專利名稱：一種低溫脂肪酶及其編碼基因與生產方法
技術領域：
本發明涉及酶基因工程和酶工程領域中一種脂肪酶及其編碼基因與生產方法，特別涉及一種低溫脂肪酶及其編碼基因與生產方法。
背景技術：
脂肪酶(Lipase，EC 3.1.1.3，甘油酯水解酶)是一種特殊的水解酶，可分解脂肪、催化分解三酸甘油酯，產生甘油酯、游離脂肪酸和甘油。由于具有不需要輔酶就能催化正逆反應的優點，近些年來，脂肪酶作為類脂化合物合成分解和酯交換的催化劑，已廣泛應用于油脂水解、食品風味和香味的改進、皮革絹紡脫脂、生物柴油制備及添加于洗滌劑中以提高去污能力等[陳清馥，生物技術，242-44，1992；Arnold等，乳品科學雜志(Jour of Dairy Science)581127，1975；Carasik德國專利German patent 2109-119，1970；Suzuki，美國專利US Patent 6,306,813，2001年10月23日]。
生物柴油是由動植物油脂與一些短鏈醇發生轉酯反應生成的脂肪酸酯類物質，是一種新型的無環境污染的可再生能源。生物柴油的生產方法有化學法和生物法，化學法使用的催化劑包括酸催化劑和堿催化劑，容易造成二次污染，而生物法利用酶催化，具有反應條件溫和、對環境友好、反應過程簡單易控等優點；因此酶法生產生物柴油的研究已受到廣泛的關注。由于酶法合成生物柴油一般是在有機溶劑中進行，考慮到反應底物和產物的易揮發性，在低溫條件下進行酶反應更加有利，并且也可同時改善生物柴油的特性(Juan等，EP1331260，2003)。
在洗滌行業，我國的洗滌方法是以低溫洗滌為主，近來為了節省能源，歐美國家也出現了洗滌溫度低溫化的傾向，中溫脂肪酶由于在低溫條件下酶活低，效率差，達不到最佳應用效果，只有增加用量才能達到最佳應用效果。因此理想的洗滌劑用脂肪酶是在低溫下也能充分發揮作用的脂肪酶。
低溫脂肪酶的最適酶活溫度一般在40℃以下，它具有最適酶活溫度低，在低溫下具有更高的催化效率等特點。因而在洗滌劑、生物柴油制備等工業上應用有著中溫脂肪酶無法取代的優越性。
脂肪酶已從多種不同的微生物中分離(Jaeger等，FEMS Microbiol.Rev.1529-63，1994)，已有一些來自細菌的低溫脂肪酶，如嗜冷菌Psychrobacterimmobilis產生的脂肪酶，最適溫度為55℃[Arpigny等，Biochim.Biophys.Acta1171331-333，1993]；假單胞菌Pseudomonas sp.B11產生的脂肪酶最適溫度為45℃(Choo等，Appl Environ Microbiol 64486-491，1998.)；嗜冷菌Moraxella TA144.產生的脂肪酶最適溫度為35℃[Feller等，Gene 102111-115，1991]；但目前報道的低溫脂肪酶熱穩定性較差。
關于脂肪酶基因已有專利和文獻報道。如Rey等報道了Fusarium venenatum的脂肪酶基因(美國專利US Patent 6,432,898，2002年8月13日)；Lin等報道了Pseudomonas pseudoalcaligenes的脂肪酶基因(美國專利US Patent 5,766,913，1998年6月16日)；CLAUDIA等報道了Candida rugosa的脂肪酶基因(歐洲專利WO9914338，1999年3月25日)；HARUMI等報道了Pseudomonas sp.的脂肪酶基因(歐洲專利，EP0812910，1997年12月17日)；YUJI等報道了Geotrichumcandidum的脂肪酶基因(日本專利，JP2174680，1990年6月6日)。
發明創造內容本發明的目的是提供一種在低溫條件下具有良好的活性和穩定性的低溫脂肪酶及其編碼基因。
一種低溫脂肪酶，是具有序列表中SEQ ID №2氨基酸殘基序列的蛋白質或與序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列具有至少80％同源性且具有與SEQ ID №2相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白質。
所述SEQ ID №2來源于低溫微球菌(Micrococcus antarcticus)T2(AS1.2372)，由404個氨基酸殘基組成。
所述由SEQ ID №2衍生的蛋白質為將SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №2相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白質，優選為與SEQ ID №2具有至少90％同源性的蛋白質。
低溫脂肪酶的編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有80％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列，其中，優選為與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。
序列表中的SEQ ID №1的DNA序列由1215個堿基組成，該基因的開放閱讀框架(ORF)為自5’端第1到第1212位堿基。
含有本發明基因的表達載體和細胞系均屬于本發明的保護范圍，利用現有分子生物學的方法可以得到不同的表達載體和細胞系，如重組質粒pLIPP(物理圖譜如圖5所示)和工程菌大腸桿菌DH5αLIPP。
本發明的另一個目的是提供一種制備低溫脂肪酶的方法。
本發明所提供的制備低溫脂肪酶的方法，是通過培養低溫微球菌(Micrococcusantarcticus)或含有本發明的低溫脂肪酶編碼基因的工程菌獲得低溫脂肪酶。
所述低溫微球菌可為Micrococcus antarcticus中的不同低溫微球菌菌株，優選為菌株Micrococcus antarcticus T2(AS1.2372)。所述工程菌為含有本發明低溫脂肪酶編碼基因的大腸桿菌或芽孢桿菌，優選為大腸桿菌DH5αLIPP。
生產本發明低溫脂肪酶的培養基，可采用包括碳源、氮源和無機鹽在內的通常用于培養細菌的培養基；培養條件也應該是培養工程菌的出發菌的條件，即只要是適合于產生本發明的低溫脂肪酶即可，通常情況下，培養溫度為10-40℃，pH為5-10，培養時間為8-80小時，其中優選的條件是培養溫度為20-35℃，pH為6-9，培養時間36-72小時。由此產生的脂肪酶分泌在發酵液中，通過分離、精制等常規獲得酶的方法，從上述的培養液中收集低溫脂肪酶，即通過離心或過濾法獲得發酵上清液，通過鹽析、柱層析等方法純化酶制品。
本發明低溫脂肪酶的分子量為41000道爾頓，一級結構與已知的脂肪酶不同，與其它已報道的脂肪酶的氨基酸序列相比，相似性小于45％；利用已知的蛋白質化學標準方法測定本發明低溫脂肪酶的基本特性，證實其在低溫條件下具有良好的活性和穩定性，最適作用溫度為35℃，pH為8，可廣泛應用于洗滌劑、生物柴油制備等工業領域。
圖1為低溫脂肪酶的最適酶活溫度曲線圖2為低溫脂肪酶的最適pH曲線圖3為低溫脂肪酶的熱穩定性曲線圖4為低溫脂肪酶的pH穩定性曲線圖5為重組質粒pLIPP的物理圖譜具體實施方式
實施例1、低溫脂肪酶基因的克隆(1)低溫微球菌(Micrococcus antarcticus)T2(AS1.2372)總DNA的提取采用從南極分離的低溫微球菌(Micrococcus antarcticus)T2(AS1.2372)(劉洪燦等，系統與環境微生物國際雜志IJSEM，50715-719，2000)，取其新鮮濕菌體20克，懸于10毫升50mM Tris緩沖液中(pH 8.0)，加入少量溶菌酶和8毫升0.25mM EDTA(pH 8.0)，混勻后于37℃放置20min，之后加入2毫升10％SDS，55℃放置5min，分別用等體積酚、氯仿各抽提一次，取最后一次的上清溶液，加入2倍體積乙醇，回收DNA，分別用70％和無水乙醇洗，沉淀溶于0.5毫升TE緩沖液(pH 8.0，10mM Tris，1mMEDTA)，加入10mg/ml RNase3μl，37℃保溫1小時，分別用等體積酚、氯仿各抽提一次，上清液加入2倍體積乙醇，回收DNA，分別用70％和無水乙醇洗，真空干燥，用去離子水溶解。DNA溶液的紫外分光光度計測定結果為A260/A280＝1.98，A260/A230＝2.18。
(2)低溫脂肪酶基因的克隆取上述總DNA溶液10μl(約50μgDNA)，用限制酶Sau3AI部分酶切，經瓊脂糖凝膠電泳，電洗脫回收2-6kbDNA片段。取2μl(5μg)Sau3AI酶解DNA片段與1μl(1μg)經BamHI酶解并脫磷酸化的質粒pUC18 DNA在20μl連接體系進行連接反應，其中含2μl(10×連接緩沖液)，1μl T4DNA連接酶，14μl水。連接體系在16℃反應16小時，轉化感受態大腸桿菌DH5α后，涂于含50ug/ml Amp(氨芐青霉素)，三丁酸甘油酯(Tributyrin)的LB固體培養基上。25℃培養36-48小時，菌落周圍有透明圈的即為陽性克隆。陽性克隆在Amp-LB培養基中25℃培養36小時，經活性測試具有低溫脂肪酶活性。對陽性菌落用堿法提取重組質粒，用各種限制酶水解重組質粒，根據電泳結果證實有DNA片段插入質粒，其大小約為4.0kb。含該DNA片段的重組質粒稱為pLIPP，含此重組質粒pLIPP的重組大腸桿菌稱為大腸桿菌DH5αLIPP。
實驗證明此重組質粒pLIPP可高頻轉化大腸桿菌表達低溫脂肪酶活性和抗氨芐性能。將重組質粒中的DNA插入片段用地高辛DNA標記檢測試劑盒標記，與低溫微球菌(Micrococcus antarcticus)T2的染色體DNA進行Southern blot DNA雜交實驗，證實重組質粒pLIPP中插入的DNA片段來自低溫微球菌(Micrococcusantarcticus)T2(AS1.2372)的染色體DNA。
采用Sanger雙脫氧法對此DNA片段進行了測序。測序結果顯示插入片段含有一個長1215bp的開放閱讀框架(ORF)，編碼一個由404個氨基酸組成的蛋白質。最高相似性同Pseudomonas sp.的脂肪酶基因(45％)。
實施例2、培養低溫微球菌(Micrococcus antarcticus)T2(AS1.2372)生產低溫脂肪酶(1)低溫脂肪酶的發酵制備于250ml三角燒瓶中，加入100ml液體發酵培養基，2％(v/v)接種量接入低溫微球菌(Micrococcus antarcticus)T2(AS1.2372)，置20℃、220rpm旋轉搖床振蕩培養48小時。以稀釋的培養液在550nm下的OD值測定菌體的生長，并測定酶活力。產酶發酵培養基(g/L)蛋白胨，5；酵母提取物，2.5；NaCl，10；K2HPO4，1；CaCl2，0.7；MgSO4，0.2；橄欖油，10；pH7.0-7.2。實驗結果表明，該菌株最適生長溫度為17℃，適合于在溫度較低的環境中生長。
(2)低溫脂肪酶的純化①粗酶液的制備將步驟(1)中的1升發酵液于5000×g條件下離心15分鐘，棄掉沉淀，上清液中加入硫酸銨使其達到65％的飽和度，不斷攪拌在4℃過夜，之后，12000×g的條件下離心20分鐘。棄掉上清，沉淀溶于緩沖液A中(50mM K2HPO4-KH2PO4，pH 7.0)，并在緩沖液A中透析過夜，用于進一步的酶純化過程。
②DEAE-纖維素層析透析過的酶液被加到預先用緩沖液A平衡好的DEAE-纖維素柱(2.5×50cm)。然后用500ml 0.2-1M的線性KCl梯度洗脫DEAE-纖維素柱，以5ml每管收集流出液。合并活性部分，然后用蔗糖濃縮。最后，濃縮液用緩沖液B(50mM K2HPO4-KH2PO4，pH 6.6，5mM 2-mercaptoethanol，1mM PMSF，2.5M KCl)透析過夜。
③Sephadex G200柱層析濃縮酶液加至預先用緩沖液A平衡過的Sephadex G200層析柱(1.5cm×100cm)上，用平衡緩沖液洗脫并分部收集，流速12ml/h。
粗酶液經鹽析，DEAE柱層析，分子篩柱層析后，比活力由原來的11.06U/mg提高到682U/mg，純化了62倍。
(3)低溫脂肪酶的特性用底物p-硝基苯丁酸酯(p-nitrophenylbutyrate)測定酶活力，酶的活力測定通過在25℃下，酶水解p-硝基苯丁酸酯(p-nitrophenylbutyrate)為底物釋放出的p-硝基酚(p-nitrophenol)量來確定。反應緩沖體系為0.1M磷酸納緩沖液(pH7.25)，并含有0.1MNaCl，酶活力單位定義為每分鐘釋放1umol p-硝基酚(p-nitrophenol)所需的酶量。
①最適酶活溫度標準反應條件下，在給定的溫度條件下測定酶活性，結果如圖1所示，表明該酶最適溫度為35℃，50℃的酶活力為最適酶活的20％。
②最適pH在標準反應條件下(25℃)，以0.5mmoL p-硝基苯丁酸酯(p-nitrophenylbutyrate)為底物，于50mmoL/L不同緩沖液的條件下測定酶活性，結果如圖2所示，表明該酶最適pH為8.0，在pH6.6-pH9范圍內，該酶保持其最高酶活力的60％以上。
③熱穩定性將酶液分別在不同溫度下如，10℃，20℃，30℃，40℃，50℃，60℃，保溫30min，測定酶活力。結果如圖3所示，表明該酶在30℃下保持很穩定，而在40℃活力開始下降，50℃酶失活較快，在60℃，30min后，喪失全部酶活。
④pH穩定性將酶液與pH4.0-12.0的緩沖液混合，25℃放置30min，測定酶活力，結果如圖4所示，表明酶在pH5.0-10.5的范圍內比較穩定。
實施例3、重組菌E.coli DH5αLIPP生產的低溫脂肪酶的特性重組菌E.coli DH5αLIPP的菌體懸于50mM磷酸緩沖液(pH7)中，利用超聲波破碎細胞，離心上清液為低溫脂肪酶的粗酶液。上清酶液經離子交換柱層析，羥基磷灰石吸附柱層析和PAGE制備電泳等步驟進行純化。利用已知的蛋白質化學標準方法測定此低溫脂肪酶的基本特性，結果表明該低溫脂肪酶的特性與嗜冷菌Micrococcus antarcticus T2生產的低溫脂肪酶的特性一致，最適作用溫度為35℃，作用pH為8，可水解脂肪產生脂肪酸和甘油。用SDS-PAGE測得的該低溫脂肪酶的分子量為41000道爾頓，與理論上推算的分子量(43800道爾頓)相似。
序列表<160>2<210>1<211>1215<212>DNA<213>Micrococcus antarcticus<400>1atggtgttta tcgtcaatct tttctcctgc accttatctg aaaccacggt tagctcaata 60aaatctgaag ctacggttag ctcaacattt actgccgtca cggccctgca attggtggct 120gagggtaagt tgcagtcggc gaagggtttc ggtggtggta cgattcacta cccaaccctc 180gcggccgaag caccctggtg gacgccgggc caaggccatg gttacgaggc gatcacctac 240ggctggctgg tcggcgaact gctgcgccgc gccgatgggc gtgggcctgg tctgttaggc 300gctattgccg tggttcctgg ttacgtttct tacgagaact ctatcaagtg gtggggaccg 360cgtctggctt cttggggctt tgtcgttgca cggccgttgg gcctggactt tcatgtgggc 420ctggcggatg aagagtttta tcgtgttgcc catatagcgc gcagcaaagc caatgcagca 480ctagataaca ttgctgatga caccgtcggc agtatagatc ctaagcggtt gggcgctatt 540ggctggtcag gtggcggcgg cgcgcttaaa ctggcaacgg agcgcagcac agtacgagcc 600attttgacca gtactaataa acctgaatgg cgacgcttcg ataaattctt atgtgcctgc 660gaggatgacc ggattgctga gactaagaaa tatgccaacg cgttttataa aaatgccgac 720atgctcgaag agttgacccg tgaacacagt atcgggccgg ataaaacatt attgacacaa 780actcggtttg gcttggggtg cttggatcaa ccgcaagcag gggttaaaat tcattttgaa 840gagtaccttg atcaaaccca tggatttatc aatttgacgc cagtttcaca taaggcgaga 900gcaaatctga ttcagatgcc taatgccaca ttcggccttg gcccgcgtgc ttttgggcat 960cctggtgcag gtggatcggt aggttttgcc gaccccgaac acgatgtagc gtttggtttc1020gtgactaata cattggggcc ttatgtagtt gagtttaaaa gccgtcatcc ctcattttat1080gcatataaag atggattggt gctgactgga aatgacgtcg actatgtgac tgattactat1140gcaacaaagc atgctgtaca tttagatgat ccacgtgcac agaagttggt cggaatattg1200gccggttgtc tgtaa 1215
<210>2<211>404<212>PRT<213>Micrococcus antarcticus<400>2Met Val Phe Ile Val Asn Leu Phe Ser Cys Thr Leu Ser Glu Thr Thr1 5 10 15Val Ser Ser Ile Lys Ser Glu Ala Thr Val Ser Ser Thr Phe Thr Ala20 25 30Val Thr Ala Leu Gln Leu Val Ala Glu Gly Lys Leu Gln Ser Ala Lys35 40 45Gly Phe Gly Gly Gly Thr Ile His Tyr Pro Thr Leu Ala Ala Glu Ala50 55 60Pro Trp Trp Thr Pro Gly Gln Gly His Gly Tyr Glu Ala Ile Thr Tyr65 70 75 80Gly Trp Leu Val Gly Glu Leu Leu Arg Arg Ala Asp Gly Arg Gly Pro85 90 95Gly Leu Leu Gly Ala Ile Ala Val Val Pro Gly Tyr Val Ser Tyr Glu100 105 110Asn Ser Ile Lys Trp Trp Gly Pro Arg Leu Ala Ser Trp Gly Phe Val115 120 125Val Ala Arg Pro Leu Gly Leu Asp Phe His Val Gly Leu Ala Asp Glu130 135 140Glu Phe Tyr Arg Val Ala His Ile Ala Arg Ser Lys Ala Asn Ala Ala145 150 155 160Leu Asp Asn Ile Ala Asp Asp Thr Val Gly Ser Ile Asp Pro Lys Arg165 170 175Leu Gly Ala Ile Gly Trp Ser Gly Gly Gly Gly Ala Leu Lys Leu Ala180 185 190Thr Glu Arg Ser Thr Val Arg Ala Ile Leu Thr Ser Thr Asn Lys Pro195 200 205
Glu Trp Arg Arg Phe Asp Lys Phe Leu Cys Ala Cys Glu Asp Asp Arg210 215 220Ile Ala Glu Thr Lys Lys Tyr Ala Asn Ala Phe Tyr Lys Asn Ala Asp225 230 235 240Met Leu Glu Glu Leu Thr Arg Glu His Ser Ile Gly Pro Asp Lys Thr245 250 255Leu Leu Thr Gln Thr Arg Phe Gly Leu Gly Cys Leu Asp Gln Pro Gln260 265 270Ala Gly Val Lys Ile His Phe Glu Glu Tyr Leu Asp Gln Thr His Gly275 280 285Phe Ile Asn Leu Thr Pro Val Ser His Lys Ala Arg Ala Asn Leu Ile290 295 300Gln Met Pro Asn Ala Thr Phe Gly Leu Gly Pro Arg Ala Phe Gly His305 310 315 320Pro Gly Ala Gly Gly Ser Val Gly Phe Ala Asp Pro Glu His Asp Val325 330 335Ala Phe Gly Phe Val Thr Asn Thr Leu Gly Pro Tyr Val Val Glu Phe340 345 350Lys Ser Arg His Pro Ser Phe Tyr Ala Tyr Lys Asp Gly Leu Val Leu355 360 365Thr Gly Asn Asp Val Asp Tyr Val Thr Asp Tyr Tyr Ala Thr Lys His370 375 380Ala Val His Leu Asp Asp Pro Arg Ala Gln Lys Leu Val Gly Ile Leu385 390 395 400Ala Gly Cys Leu40權利要求
1.一種低溫脂肪酶，是具有序列表中SEQ ID №2氨基酸殘基序列的蛋白質或與序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列具有至少80％的同源性且具有與SEQ ID №2相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白質。
2.根據權利要求1所述的低溫脂肪酶，其特征在于所述低溫脂肪酶是具有序列表中SEQ ID №2氨基酸殘基序列的蛋白質。
3.根據權利要求1所述的低溫脂肪酶，其特征在于所述由SEQ ID №2衍生的蛋白質是將SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №2相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白質。
4.一種低溫脂肪酶的編碼基因，它是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有80％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。
5.根據權利要求4所述的基因，其特征在于所述低溫脂肪酶的編碼基因是序列表中的SEQ ID №1。
6.含有權利要求4所述的基因的表達載體和細胞系。
7.根據權利要求6所述的表達載體和細胞系，其特征在于所述表達載體為重組質粒pLIPP；所述細胞系為大腸桿菌DH5αLIPP。
8.一種制備低溫脂肪酶的方法，是通過培養低溫微球菌(Micrococcusantarcticus)或含有低溫脂肪酶編碼基因的工程菌獲得低溫脂肪酶。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于所述低溫微球菌為嗜冷菌(Micrococcus antarcticus)T2。
10.根據權利要求8所述的方法，其特征在于所述工程菌為含有低溫脂肪酶的編碼基因的大腸桿菌或芽孢桿菌。
全文摘要
本發明公開了一種低溫脂肪酶及其編碼基因與生產方法。一種低溫脂肪酶，是具有序列表中SEQ ID №2氨基酸殘基序列的蛋白質或與序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列具有至少80％的同源性且具有與SEQ ID №2相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白質。該低溫脂肪酶的編碼基因是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有80％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。本發明的低溫脂肪酶在低溫條件具有良好的活性和穩定性，最適作用溫度為35℃，作用pH為8，可廣泛應用于洗滌劑、生物柴油制備等工業領域。
文檔編號C12N9/18GK1611600SQ200310101798
公開日2005年5月4日 申請日期2003年10月28日 優先權日2003年10月28日
發明者劉洪燦, 馬延和, 薛燕芬, 周培謹 申請人:中國科學院微生物研究所