一種脂肪酶及其應用的制作方法

一種脂肪酶及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種脂肪酶，該脂肪酶的氨基酸序列為SEQ?ID?NO:?1，編碼該脂肪酶的基因組DNA，其序列為SEQ?ID?NO:2。本發明的脂肪酶為堿性低溫脂肪酶，在洗滌、皮革、食品、飼料等方向將擁有巨大的市場前景。本發明脂肪酶在較高的堿性環境下仍有很高的酶活力，反應最佳pH9.0。在應用試驗中檢測脂肪酶的去污效果發現，本發明未濃縮的脂肪酶發酵液樣品和諾維信6萬單位的脂肪酶高濃縮樣品相比，其洗滌去污能力僅相差10倍，而其生產成本遠低于諾維信脂肪酶的成本，有望通過進一步的發酵優化和產品濃縮達到相同去污效果，實現產業化。
【專利說明】一種脂肪酶及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于酶基因的分離和應用【技術領域】，具體涉及一種脂肪酶及其應用，即一種來源于黑葡萄穗霉(Stachybotrys chatarum)菌株的脂肪酶及其應用。
【背景技術】
[0002]脂肪酶(E.C.3.1.1.3)又名甘油酯水解酶、三酰基甘油酰基水解酶，是指水解羧酸甘油三酯中酯鍵的酶。脂肪酶能催化甘油三酯來生成甘油二脂、單甘脂、脂肪酸和甘油。脂肪酶具有催化疏水性的油脂變成水溶性的脂肪酸和甘油的生物功能，在無機溶劑中能保持高催化活力和極強穩定性。另外，脂肪酶對底物的廣譜性/特殊專一性，賦予了脂肪酶在食品油脂加工工業、洗滌劑工業、酯鍵化合物的合成和手性藥物合成等工業的巨大應用價值。脂肪酶已經成為蛋白酶、淀粉酶之后的第三大工業用酶。
[0003]脂肪酶是生物體內一類重要的代謝酶，從催化特性看，它具有高度的化學選擇性和立體異構性，且反應不需輔酶，反應條件溫和，副產物少。脂肪酶的另外一個特征是可以在異相系統(如油、水界面)或有機相中起作用，在水相中，脂肪酶通常催化水解反應的進行；而在有機相中，它卻能催化多種合成反應:如酯化、酯交換、酯的醇解、酯的酸解等。月旨肪酶的這些特性使其成為在手性化合物合成中重要的生物催化劑，多被用來催化一些酯類合成和轉化反應，在食品增香、脫脂加工、污水處理及化工產品中有著廣泛的應用。然而，目前脂肪酶的生產效率仍然較低且生產成本也較高，因此需要對現有的脂肪酶的種類及生產技術進行改進。
[0004]脂肪酶廣泛存在 于動物組織、植物種子和微生物體中。由于微生物種類多、繁殖快、易發生遺傳變異，因此微生物來源的脂肪酶比動植物來源的脂肪酶具有更廣的作用pH、作用溫度范圍；以及高穩定性、高活性和底物專一性。而且微生物脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，適合于工業化大生產和獲得高純度樣品。已經公布的適用于甘油三酯加工的不同來源的脂肪酶有33種，其中18種來自霉菌，7種來自細菌。因此，從霉菌和細菌中篩選出具有更好效果的脂肪酶一直是本領域的研究熱點。

【發明內容】

[0005]本發明的目的是提供一種脂肪酶及其應用，即提供一種新的脂肪酶，從而彌補現有技術的不足。
[0006]本發明一個方面提供一種脂肪酶，該脂肪酶的氨基酸序列為SEQ ID NO:1。
[0007]用于編碼上述脂肪酶的基因組DNA，其序列為SEQ ID N0:2。
[0008]本發明另一個方面提供一種用于表達上述脂肪酶的重組質粒，所述的重組質粒攜帶有用于表達上述脂肪酶的DNA片段，其序列為SEQ ID N0:3。
[0009]本發明的脂肪酶，是在曲霉細胞中生產的，是將用于表達脂肪酶的重組質粒轉入曲霉宿主細胞，所述的曲霉細胞為黑曲霉細胞；
[0010]本發明的另一個方面涉及一種酶組合物，包含有上述的脂肪酶；[0011]本發明的脂肪酶為堿性低溫脂肪酶，在洗滌、皮革、食品、飼料等方向將擁有巨大的市場前景。本發明脂肪酶在較高的堿性環境下仍有很高的酶活力，反應最佳PH9.0。在應用試驗中檢測脂肪酶的去污效果發現，本發明未濃縮的脂肪酶發酵液樣品和諾維信6萬單位的脂肪酶高濃縮樣品相比，其洗滌去污能力僅相差10倍，而其生產成本遠低于諾維信脂肪酶的成本，有望通過進一步的發酵優化和產品濃縮達到相同去污效果，實現產業化。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1:本發明所用的pGm質粒的遺傳圖譜；
[0013]圖2:本發明所用的pGm_Lip3404質粒的遺傳圖譜；
[0014]圖3:本發明的Lip3404的表達產物的SDS-PAGE凝膠圖，顯示了如實施例3所述的黑曲霉轉化子的Lip3404的表達情況；其中泳道I所示為蛋白標準分子量標記，由上至下% 116.0 kD，66.2 kD,45.0 kD，35.0kD，25.0kD，18.4kD 和 14.4kD ;泳道 2 所示為黑曲霉宿主在發酵5 d后的蛋白表達情況；泳道3所示為Lip3404的脂肪酶表達情況，在34kD附近可以看到清晰蛋白條帶；
[0015]圖4:本發明的脂肪酶的相對酶活與溫度的曲線圖；
[0016]圖5:本發明的脂肪酶的相對酶活與pH的曲線圖。
【具體實施方式】
[0017]本發明用到了遺傳工程和分子生物學領域使用的常規技術和方法，例如MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed.(Sambrook, 2001)和 CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR B1LOGY (Ausubel, 2003)中所記載的方法。這些一般性參考文獻提供了本領域技術人員已知的定義和方法。但是，這并不意味著將本發明限定于所述的任何具體方法、實驗方案和試劑，因為它們可以改變。
[0018]除非在本文中另作限定，本文所用的全部技術術語和科學術語具有本發明所屬領域的普通計數人員通常所理解的相同含義。DICT1NARY OF MICROB1LOGY AND MOLECULARB1LOGY, 3nd Ed.(Singleton et al., 2006)和COLLINS DICT1NARY B1LOGY (Hale etal.，2003)為技術人員提供了本發明中所使用的許多術語的一般性解釋。
[0019]除非另作說明，核酸是按5,至3,方向從左至右書寫；氨基酸是按氨基至羧基的方向從左至右書寫。
[0020]如本文所用，術語“脂肪酶”即三酰基甘油酰基水解酶，它催化天然底物油脂水解，生成脂肪酸、甘油和甘油單酯或二酯。其基本組成單位僅為氨基酸，通常只有一條多肽鏈。它的催化活性決定于它的蛋白質結構。
[0021]如本文所用，術語“重組”當被用于指代細胞、核酸、蛋白或載體時，表示該細胞、核酸、蛋白或載體已通過導入異源核酸或蛋白或者通過改變天然核酸或蛋白而被修飾。因此，例如，重組細胞是表達在天然(非重組)形式的該細胞中不曾發現的基因，或者表達天然基因。
[0022]術語“蛋白質”和“多肽”在本文中可以互換使用。本文使用氨基酸殘基的傳統的單字母或三字母代碼。
[0023]如本文所用，術語“基因”指參與生產多肽的DNA片段，包括編碼區之前和之后的區域，以及各編碼片段(外顯子)之間的插入序列(內含子)。
[0024]術語“核酸”包括DNA、RNA,單鏈或雙鏈的，以及它們的化學修飾物。
[0025]術語“核酸”和“多核苷酸”在本文中可以互換使用。
[0026]術語“載體”指被設計用來將核酸導入一種或多種細胞類型的多核苷酸序列。載體包括克隆載體、表達載體、穿梭載體、質粒、噬菌粒、序列盒以及類似物。
[0027]術語“表達載體”表示包含DNA序列的DNA構建物，所述DNA序列被可操縱的連接于能夠影響該DNA在合適宿主中表達的合適的控制序列。此類控制序列可以包括完成轉錄的啟動子、可選的控制轉錄的操縱子序列、編碼mRNA上合適的核糖體結合位點的序列、增強子以及控制轉錄和翻譯的終止的序列。
[0028]術語“啟動子”表示參與結合RNA聚合酶以啟動基因轉錄的的調控序列。啟動子可以是誘導型啟動子或組成型啟動子。
[0029]與另一序列具有某一百分比的序列同一性的多核苷酸或多肽是指，在比較這兩個序列時所述百分比的堿基或氨基酸殘基是相同的。
[0030]由于遺傳密碼是簡并的，所以可以使用一種以上的密碼子來編碼特定的氨基酸，本發明包括編碼特定的氨基酸 序列的多核苷酸。
[0031]術語“宿主菌株”或“宿主細胞”是指表達載體或DNA構建物的合適宿主，所述表達載體或DNA構建物包含本發明的編碼脂肪酶的多核苷酸。具體而言，宿主菌株優選地是絲狀真菌細胞。該宿主細胞可以是野生型絲狀真菌宿主細胞或者經遺傳修飾的宿主細胞。術語“宿主菌株”或“宿主細胞”指由絲狀真菌菌株細胞所產生的細胞核原生質體。
[0032]如本文所用，術語“絲狀真菌”指所有絲狀形式的真菌亞門生物(參見INTRODUCTORY MY⑶LOGY, 4th Ed.(Alexopoulos, 2007)和 AINSWORTH AND BISBYDICT1NARY OF THE FUNGI, 10th Ed.(Kirk et al.，2008))。這些真菌的特征是帶有由幾丁質、纖維素和其他復雜多糖組成的細胞壁的營養菌絲體。本發明所述的絲狀真菌在形態學、生理學和遺傳學上不同于酵母。絲狀真菌的營養生長是通過菌絲的延伸來完成的，碳代謝是專性需氧的。在本發明中，絲狀真菌親代細胞可以使，但不限于，曲霉屬某種(Aspergillus sp.)(例如棒曲霉(A.clavatus)、煙曲霉(A.fumigatus)、泡盛曲霉(A.awamori)、黃曲霉(A.flavus), 土曲霉(A.terreus)和米曲霉(A.0ryzae))、青霉屬某種(Penicillium sp.)(例如產黃青霉(P.chrysogenum))、新薩托菌屬某種(Neosartoryasp.)(例如費希新薩托菌(N.fischeri))、粘帚霉菌屬某種(Gl1cladium sp.)(例如粉紅粘帚霉(G.roseum))、木霉屬某種(Trichoderma sp.)(例如里氏木霉(T.reesei)、綠色木霉(T.viride)、康寧木霉(T.koningii)、哈茨木霉(T.harzianum))、腐質霉屬某種(Humicola sp.)(例如特異腐質霉(H.1nsolens)和灰腐質霉(H.grisea))、金孢霉屬某種(Chrysosporium sp.)、鐮刀菌屬某種(Fusarium sp.)、脈孢霉屬某種(Neurospora sp.)、肉座菌屬某種(Hypocrea sp.)和裸孢殼屬某種(Emericella sp.)的細胞。
[0033]下面結合具體實施例對本發明進行詳細的描述。
[0034]實施例1:克隆脂肪酶基因
[0035]使用真菌基因組DNA提取試劑盒(Omega)從黑葡萄穗霉過夜培養物中提取基因組DNA。
[0036]以黑葡萄穗霉基因組DNA為擴增模板來擴增黑葡萄穗霉中的脂肪酶基因，其中所用到的正向引物P3404-F序列為(下劃線所示序列為AflII酶切位點)；
[0037]5' -AACTTAAGATCATGCTGGGCTACATCCTCCTCTC-3'
[0038]反向引物P3404-R序列為(下劃線所示序列為PacI酶切位點):
[0039]5' ~CCTTAATTAATTATTACGCTGCTGGTGC~3/ 。
[0040]將該基因用Phus1n DNA聚合酶(Thermo scientific)從黑葡萄穗霉基因組DNA中擴增出來。
[0041 ] 使用凝膠純化試劑盒(Fermentas)將上述PCR產物純化。用限制性內切酶AflII和PacI (Fermentas)對純化了的PCR產物進行酶切；同時，用限制性內切酶Af III和PacI對質粒pGm進行酶切。使用凝膠純化試劑盒將酶切產物純化，并用T4 DNA連接酶(Fermentas)將上述兩個酶切產物連接。將連接產物轉化進Trans5 α大腸桿菌(Transgen),用氨節青霉素進行選擇。為確保準確,對若干克隆進行測序(Invitrogen)。
[0042]使用質粒中量制備試劑盒(Axygen)從測序結果正確的大腸桿菌克隆中純化質粒。所得I個質粒為pGm- Lip3404，測序結果的DNA序列為SEQ ID N0:2，去掉內含子的編碼區序列為SEQ ID NO: 3，其翻譯的脂肪酶的序列為SEQ ID NO:1 ;多個克隆的測序結果都—致。
[0043]通過NCBI中的BLAST進行蛋白質序列比對發現，本發明的脂肪酶為一新的等位基因，與現有的脂肪酶序列有明顯的區別。
[0044]實施例2 PEG介導 的原生質體融合轉化黑曲霉
[0045]吸取黑曲霉GAPl孢子懸浮液于CMA平板中心(9 cm培養皿)，待菌落長滿整個培養皿，切1/4大小的培養基于200 mL CMA液體培養基中，在30°C、200 rpm的條件培養11~16h0
[0046]用無菌Miracloth濾布收集菌絲體,并用溶液A清洗一次,在無菌條件下將清洗過的菌絲體轉移到40 mL原生質體化溶液，在30°C、200 rpm的條件下溫浴廣2 h，用顯微鏡觀察檢測原生質體化進展。
[0047]用無菌Miracloth濾布過濾上述溫浴液體，所得濾液即為原生質體溶液。將原生質體溶液分裝于兩個50 mL無菌的一次性離心管中，并將每管的體積用溶液B定容至45mL，在4000 rpm條件下離心8 min以獲得沉淀并棄去上清液。用20 mL溶液B再清洗沉淀兩次。將沉淀重懸浮于10 mL溶液B中，并用血球計數板對原生質體計數。將原生質體再次離心并棄去上清液，根據血球計數板計數結果，加入適量溶液B重懸沉淀，使得原生質體數目在IXlO7個/mL。
[0048]在冰上，將100 μ L上述原生質體溶液加入預冷的無菌15 mL離心管中，每個轉化反應用I管。加入10 μ g DNA。加入12.5 μ L溶液C，溫和混勻后再冰上放置20 min。
[0049]將麗SA頂層瓊脂試管熔化并保持在55°C。從冰中移出上述15 mL離心管，并向管中加入I mL溶液C和2 mL溶液B，溫和混勻各管，所得混合物即為原生質體混合物。向3個頂層瓊脂試管中的每一個中加入I mL上述原生質體混合物，并立即傾倒與MMSA平板上，并將平板在30°C下培養疒10 d。
[0050]溶液A:2.5 mL IM K2HPO4, 2.5 mL IM KH2PO4,48.156 g MgSO4,加入 dlH20 至終體積500 mL，用0.22 μπι的微孔濾膜過濾除菌。
[0051]溶液B:5 mL IM Tris (pH 7.5)，2.77 g CaCl2,109.32 g 山梨醇，加入 dlH20 至終體積500 mL，用0.22 μπι的微孔濾膜過濾除菌。
[0052]溶液C:250 g PEG 4000,2.77 g CaCl2, 5 mL IM Tris (pH 7.5)，加入 dlH20 至終體積500 mL，用0.22 μπι的微孔濾膜過濾除菌。
[0053]原生質體化溶液:將0.6 g 裂解酶(Lysing Enzyme from Trichodermaharzianum, Sigma)溶解于40 mL溶液A中，用0.22 μ m的微孔濾膜過濾除菌。
[0054]MMSA 平板:0.59 g 乙酰胺(Sigma)，3.4 g CsCl (Sigma) ,0.52 g KCl, 1.52 gKH2PO4, 218.5 g山梨醇，I ml痕量元素(見下)，20 g瓊脂，加入dlH20至終體積972.5 mL,高壓蒸汽滅菌后加入用0.22 μπι的微孔濾膜過濾除菌的25 mL 40%葡萄糖和2.5 mL 20%MgSO4。
[0055]MMSA 頂層瓊脂試管:0.59 g 乙酰胺(Sigma), 3.4 g CsCl (Sigma), 0.52 g KCl,
1.52 g KH2PO4, 218.5 g山梨醇，I ml痕量元素(見下)，10 g低熔點瓊脂糖，加入dlH20至終體積972.5 mL,高壓蒸汽滅菌后，在培養基未凝固時，加入用0.22 μπι的微孔濾膜過濾除菌的25 mL 40%葡萄糖和2.5 mL 20% MgSO4,之后立即分裝于無菌試管中，每管10 mL。
[0056]痕量兀素:在250 mL dlH20 中加入 I g FeSO4.7H20,8.8 g ZnSO4.7H20,0.4 gCuSO4.5Η20，0.15 g MnSO4.4Η20，0.1 g Na2B4O7.1OH2O, 50 mg (NH4)6 Mo7O24.4Η20，0.2 mL濃HCl，完全溶解后用dlH20定容至I L，用0.22 μπι的微孔濾膜過濾除菌。 [0057]CMA平板:20 g葡萄糖，20 g麥芽浸出物，I g蛋白胨，15 g瓊脂，加入dlH20至終體積1000 mL,高壓蒸氣滅菌。
[0058]CMA液體培養基:20 g葡萄糖，20 g麥芽浸出物，I g蛋白胨，加入dlH20至終體積1000 mL,高壓蒸氣滅菌。
[0059]實施例3:表達黑葡萄穗霉脂肪酶Lip3404的黑曲霉的發酵和酶的表達
[0060]將表達本發明脂肪酶的黑曲霉Lip3404轉化子的孢子懸浮液接種于30 mL TSB發酵培養基中，在30°C，200 rpm的條件下培養5 d。所得發酵液用8層紗布過濾，濾液在14000Xg條件下離心10 min，收集上清液。所得上清液即為Lip3404脂肪酶酶液。將酶液在濃度為12%的SDS-PAGE膠上進行電泳(圖3)。
[0061]TSB 發酵培養基:12 g NaNO3,0.5 g KCl, 1.5 g KH2PO4, 2.05 g MgSO4.7Η20，3.5 gNaH2PO4.H20,45 g胰蛋白大豆肉湯，70 g檸檬酸鈉，I g吐溫80，I mL痕量元素(見下)，加入dlH20至終體積700 mL,高壓蒸氣滅菌后加入300 mL用0.22 μπι的微孔濾膜過濾除
菌的40%麥芽糖。
[0062]痕量元素:在250 mL dlH20 中加入 I g FeSO4.7H20，8.8 g ZnSO4.7H20，0.4 gCuSO4.5Η20，0.15 g MnSO4.4Η20，0.1 g Na2B4O7.1OH2O, 50 mg (NH4)6 Mo7O24.4Η20，0.2 mL濃HCl，完全溶解后用dlH20定容至I L，用0.22 μπι的微孔濾膜過濾除菌。
[0063]實施例4:本發明脂肪酶的應用效果測試
[0064]一、實驗樣品
[0065]㈠脂肪酶樣品及酶活
[0066]
【權利要求】
1.一種脂肪酶，所述的脂肪酶的氨基酸序列為SEQ ID NO:1。
2.用于編碼權利要求1所述的脂肪酶的基因，其序列為SEQID N0:2。
3.一種用于表達權利要求1所述的脂肪酶的重組質粒，所述的重組質粒攜帶序列為SEQ ID NO: 3 的 DNA 片段。
4.權利要求1所述的脂肪酶的生產方法，是在曲霉細胞中生產的。
5.如權利要求4所述的生產方法，其特征在于，是將權利要求3所述的重組質粒轉曲霉宿主細胞來生產的。
6.如權利要求4或權利要求5所述的生產方法，其特征在于所述的曲霉細胞為黑曲霉細胞。
7.—種酶組 合物，所述的酶組合物包含有權利要求1所述的脂肪酶。
【文檔編號】C12N9/20GK104031899SQ201310069500
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2013年3月5日 優先權日:2013年3月5日
【發明者】王華明, 訾禎禎, 陳志兵 申請人:中國科學院天津工業生物技術研究所, 青島蔚藍生物集團有限公司