一種區位選擇性細菌硝基還原酶基因、其重組酶及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種突變型細菌硝基還原酶基因、其重組酶及其應用，屬于酶工程領域。本發明提供的大腸桿菌硝基還原酶NfsB組合突變體T41L/N71S/F124W可顯著改變對多硝基底物硝基還原的區域選擇性，催化重要的工業原材料2,4-二硝基甲苯和2,4-二硝基苯甲醚專一性還原生成相應的2-NHOH產物。本方法具有產物純度高，反應條件溫和、易于放大等優勢，且可根據目標化合物的結構特點，對酶進行理性設計，改變硝基還原的區域選擇性，因此在羥氨化合物的生產中具有很好的應用前景。
【專利說明】一種區位選擇性細菌硝基還原酶基因、其重組酶及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于酶工程領域，具體涉及一種突變型硝基還原酶的基因，以及含有該基 因的重組酶，及其在硝基區位選擇性還原中的應用。
【背景技術】
[0002] 芳香羥胺（又名芳胺）是一種重要的有機合成中間體，被廣泛用于阻聚劑、抗氧 齊IJ、農藥、醫藥、化妝品等的合成。某些芳香羥胺本身也具有很高的藥理及生理活性。目前 芳香羥胺的制備主要通過選擇還原芳香硝基化合物來實現，常采用的方法有催化氫轉移還 原法、金屬選擇還原法、電化學還原法等。然而這些制備方法對羥氨還原的選擇性比較差， 中間體芳香羥胺迅速轉化為相應的胺，且容易生成偶氮等一系列副產物。此外，化學還原羥 氨在反應條件上也比較苛刻，需要使用危險的高壓裝置、易燃的氫氣、有毒的重金屬或有害 的化學試劑等。相對于傳統的化學制備方法，生物催化法除具有高效、特異的催化效率外， 其最大的優勢在于無可比擬的化學選擇性和區域選擇性。同時，生物催化的反應條件溫和， 可在常溫常壓、適宜pH的水相中進行反應，這與"可持續發展" "綠色化學"等工業發展目 標相符。
[0003] 硝基還原酶是一類依賴于FMN或FAD的細胞質酶，可利用NAD (P) Η催化硝基還原， 經亞硝基中間產物最終生成羥氨或氨基產物。利用硝基還原酶作為生物催化劑還原芳香硝 基化合物生成相應的羥胺產物的還原過程，越來越受到人們的關注。雖然多數硝基還原酶 可有效的實現單硝基化合物或無區位選擇性差異的多硝基化合物的還原，但對于多硝基化 合物的專一選擇性還原卻難以實現。目前絕大多數多硝基化合物上硝基都存在位置差異， 以重要的工業原材料2, 4-二硝基甲苯（24DNT)為例，硝基還原酶可催化該底物生成2-羥 氨-4-硝基甲苯（2ΗΑΝΤ)或4-羥氨-2-硝基甲苯（4ΗΑΝΤ)。作為同分異構體的2ΗΑΝΤ和 4ΗΑΝΤ，由于其羥氨基團取代位置的不同，在醫藥、農藥合成及應用上也互不相同。但酶催化 生成的羥氨混合產物由于化學性質相近，很難進行下一步分離純化得到單一純品，從而限 制了硝基還原酶在羥氨生物合成中的應用。若能通過對酶分子的改造，使其在底物催化過 程中專一性生成某一種目的還原產物，將大大減少后期分離純化成本且綠色環保，有利于 硝基還原酶在羥氨生物合成中的應用和開發。
[0004] 因此，尋找開發具有不同專一還原選擇性的硝基還原酶在羥氨化合物生物合成中 具有顯著的商業價值和應用前景。
【發明內容】
[0005] 為獲得專一區位選擇性的硝基還原酶，本發明通過蛋白質結構及分子對接模擬分 析，發現124的氨基酸殘基通過與底物側鏈基團的相互作用從而影響底物在活性中心的定 位。若將124位的苯丙氨酸（Phe)突變為色氨酸（Trp)，可顯著改變酶的區域選擇性。與 野生型硝基還原酶相比，突變體T41L/N71S/F124W對重要的工業原材料2, 4-二硝基甲苯 (240階')和2,4-二硝基苯甲醚（240隱吣的還原由4-順0!1產物轉為2-順0!1產物，實現2-勵 2 的專一性還原。本文所述T41L、N71S、F124W的含義分別為：將41位的蘇氨酸（Thr)突變 為亮氨酸（Leu)(簡寫為T41L)，將71位的天冬酰胺（Asn)突變為絲氨酸（Ser)(簡寫為 N71S)，將124位的苯丙氨酸（Phe)突變為色氨酸（Trp)(簡寫為F124W)。
[0006] 目前硝基還原酶的生理底物和催化機制尚不明確，尤其是針對于外源的硝基芳香 化合物而言，無法確定該底物在酶活性口袋內的正確定位，從而無法確定與側鏈基團相互 作用的關鍵氨基酸以及其是如何影響底物在活性口袋內的定位。即使單點突變對酶的區位 選擇性有一定程度的改變，但很難達到專一性區位選擇性。通過對這一問題的分析，可能的 原因是酶對底物的結合和定位通常不是由某一個氨基酸所決定的，而是通過活性口袋內的 多個氨基酸共同作用實現的。同時對這些位點的突變具有很高的風險性和不確定性，雖然 在一定程度上可實現區位選擇性的改變，但可能引起酶催化活性的降低甚至喪失。針對這 一問題，本發明在單點突變的基礎上，進一步將有益突變位點進行組合突變，考察其對選擇 性實現的協同作用。
[0007] 本發明具體涉及一種突變型硝基還原酶的基因，以及含有該基因的重組表達載體 和重組表達轉化體，其重組酶和該重組酶的制備方法，以及該突變型硝基還原酶或含有該 突變型基因重組表達轉化體作為催化劑在羥氨化合物生物合成中的應用。
[0008] 本發明的一方面在于提供一種突變型硝基還原酶的基因，命名為組合突變體 T41L/N71S/F124W,其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
[0009] 本發明的另一目的是提供上述突變型硝基還原酶基因編碼的蛋白，氨基酸序列如 SEQ ID N0:2 所示。
[0010] 本發明的另一目的是提供含有該突變型硝基還原酶基因的重組表達載體及其重 組表達轉化體。以及編碼所述硝基還原酶突變體的DNA序列的基因工程菌或轉基因細胞 系。
[0011] 本發明的另一目的是提供一種重組硝基還原酶的制備方法，其步驟包括：培養上 述含有該突變型硝基還原酶基因的重組表達轉化體，從培養物中純化得到突變型細菌硝基 還原酶的蛋白。
[0012] 上文所述的制備方法，其更具體的技術方案如下：根據大腸桿菌（Escherichia coli)硝基還原酶NfsB基因 NCBI編碼：NC_000913,設計定點突變的突變引物，以攜帶硝基 還原酶基因的克隆載體為模板進行定點突變構建突變體；以pET-28a或能表達該酶的載體 為表達載體，將重組質粒轉化到大腸桿菌BL21 (DE3)細胞或能表達該酶的宿主細胞，挑選 驗證后的陽性單克隆進行發酵培養。經融合表達純化得到突變型硝基還原酶蛋白。
[0013] 本發明的另一目的是提供上述技術方案中所述的突變型硝基還原酶基因編碼 的蛋白或重組表達轉化體，二者作為催化劑在催化硝基還原，在藥物激活劑代謝、芳香羥 胺化合物的生物合成以及硝基類環境污染物生物代謝等領域的應用。組合突變體T41L/ 階15作1241可高效還原重要的工業原材料2,4-二硝基甲苯（240階')和2,4-二硝基甲醚 (24DNAN)，可專一選擇性生成2-NH0H產物。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0014] 圖1. HPLC分析比較野生型及突變體NfsB-T41L/N71S/F124W蛋白對2, 4-二硝基 甲苯（24DNT)還原的區域選擇性。由圖中所示內容可知，突變體NfsB-T41L/N71S/F124W對 底物24DNT還原的區位選擇性與野生型NfsB不同，該突變體在24DNT還原中由4位硝基 選擇性轉為2位硝基基團，生成2-羥氨-4-硝基甲苯（2HANT)。因此，突變體NfsB-T41L/ N71S/F124W可作為生物催化劑用于羥氨化合物的生物合成。
[0015] 圖2. HPLC分析比較野生型及突變體NfsB-T41L/N71S/F124W蛋白對2, 4-二硝基 苯甲醚（24DNAN)還原的區域選擇性。由圖中所示內容可知，突變體NfsB-T41L/N71S/F124W 對底物24DNAN還原的區位選擇性與野生型NfsB不同，該突變體可專一性還原底物中的2 位硝基基團，生成2-羥氨-4-硝基苯甲醚（2HANAN)。因此，突變體NfsB-T41L/N71S/F124W 可作為生物催化劑用于羥氨化合物的生物合成。
【具體實施方式】
[0016] 下述非限定性實施例可以使本領域的普通技術人員更全面地理解本發明，但不以 任何方式限制本發明。
[0017] 本發明中設計使用的重疊延伸PCR引物序列：
[0018] nfsB-WT-F ：5, ~GGAATTCCATATGGATATCATTTCTGTCGCCTTAAAG~3, ；SEQ ID NO:3
[0019] nfsB-WT-R ：5, ~GGAATTCTTACACTTCGGTTAAGGTGATGTT~3, ；SEQ ID NO:4
[0020] nfsB-T41L-F :5, -AGCCCATCCAGCCTGAACTCCCAGCCGTGGCAT-3, ；SEQ ID N0:5
[0021] nfsB-T41L-R :5' -CTGGGAGTTCAGGCTGGATGGGCTGTATTGCA-3' SEQ ID N0:6
[0022] nfsB-N71S-F ：5, -ATGTGTTCAGCGAACGTAAAATGCTTGATG-3, ；SEQ ID NO:7
[0023] nfsB-N71S-R :5' -ATTTTACGTTCGCTGAACACATAATTACCGGCAG-3' SEQ ID N0:8
[0024] nfsB-F124W-F :5' -TCGCAAGTTCTGGGCTGATATGCACCGTAAAGATC-3' ；SEQ ID N0:9
[0025] nfsB-F124W-R :5' -TATCAGCCCAGAACTTGCGACCTTTATCGTTCG-3' SEQ ID N0:10
[0026] 實施例1突變型細菌還原酶NfsB-T41L/N71S/F124W基因獲取及表達載體構建
[0027] 1.野生型nfsB基因的克隆與克隆載體構建
[0028] 根據NCBI提供的E. coli K12菌株（Invitrogen)中nfsB基因序列，設計引物 (nfsB-WT-F ：5, ~GGAATTCCATATGGATATCATTTCTGTCGCCTTAAAG~3,, nfsB-ffT-R ：5, -GGAATT ￡TTACACTTCGGTTAAGGTGATGTT-3'），其中下劃線部分表示酶切位點對應的基因序列。利用 提取的E. coli K12基因組DNA為模版，進行PCR擴增。取10μ1 PCR反應產物跑瓊脂糖 凝膠電泳驗證，電泳條帶約650bp與nfsB基因大小一致。使用TaKaRaAgarose Gel DNA Purification Kit Ver. 3.0切膠回收上述電泳目的條帶，然后用EcoR I/Nde I雙酶切處理 回收產物，使用 TaKaRa DNA Fragment Purification Kit Ver. 3.0 將其純化，之后使用 DNA Ligation Kit Ver. 3.0中的連接酶，將純化后得到的目的產物與經EcoR I/Nde I雙酶切處 理的pET28a(+)空載體連接后，熱激轉化至E. coli DH5a感受態細胞中，涂布平板，37°C過 夜培養。挑選陽性菌落過夜37°C培養后提取質粒并送TaKaRa測序確認與nfsB基因 （Gene ID:945778)序列一致，驗證基因克隆成功，并將其命名為野生型nfsB基因，并將其對應的 陽性菌落和重組質粒分別命名為克隆菌E. coliDH5 a -nfsB-WT和質粒pET28a-nfsB-WT。
[0029] 2.突變型NfsB-T41L/N71S/F124W的基因獲取及表達載體構建
[0030] 過夜培養E. coliDH5 a -nfsB-WT克隆菌，提取pET28a-nfsB_WT重組質粒，以此為 模板構建突變體載體 pET28a-nfsB-T41L/N71S/F124W。
[0031] (1)首先以質粒 pET28a-nfsB-WT 為模板，使用引物 nfsB-WT-F 和 nfsB-F124W-R : 5' -TATCAGCCCAGAACTTGCGACCTTTATCGTTCG-3' 進行一次 PCR 反應，命名為 nfsB-F124W_l。 同樣以質粒 pET28a-nfsB-WT 為模板，使用引物 nfsB-WT-R 和 nfsB-F124W-F :5' -TCGCAAG TTCTGGGCTGATATGCACCGTAAAGATC-3'進行二次 PCR 反應，命名為 nf sB_F124W_2。其中引物 nfsB-F124W-F和nfsB-F124W-R中下劃線標記的為124位氨基酸突變位點對應的基因序列。 使用 TaKaRaMiniBestAgarose Gel DNA Extraction Kit Ver. 3.0,對于兩次 PCR 產物切膠 回收純化。以回收產物nfsB-F124W-l和nfsB-F124W-2作為模板，使用引物nfsB-WT-F和 nfsB-WT-R進行第三次重疊延伸 PCR，PCR產物使用 TaKaRa DNA Fragment Purification Kit Ver. 3. 0回收純化，其命名為nfsB-F124W。
[0032] (2)以步驟⑴獲得的nfsB-F124W為模板，使用引物nfsB-WT-F和nfsB-T41L-R : 5' -CTGGGAGTTCAGGCTGGATGGGCTGTATTGCA-3' 進行一次 PCR 反應，命名為 nfsB_T41L/ F124W-1。同樣以 nfsB-F124W 為模板，使用引物 nfsB-WT-R 和 nfsB-T41L-F :5' -AGCCCAT CCAGCCTGAACTCCCAGCCGTGGCAT-3，進行二次 PCR 反應，命名為 nfsB-T41L/F124W_2。其中 引物nfsB-T41L-F和nfsB-T41L-R中下劃線標記的為41位氨基酸突變位點對應的基因序 列。使用 TaKaRaMiniBestAgarose Gel DNA Extraction Kit Ver. 3.0,對于兩次 PCR 產物 切膠回收純化。以回收產物nfsB-T41L/F124W-l和nfsB-T41L/F124W-2作為模板，使用引 物nfsB-WT-F和nfsB-WT-R進行第三次重疊延伸PCR，PCR產物使用TaKaRa DNA Fragment Purification Kit Ver. 3.0 回收純化，其命名為 nfsB-T41L/F124W。
[0033] (3)以步驟（2)獲得的nfsB-T41L/F124W為模板，使用引物nfsB-WT-F和 nfsB-N71S-R ：5, ~ATTTTACGTTCGCTGAACACATAATTACCGGCAG~3,進行一次 PCR 反應，命名 為 nfsB-T41L/N71S/F124W-l。同樣以 nfsB-T41L/F124W 為模板，使用引物 nfsB-WT-R 和 nfsB-N71S-F :5' ~ATGTGTTCAGCGAACGTAAAATGCTTGATG~3,進行二次 PCR 反應，命名為 nfsB-T41L/N71S/F124W-2。其中引物 nfsB-N71S-F 和 nfsB-N71S-R 中下劃線標記的為 71 位氨基酸突變位點對應的基因序列。使用TaKaRaMiniBestAgarose Gel DNA Extraction Kit Ver. 3. 0,對于兩次PCR產物切膠回收純化。以回收產物nfsB-T41L/N71S/F124W-l和 nfsB-T41L/N71S/F124W-2作為模板，使用引物nfsB-WT-F和nfsB-WT-R進行第三次重疊延 伸 PCR，PCR 產物使用 TaKaRa DNA Fragment Purification Kit Ver. 3. 0 回收純化，獲得突 變體基因，其命名為nfsB-T41L/N71S/F124W基因，其序列信息為SEQ ID N0:1。
[0034] (4)將獲得的突變體基因 SEQ ID N0:1和pET28a(+)空載使用Nde I /EcoR I分 別進行雙酶切，使用TaKaRaAgarose Gel DNA Purification Kit Ver. 3.0切膠回收上述電 泳目的條帶，之后使用DNA Ligation Kit Ver. 3. 0中的連接酶，將純化后得到的目的產物 與經EcoR I/Nde I雙酶切處理的pET28a(+)載體連接后，熱激轉化至E. coli DH5a感受 態細胞中，涂布平板，37°C過夜培養。挑選陽性菌落過夜37°C培養后提取質粒并送TaKaRa 測序確認與SEQ ID NO: 1序列一致，驗證表達載體構建成功，并將其對應的陽性菌落和重組 質粒命名為克隆菌 E. coliDH5 a -nfsB-T41L/N71S/F124W 和質粒 pET28a-nfsB-T41L/N71S/ F124W。
[0035] 實施例2.細菌硝基還原酶突變體NfsB-T41L/N71S/F124W的表達純化
[0036] 1.硝基還原酶突變體NfsB-T41L/N71S/F124W的誘導表達
[0037] 將重組質粒pET28a-nfsB-T41L/N71S/F124W熱激轉化到大腸桿菌E. coli BL21(DE3)感受態細胞（Invitrogen)中，涂布平板，37°C過夜培養。挑取陽性克隆，并將其 命名為表達菌E. coliBL21 (DE3) -nfsB-T41L/N71S/F124W，再接種于LB液體培養基中（含 50yg/ml Kana)，37°C振蕩過夜。將種子培養液以1%接種量轉接至100ml LB擴大培養基 中（含5(^8/!1111(&11&)，371：搖床培養至00 6(|(|在0.4-0.6。加入終濃度為0.511111?了6于 30°C下誘導表達6h。培養結束后，發酵液于5000r/min離心lOmin收集菌體。
[0038] 2.硝基還原酶突變體NfsB_T41L/N71S/F124W的純化
[0039] 收集菌體用20mM磷酸鹽緩沖液（pH7. 4,含有500mMNaCl)進行重懸，利用高壓勻漿 破碎儀在低溫下進行破碎，12000r/min離心5min收集上清。
[0040] 樣品分離純化均使用AKTA purifier蛋白質快速層析系統（GE Healthcare)完 成，采用GE Healthcare FF HisTrap層析柱（即Ni柱）。首先用緩沖液A(20mM NaH2P04， 0. 5MNaCl，pH7.4)平衡Ni柱，將破碎后收集的蛋白上清樣品以lml/min的流速通過Ni 柱，使目的蛋白結合于Ni柱。待紫外基線平穩后，使用緩沖液B(elution buffer:20mM NaH2P04,0. 5MNaCl，250mM 咪唑，ρΗ7· 4)洗脫，洗脫梯度依次為 20mM，100mM，250mM 咪唑，每 個洗脫梯度洗脫體積為20個柱體積。分管收集每個梯度洗脫的流出液，對每管樣品分別進 行蛋白含量、活力以及SDS-PAGE分析。
[0041] 3.硝基還原酶突變體NfsB-T41L/N71S/F124W的SDS-PAGE電泳分析及 Western-Blotting 驗證
[0042] 利用SDS-PAGE電泳分析突變型硝基還原酶NfsB-T41L/N71S/F124W的分子量及其 純度，對照Marker選用低分子量標準蛋白。待電泳結束后，用考馬斯亮藍R-250染色3小 時以上，用脫色液（以乙醇：醋酸：水的體積比為1 :2 :17配制而成）震蕩脫色，觀察電泳結 果。
[0043] 電泳結果發現在分子量27kDa左右有一條明顯的誘導條帶。同時誘導條帶對應 蛋白在250mM咪唑洗脫組分得到富集，初步判斷該蛋白為突變體蛋白Nf sB-T41L/N71S/ F124W，其序列信息為SEQ ID N0:2。
[0044] 針對轉膜儀，采用半干法轉膜，轉膜緩沖液為48禮1^8,391111甘氨酸，20 (%甲醇， 0. 037% SDS，具體步驟如下：
[0045] 將SDS聚丙烯酰胺凝膠取下，置于轉膜緩沖液中平衡，剪裁一塊大小相同的PVDF 膜，將其放置于100%甲醇中激活10s，然后將膜用去離子水清洗掉膜上殘余的甲醇，置于 轉膜緩沖液中；按濾紙-PVDF膜-凝膠-濾紙，自下而上順序組裝，準備轉膜；將轉膜儀組裝 完畢，設置恒壓18V，轉膜2個小時；
[0046] 封閉：將轉完的PVDF膜浸泡在含有5 %的脫脂奶粉的TBST緩沖液中 (20mMTris-HCl，150mMNaCl，0. 05% 的 Tween20)中封閉 lh ;
[0047] 一抗包被：將封閉好的PVDF膜浸泡于含一抗TBST包被液中（含anti-His antibody, 1:3000, Invitrogen，3%脫脂奶粉）1小時；用TBST緩沖液每隔lOmin洗漆一次， 洗6次，去除非特異性結合抗體；
[0048] 二抗包被：將上步中的PVDF膜浸泡在含有山羊抗鼠 IgG/辣根酶標記抗體和3% 的脫脂奶粉的的TBST緩沖液中，振蕩1小時；用TBST緩沖液每隔lOmin洗滌一次，洗6次，， 去除非特異性結合的二抗；
[0049] 用TBST緩沖液每隔lOmin洗滌一次，洗6次，加入發色底物反應3-5min，曝光，顯 影，定影。
[0050] Western-Blotting結果顯示IPTG誘導組分中分子量27kDa處蛋白條帶為目的蛋 白條帶，且該蛋白經Ni柱分離純化后于250mM咪唑下中得到富集分離，純度達90%以上。
[0051] 實施例3.細菌硝基還原酶突變體NfsB-T41L/N71S/F124W的活性測定
[0052] 將250mM咪唑洗脫下來的重組蛋白，按照摩爾濃度比蛋白：FMN = 1 :10的比例混 勻，放置4°C冰箱中孵育2個小時。孵育結束后，將重組蛋白脫鹽至20mMTris-HCl緩沖液 (PH7.0)中，以進行后續蛋白活性檢測等實驗。
[0053] 1. HPLC分析突變體NfsB-T41L/N71S/F124W還原24DNT的區域選擇性用高效液相 色譜（HPLC)安捷倫1200分析突變體對24DNT的還原產物。以24DNT為底物，檢測突變體 的還原效率和還原產物比例。HPLC酶催化反應體系中含有：0. lmM24DNT，0. 2mM NADH，200nM 突變體酶，反應緩沖液為20mMTris-HCl pH7. 0,室溫反應5-15分鐘。由于24DNT及其反應產 物加熱不穩定，所以用等體積乙酸乙酯萃取以終止反應，12000Xg離心lOmin。取上層乙酸 乙酯相用于HPLC分析。HPLC分析柱選用C18反相疏水層析柱，粒徑5 μ m，4. 6mmX 250mm，流 動相組成為甲醇和水體系，流速為〇.8ml/min，進樣體積為10μ 1，用紫外檢測器檢測。HPLC 分析體系為20%甲醇平衡，進樣后經50%甲醇等梯度洗脫15min，50 % -90%的甲醇lOmin 線性洗脫，檢測波長為254nm，柱溫20°C。兩種羥氨產物保留時間分別為= 13. 8min， R2-NH0H - 14. lrnin〇
[0054] 實驗結果如圖1所示，突變體NfsB-T41L/N71S/F124W對重要工業原材料2, 4-二 硝基甲苯（24DNT)的還原由4-NH0H產物轉為2-NH0H產物。
[0055] 2. HPLC分析突變體NfsB-T41L/N71S/F124W還原24DNAN的區域選擇性用高效液相 色譜（HPLC)安捷倫1200分析突變體對24DNAN的還原產物。以24DNAN為底物，檢測突變 體的還原效率和還原產物比例。HPLC酶催化反應體系中含有：0. lmM24DNAN，0. 2mM NADH， 200nM突變體酶，反應緩沖液為20mMTris-HCl pH7. 0,室溫反應15-30分鐘，用等體積乙酸 乙酯萃取以終止反應，12000Xg離心lOmin。取上層乙酸乙酯相用于HPLC分析。HPLC分析 柱選用C18反相疏水層析柱，粒徑5 μ m，4. 6mmX 250mm，流動相組成為乙腈和水體系，流速 為0. 8ml/min，進樣體積為10 μ 1，用紫外檢測器檢測。HPLC分析體系為20 %乙腈平衡，進 樣后40% -80%的乙腈20min線性洗脫，檢測波長為263nm，柱溫20°C。兩種羥氨產物保留 時間分別為：R4- NHQH = 7. lmin，R2_NHra = 8. 6min。
[0056] 實驗結果如圖2所示，突變體NfsB_T41L/N71S/F124W可實現對重要工業原材料 2,4-二硝基苯甲醚（240隱的的專一性還原，還原產物由4-順0!1產物轉為2-順0!1產物。
[0057] 3.硝基還原酶突變體的動力學測定
[0058] 所有的動力學常數都是用全波長掃描突光酶標儀（Varioskan?，Thermo Fisher Scientific)用連續測點的方法于37°C恒溫檢測。硝基還原酶動力學檢測體系：總體積 200 μ 1，20mMTris-HCl (pH7. 0)的緩沖液中含有60 μ M NADH，一系列不同濃度的待測底物和 適量的酶。隨反應進行，通過檢測340nm下NADH的消耗量，進而計算底物消耗反應速率。每 還原lmol硝基基團，需要消耗2mol的NADH分子。所有的動力學實驗至少重復3次，數據 用非線性擬合軟件Origins. 5處理得出數據以及誤差范圍。
[0059] 表1.野生型及突變體NfsB-T41L/N71S/F124W對底物2, 4-二硝基甲苯（24DNT) 和2, 4-二硝基苯甲醚（24DNAN)的動力學常數。
[0060]
【權利要求】
1. 一種區位選擇性細菌硝基還原突變體基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
2. 如權利要求1所述的區位選擇性細菌硝基還原突變體基因所編碼的蛋白質，具有 SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
3. -種包含如權利要求1所述基因的重組表達載體。
4. 一種包含如權利要求3所述的重組表達載體的重組表達轉化體。
5. -種區位選擇性細菌硝基還原酶的制備方法，其特征在于：培養如權利要求4所述 的重組表達轉化體，從培養物中純化得到突變型細菌硝基還原酶的蛋白。
6. 如權利要求2所述的蛋白質或如權利要求4所述的重組表達轉化體作為催化劑在催 化硝基還原，在藥物激活劑代謝、芳香羥胺化合物的生物合成以及硝基類環境污染物生物 代謝領域的應用。
【文檔編號】C12N9/02GK104099353SQ201410337184
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年7月15日 優先權日:2014年7月15日
【發明者】楊君, 白敬, 劉培瑜, 姜熙, 楊青 申請人:大連理工大學