁度降低20％所需的時間大約是它的2倍，例如約30分鐘。該對脫脂奶的效應持續見于該二聚體和野生型單體的比較。
實施例4蛋白酶二聚體、突變型單體和野生型酶在角蛋白水解中的比較在角蛋白水解分析中測試實施例1和2中獲得和純化的GG36-S24C二聚體并與GG36單體比較。制備同樣濃度的野生型GG36和GG36-S24C，并在4℃下與50mM DTT在100mM Tris-HCl(pH8.6)中組合。將不含酶而含有50mM DTT的10mM Tris-HCl(pH8.6)用作對照物。
將牛蹄和角的角蛋白粉(ICN Biomedicals Inc.,Cat#90211)懸浮于100mM pH10.3的碳酸鈉緩沖液并強烈攪拌15分鐘。在24孔板的各孔中放入1.5ml角蛋白溶液，添加15μl不同濃度(0.8,0.4,0.2,0.1或0.0mg酶/ml)的酶溶液至最終濃度8、4、2和0ppm蛋白質。在室溫下振蕩該混合物，在2小時期間每30分鐘從各孔取兩份15μl的等分樣。將各等分樣放入96孔微量滴定板上的15μl試劑A(20∶1的0.25M硼酸鹽和2.5M NaOH)，并與15μl濃度為3.5mg/ml的TNBS混合。在室溫下振蕩該微量滴定板達10分鐘，再添加230μl試劑B(105.52mg Na2SO3于200ml pH4.0的0.212M磷酸鹽中)。在動態微量板讀數儀(MolecularDevices,Inc.,Mountain View,CA)上讀取405nm處的吸光度以測定每孔中通過角蛋白水解而釋放的游離氨基的量。
結果示于圖4和5。
權利要求
1．由很多單體單元構成的酶多聚體，它包括具有酶活性的第一種單體單元和具有酶活性的第二種單體單元，其中所述第一種單體單元和所述第二種單體單元中的每種都包括半胱氨酸殘基，并且所述半胱氨酸殘基通過二硫鍵相互以共價鍵結合，致使所述第一種單體單元與所述第二種單體單元以共價鍵連接。
2．權利要求1的酶多聚體，其中所述酶多聚體中所述第一種單體單元和第二種單體單元得自具有酶活性的前體酶。
3．權利要求2的酶多聚體，其中所述第一種或第二種單體單元與其相應的前體酶的不同之處在于其中取代或添加一個半胱氨酸殘基。
4．權利要求2的酶多聚體，其中所述前體酶包括水解酶、氧化還原酶、轉移酶、裂合酶或連接酶。
5．權利要求4的酶多聚體，其中所述第一種或第二種單體包括蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、β-半乳糖苷酶、纖維素酶、乳糖酶、聚半乳糖醛酸酶、β-葡糖淀粉酶、酯酶或半纖維素酶。
6．權利要求4的酶多聚體，其中所述第一種或第二種單體包括過氧化物酶、氧化酶、漆酶、葡糖氧化酶或木質素酶。
7．權利要求4的酶多聚體，其中所述第一種或第二種單體包括NADH還原酶或2,5DKG還原酶。
8．權利要求1的酶多聚體，其中所述第一種或第二種單體包括得自芽孢桿菌屬的蛋白酶。
9．權利要求1的酶多聚體，其中所述芽孢桿菌屬包括遲緩芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌。
10．權利要求3的酶多聚體，其中所述前體酶包括得自芽孢桿菌屬的蛋白酶。
11．權利要求10的酶多聚體，其中所述芽孢桿菌屬包括遲緩芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌。
12．生產酶多聚體的方法，它包括(a)通過在前體酶中添加或取代一個半胱氨酸殘基而制備突變型酶；(b)制備包括半胱氨酸殘基的第二種酶；以及(c)將步驟(a)的突變型酶與步驟(b)的所述第二種酶在一定條件下混合，在這種條件下能在所述突變型酶的添加的或取代的半胱氨酸殘基與所述第二種酶中的所述半胱氨酸殘基之間形成二硫鍵。
13．權利要求11的組合物，其中所述單體包括蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶、脂肪酶、酯酶、半纖維素酶、氧化還原酶、水解酶、氧化還原酶(anoxid-redactase)、轉移酶、裂合酶或連接酶。
14．權利要求12的組合物，其中所述單體包括蛋白酶。
15．權利要求13的組合物，其中所述單體包括得自芽孢桿菌屬的蛋白酶。
16．權利要求14的組合物，其中所述芽孢桿菌屬包括遲緩芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌。
17．包括權利要求1的多聚酶的洗滌劑組合物。
18．權利要求16的洗滌劑組合物，其中所述多聚酶包括蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、脂肪酶、木聚糖酶或其混合物。
19．處理織物的方法，它包括將合適的織物組分與包括α-淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶或酯酶的權利要求1的多聚酶接觸。
20．液化淀粉的方法，它包括將權利要求1的多聚酶組分與淀粉溶液接觸，其中所述多聚酶包括α-淀粉酶、纖維素酶、酯酶或半纖維素酶。
21．處理紙漿和紙的方法，它包括將權利要求1的多聚酶組分與紙漿混合物接觸，其中所述多聚酶包括纖維素酶、半纖維素酶、脂肪酶或酯酶。
全文摘要
提供了由很多單體單元構成的酶多聚體,它包括具有酶活性的第一種單體單元和具有酶活性的第二種單體單元,其中第一種單體單元和第二種單體單元中的每種都包括半胱氨酸殘基,并且各種單體單元的半胱氨酸殘基通過二硫鍵而相互以共價鍵結合,致使第一種單體單元與第二種單體單元以共價鍵連接。
文檔編號C12N9/00GK1215429SQ97193516
公開日1999年4月28日 申請日期1997年2月17日 優先權日1996年3月29日
發明者R·R·博特, C·帕奇, S·吳 申請人:金克克國際有限公司