用o的制作方法

專利名稱：用o的制作方法
技術領域：
本發明涉及將標記從合適的底物轉移到O6-烷基鳥嘌呤-DNA烷基轉移酶融合蛋白的方法和獲得的新型標記融合蛋白。
背景技術：
親電子劑如N-甲基-N-亞硝基脲的致突變效應和致癌效應主要由DNA中鳥嘌呤的O6-烷基化引起。為了保護自身免受DNA烷基化，哺乳動物和細菌具有可修復這種損傷的O6-烷基-DNA烷基轉移酶(AGT)。AGT將烷基基團從烷基化鳥嘌呤和烷基化鳥嘌呤衍生物的O-6位上轉移至自身半胱氨酸的巰基上，形成不可逆烷基化的AGT。其基本機理是SN2型親核反應，這就解釋了為什么不僅甲基，而且芐型基團也容易被轉移。由于腫瘤細胞中AGT的過度表達是對烷基化藥物(如丙卡巴肼、達卡巴肼、替莫唑胺和雙-2-氯乙基-N-亞硝基脲)產生抗性的主要原因，因此AGT的抑制劑可用作化療中的敏化劑(Pegg等，Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 51167-223，1995)。
DE 199 03 895公開了測定AGT水平的試驗，該試驗依賴于生物素化O6-烷基鳥嘌呤衍生物和AGT之間的反應，該反應導致AGT的生物素化。這樣又可在鏈親合素包被的板上分離AGT，并在例如ELISA試驗中對其進行檢測。這種測定可用于監測腫瘤組織中的AGT水平和篩選AGT抑制劑。
Damoiseaux等，Chembiochem，4285-287，2001公開了結合到寡聚脫氧核糖核酸中的修飾O6-烷基化鳥嘌呤衍生物，該衍生物可用作標記AGT的化學探針，這又促進了檢測癌癥細胞中這種酶的水平，有助于研究和化療。
PCT/GB02/01636公開了用于檢測和/或處理目標蛋白的方法，其中該蛋白與AGT融合，AGT融合蛋白與帶有標記的AGT底物接觸，然后用該標記檢測并任選進一步處理AGT融合蛋白。其中還介紹了所用的某些AGT融合蛋白、AGT底物的一般結構原則和可用于該方法的各種標記及其檢測方法。
發明概述本發明涉及一種檢測和/或處理目標蛋白的方法，其中目標蛋白結合到AGT融合蛋白中，AGT融合蛋白與合適的帶有標記的AGT底物接觸，并在設計用于識別和/或處理標記的系統中利用該標記以任意順序對AGT融合蛋白進行檢測或處理或檢測并處理。
本發明的目標蛋白選自酶、DNA結合蛋白、轉錄調控蛋白、膜蛋白、核受體蛋白、核定位信號蛋白、蛋白輔因子、小單亞基GTP酶、ATP結合盒蛋白、細胞內結構蛋白、具有將蛋白靶向特定細胞區室的序列的蛋白、通常用作標記或親合標記的蛋白、以及上述蛋白的結構域或亞結構域，不包括PCT/GB02/01636(WO 02/083937)中公開的λ噬菌體主要頭部蛋白D(gpD)和具體目標蛋白。
AGT融合蛋白可由一個或者多個(如1、2或3個)目標蛋白與AGT在其N端、C端或N端和C端融合組成。AGT可為人AGT(hAGT)、其他哺乳類動物的AGT或者野生型AGT被置換、缺失或插入一個或多個氨基酸的突變體。
本發明還涉及新型AGT融合蛋白，尤其是本發明方法中獲得的標記AGT融合蛋白，該蛋白中包含與標記底物共價結合的AGT融合蛋白。
發明詳述在本發明中，目標蛋白或多肽與O6-烷基鳥嘌呤-DNA烷基轉移酶(AGT)融合。目標蛋白或者多肽可為任何長度，任選有或沒有二級、三級或四級結構，優選包含至少12個氨基酸，最多2000個氨基酸，優選50-1000個氨基酸。
本發明目標蛋白選自酶，例如轉移酶(EC 2)，更具體是轉移甲基以外烷基或芳基的轉移酶(EC 2.5)，尤其是谷胱甘肽轉移酶(EC 2.5.1.18)；或激酶，其為轉移含磷基團的轉移酶(EC 2.7)，尤其是以醇基為接受基團的激酶(EC 2.7.1)，例如以底物蛋白中絲氨酸和蘇氨酸作為磷酸化靶點的蛋白激酶，如來自酵母的酪蛋白激酶(EC 2.7.1.37)或酪氨酸蛋白激酶(EC 2.7.1.112)；或氧化還原酶(EC 1)，更具體是作為接納體作用于過氧化物的氧化還原酶(EC 1.11)，尤其是細胞色素C過氧化物酶(EC 1.11.1.5)；或例如水解酶(EC 3)，更具體是作用于酯鍵的水解酶(EC 3.1)，尤其是磷酸單脂水解酶(EC 3.1.3)，如蛋白磷酸單脂水解酶；或水解肽鍵的水解酶，也稱為肽酶或蛋白酶(EC 3.4)，尤其是胱冬酶；DNA結合蛋白，更具體是轉錄阻遏蛋白，該蛋白為抑制mRNA合成的蛋白因子，具體地說是大腸桿菌(E.coli)中抑制mRNA合成的蛋白因子，尤其是LexA蛋白的DNA結合域；轉錄調控蛋白，更具體是轉錄阻遏蛋白，尤其是含有色氨酸或天冬氨酸重復結構的轉錄阻遏蛋白，如釀酒酵母(S.cerevisiae)轉錄阻遏蛋白Tup1；膜蛋白，例如具有至少一個跨膜螺旋的膜蛋白，更具體是來自內質網(ER)膜的膜蛋白，尤其是在蛋白質轉運到ER中發揮活性的膜蛋白，如ER跨膜蛋白Sec62；或例如來自7跨膜螺旋(7-TM)蛋白家族的蛋白，具體是作為G蛋白偶聯受體(GPCR)的7-TM蛋白，尤其是與分子量大于1kDa的大分子配體結合的蛋白，例如哺乳動物(如人)的神經激肽-1-受體(NK1)；或例如來自細胞膜的跨膜離子通道蛋白，尤其是配體門控離子通道蛋白，更具體是對5-羥色胺敏感的配體門控離子通道蛋白，如5-羥色胺受體5-HT3；或例如除離子通道和G蛋白偶聯受體以外的膜受體；或例如過氧化物酶體膜蛋白，尤其是來自酵母，如Pex15蛋白；核受體蛋白，例如來自轉錄因子家族的核受體蛋白，更具體是來自配基可誘導轉錄因子家族的核受體蛋白，尤其是來自類固醇(如雌激素)受體家族的核受體，如人雌激素受體hER；核定位信號蛋白，如來自猿猴病毒40(SV40)的核定位信號；蛋白質輔因子，如在其遺傳結構中含有泛素序列的蛋白，小單亞基GTP酶，更具體是膜粘附小單亞基GTP酶，如Ras家族的成員；ATP結合盒(ABC)蛋白，如多重耐藥性蛋白；細胞內結構蛋白，更具體是細胞骨架蛋白，更具體是人胞質β-肌動蛋白；具有將蛋白靶向特定細胞區室的序列的蛋白，細胞區室例如為高爾基體、內質網(ER)、線粒體、質膜或過氧化物酶體；通常用作標記或親和標記的蛋白，如用UV或可見光輻射激發時發出熒光信號的熒光蛋白，尤其是來自稱為綠色熒光蛋白(GFP)家族的熒光蛋白，如稱為增強型青色熒光蛋白(ECFP)的熒光蛋白；以及前面所述蛋白的結構域和亞結構域。
此外，根據來源選擇本發明的目標蛋白。具體的說，目標蛋白為存在于細菌中的蛋白，如沙門氏菌(salmonella)，更具體為傷寒沙門氏菌(salmonella typhi)和鼠傷寒沙門菌(salmonella typhimurium)；分枝桿菌(mycobacteria)，更具體為結核分枝桿菌(mycobacteriumtuberculensis)；或葡萄球菌(staphylococci)，更具體是金黃色葡萄球菌(staphylococcus aureus)；或病毒來源的蛋白，如人類免疫缺陷病毒(HIV)、人流感病毒和肝炎病毒。
優選目標蛋白為，例如受體，例如膜受體，尤其是7-TM受體(GPCR)；具有酶活性的受體，尤其是可能需要二聚才有活性的激酶型受體；涉及病毒停靠(virusdocking)和病毒進入細胞的離子通道蛋白和膜蛋白；或例如胞內受體，尤其是跨膜化合物的受體，如類固醇激素受體；胞外信號分子和信號因子，如白介素、生長因子、釋放的激素、前列腺素、胰島素和胰高血糖素；胞內信號級聯蛋白，如涉及磷脂酰肌醇信號傳導以及cAMP和cGMP產生的酶和輔因子、膜粘附和游離的激酶、激酶激酶和磷酸酶、以及胞內信號級聯中最終活化或失活的酶，尤其是活化胱冬酶的酶；激素，以及涉及激素的合成、釋放、活化、受體活性和失活的酶；與細胞狀態相關的膜表面標志，如甲胎蛋白；以及涉及血壓控制和心臟功能的蛋白，如ACE抑制劑、腎受體和腎通道蛋白、心臟鉀通道蛋白。
本發明權利要求范圍外的蛋白為具有λ噬菌體頭部主要蛋白和PCT/GB02/01636(WO 02/083937)中公開的目標蛋白的融合蛋白，尤其是MHHHHHHSSA-hAGT，即包含His6短肽以及甲硫氨酸(M)、絲氨酸(S)和丙氨酸(A)的融合蛋白；hAGT-DHFR-HA，即hAGT、短連接肽、小鼠二氫葉酸還原酶和Ha表位的融合蛋白；V5-NLS-B42-hAGT，即V5表位、SV40大T抗原核定位序列、人工轉錄激活因子B42、連接肽和hAGT的融合蛋白；hAGT-HA-Ura3，即hAGT、Ha表位和酵母乳清酸脫羧酶Ura3的融合蛋白；以及hAGT-SSN6，即hAGT、短連接肽和名為SSN6的DNA轉錄酵母阻遏因子的融合蛋白。
本發明公開了如下制備的融合蛋白，即一方面是野生型人AGT(hAGT)、其他哺乳動物AGT(如小鼠或大鼠AGT)、或上述AGT DNA突變體，將目標蛋白(如上所述)編碼序列連接到AGT DNA序列的N端或C端或同時連接到N端和C端，獲得本發明的融合蛋白。融合蛋白可進一步包含合適的連接體，如在合適條件下容易被酶切的連接體，融合蛋白中連接體可在AGT和目標蛋白之間和/或兩個目標蛋白之間。這種連接體的實例為，例如在DNA階段可被合適限制性內切酶酶切的連接體，如可被Bgl II酶切的AGATCT，和/或在蛋白階段可被合適酶(如煙草蝕紋病毒Nla(TEV)蛋白酶)酶切的連接體。
融合蛋白可以在原核宿主中表達，優選大腸桿菌，或在真核宿主中表達，如真細菌、酵母、昆蟲細胞或哺乳動物細胞。
O6-烷基鳥嘌呤-DNA烷基轉移酶(AGT)具有將底物上的標記轉移到AGT半胱氨酸殘基上的性質，其中AGT形成融合蛋白的部分。在優選實施方案中，AGT為已知的人O6-烷基鳥嘌呤-DNA烷基轉移酶hAGT。也可考慮小鼠型或大鼠型酶，因為它們在與底物反應方面具有與人AGT相似的性質。在本發明中，O6-烷基鳥嘌呤-DNA烷基轉移酶也包括野生型AGT的突變體，這種突變體的差別在于可能被置換、缺失或插入一個或多個(如1、2、3或4個)氨基酸，但它們仍保持將底物上的標記轉移到融合蛋白AGT部分的性質。可用本領域技術人員熟知的技術對AGT進行化學修飾，得到AGT突變體。優選使用本領域技術人員熟知的蛋白質工程技術和/或分子進化技術來生產AGT突變體，從而產生和選擇新的O6-烷基鳥嘌呤-DNA烷基轉移酶。這種技術例如為飽和誘變、將變異引入序列任何部位的易錯PCR、飽和誘變和/或易錯PCR后使用DNA改組、或用來自某些不同種屬的基因進行家族改組(family shuffling)。
在噬菌體展示技術的幫助下，發現了對O6-苯甲基鳥嘌呤和本發明AGT底物活性顯著提高的突變體。hAGT可作為與λ噬菌體主要頭部蛋白D的融合蛋白有功能地展示在λ噬菌體上，并且hAGT獨特的作用機制可用于從野生型λ噬菌體混合物中篩選出展示hAGT的λ噬菌體(Damoiseaux等，ChemBiochem.4285-287，2001)。hAGT也可作為與噬菌體衣殼蛋白pIII的融合蛋白有功能地展示在絲狀噬菌體上。
與O6-苯甲基鳥嘌呤在其活性位點結合的hAGT的結構中，四個氨基酸在苯甲基環的附近(Pro 140、Ser 159、Gly 160)或可能與核堿基的N9接觸(Asn 157)。此前發現，在Pro 140和Gly 160位置上的突變影響hAGT與O6-苯甲基鳥嘌呤的反應(Xu-Welliver等，Biochemical Pharmacology 581279-85，1999)140位上的脯氨酸是其與苯甲基環的相互作用所必須的，160位上甘氨酸突變為色氨酸可提高hAGT對O6-苯甲基鳥嘌呤的反應活性。本發明中考慮的具體突變體為140位上為苯丙氨酸或甲硫氨酸；157位上為甘氨酸、脯氨酸、精氨酸或色氨酸，尤其是甘氨酸；159位上為谷氨酸、天冬酰胺、脯氨酸或谷氨酰胺，尤其是谷氨酸；以及160位上為丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸或纈氨酸，尤其是色氨酸。優選突變體為Asn157被甘氨酸置換且Ser159被谷氨酸置換，以及其中Gly160被丙氨酸或色氨酸置換的突變體。最優選Asn157被絲氨酸置換、Ser159被組氨酸置換并且Gly160被天冬酰胺置換的突變體。
包含目標蛋白和O6-烷基鳥嘌呤-DNA烷基轉移酶(AGT)的融合蛋白與帶有標記的特殊底物接觸。選擇反應條件使AGT與底物反應并轉移底物的標記。常用條件為室溫下(例如約25℃)約pH7的緩沖溶液中。但是，應理解的是AGT也可在各種其它條件下進行反應，并且本文提到的條件并不限制本發明的范圍。
AGT不可逆地將烷基從底物O6-烷基鳥嘌呤-DNA上轉移到它的一個半胱氨酸殘基上。可與hAGT快速反應的底物類似物是O6-苯甲基鳥嘌呤；其二級速率常數約為103/秒·M。O6-苯甲基鳥嘌呤的苯甲基環C4位上的取代并不顯著影響hAGT與O6-苯甲基鳥嘌呤衍生物的反應活性，這種性質可用于將連接在苯甲環C4上的標記轉移到AGT上。
本領域技術人員可根據本發明融合蛋白的用途選擇底物的標記部分。包含AGT的融合蛋白與底物接觸后，標記共價結合到融合蛋白上。然后可利用轉移的標記進一步處理和/或檢測標記AGT融合蛋白。
“處理”應理解為任何物理和化學的處理。例如，處理可以指從細胞中分離、用標準純化技術純化(如層析)、與化學試劑或結合配偶對的結合配偶體反應(尤其是當結合配偶體固定在固相上時)等。這種處理可取決于標記L，而且除標記融合蛋白的“檢測”外也可發生。如果處理并檢測標記融合蛋白，檢測可在處理之前或之后，或發生在本文所定義的處理中。
具體的AGT底物為式1的化合物 其中R1-R2是被AGT識別為底物的基團；X為氧或硫；R3為芳基或雜芳基，或為以雙鍵與CH2連接的任選取代的不飽和烷基、環烷基或雜環基；R4為連接體；L為標記、多個相同或不同的標記、將R4和R1連接形成環狀底物的鍵或其它-R3-CH2-X-R1-R2基團。
在基團R1-R2中，殘基R1優選為含有1-5個氮原子的雜芳基，被AGT識別為底物，優選式2的嘌呤基 其中R2為氫、1-10個碳原子的烷基或糖部分；R5為氫、鹵基(如氯和溴)、三氟甲基或羥基；R6為氫、羥基或未取代或取代的氨基。
如果R5或R6為羥基，嘌呤基主要以互變異構體的形式存在，其中與帶有R5或R6的碳原子相鄰的氮帶有氫原子，該氮原子與帶有R5或R6的碳原子之間的雙鍵成為單鍵，R5或R6分別為雙鍵連接的氧。
取代氨基R6為1-4個碳原子的低級烷基氨基；或為酰胺基，其中酰基為1-5個碳原子的低級烷基羰基，如乙酰基、丙酰基、正丙基羰基、異丙基羰基、正丁基羰基、異丁基羰基、叔丁基羰基；或為芳基羰基，如苯甲酰基。
如果R6為未取代或取代氨基且與嘌呤基相連的基團X為氧，式2的基團為鳥嘌呤衍生物。
糖部分R2為糖的單體或寡聚體，由長度可變的間隔區連接到鳥嘌呤堿基的N9位上。本文中間隔區為烷基鏈(優選1-15個碳原子)、由1-200個乙二醇單位組成的聚乙二醇間隔區、酰胺基-CO-NH-、酯基-CO-O-、亞烴基-CH＝CH-，或為烷基鏈、聚乙二醇基、酰胺基、酯基和亞烴基的組合。
本發明中，糖部分R2可進一步包括β-D-2’-脫氧核糖基或結合到2-99個核苷酸長度的單鏈寡脫氧核糖核苷酸中的β-D-2’-脫氧核糖基，其中鳥嘌呤衍生物R1在寡核苷酸序列內占據任何位置。
本發明的另一個優選實施方案中，R1-R2為8-氮雜嘌呤基，其中式2基團的C-R5部分被氮置換，R2和R6具有如式2中定義的含義。
X優選為氧。
R3為芳基或雜芳基、或任選取代的不飽和烷基、環烷基或雜環基，是空間上和電荷上都被AGT接受的基團(與其反應機理一致)，這樣就允許R3-R4-L單位共價轉移到融合蛋白上。在R3-R4-L單位中，R4-L還可指帶有多個相同或不同標記L的多個相同或不同的連接體R4。
R3為芳基，優選為苯基或萘基，尤其是苯基，如在對位或間位被R4取代的苯基。
雜芳基R3為單環或雙環的雜芳基，包含0、1、2、3或4個環氮原子和0或1個氧原子和0或1個硫原子，前提條件是至少一個環碳原子被氮、氧或硫原子置換，R3具有5-12個、優選5-6個環原子；該基團除帶有取代基R4外可不被取代，或被一個或多個、尤其是一個其它取代基取代，取代基選自低級烷基(如甲基)、低級烷氧基(如甲氧基或乙氧基)、鹵基(如氯、溴或氟)、鹵代低級烷基(如三氟甲基)或羥基。優選雜芳基R3為三唑基，尤其是在4位或5位還帶有取代基R4的1-三唑基；四唑基，尤其是在4位或5位還帶有取代基R4的1-四唑基或在5位還帶有取代基的2-四唑基；異噁唑基，尤其是在5位還帶有取代基的3-異噁唑基或在3位還帶有取代基的5-異噁唑基；噻吩基，尤其是在3、4或5位、優選4位還帶有取代基R4的2-噻吩基，或在4位還帶有取代基R4的3-噻吩基。
任選取代的不飽和烷基R3為1或2位、優選2位還帶有取代基R4的1-烯基，或1-炔基。1-烯基中可考慮的取代基為低級烷基如甲基、低級烷氧基如甲氧基、低級酰基氧基如乙酰氧基或鹵基如氯。
任選取代的不飽和環烷基為具有3-7個碳原子且1位上不飽和的環烷基，如1-環戊基或1-環己基，在任何位置還可帶有取代基R4。可考慮的取代基例如為低級烷基如甲基、低級烷氧基如甲氧基、低級酰基氧基如乙酰氧基或鹵基如氯。
任選取代的不飽和雜環基具有3-12個原子、1-5個選自氮、氧、硫的雜原子和連接雜環基與亞甲基CH2的雙鍵。可考慮的取代基例如為低級烷基如甲基、低級烷氧基如甲氧基、低級酰基氧基如乙酰氧基或鹵基如氯。具體地說，任選取代的不飽和雜環基為部分飽和的雜芳基，該雜芳基的定義如上述對雜芳基R3的定義。這種雜環基的實例為異噁唑烷基，尤其是5位還帶有取代基的3-異噁唑烷基或3位還帶有取代基的5-異噁唑烷基。
連接基團R4優選為柔性連接體，它將標記L或多個相同或不同的標記L連接到底物上。根據其預期應用(即底物轉移到含AGT融合蛋白的過程)選擇連接體單位。連接體還增加底物在合適溶劑中的溶解度。所用的連接體在實際應用條件下具有化學穩定性。連接體既不干擾與AGT的反應也不干擾標記L的檢測，但可構建為在式1化合物與含AGT融合蛋白反應后可在某一位點被裂解。
連接體R4為具有1-300個碳原子的直鏈或支鏈亞烷基，其中任選(a)一個或多個碳原子被氧置換，尤其是其中每隔兩個碳的碳原子都被氧取代，如1-100個乙烯氧基單位的聚乙烯氧基；(b)一個或多個碳原子被帶有氫原子的氮置換，而且相鄰的碳原子被氧代取代，表現為酰胺官能團-NH-CO-；(c)一個或多個的碳原子被氧置換，而且相鄰的碳原子被氧代取代，表現為酯官能團-O-CO-；(d)兩個相鄰碳原子之間的鍵為雙鍵或三鍵，表現為官能團-CH＝CH-或-C＝C-；(e)一個或多個碳原子被下述基團置換亞苯基、飽和或不飽和亞環烷基、飽和或不飽和亞二環烷基(bicycloalkylene)、橋聯雜芳基或橋聯的飽和或不飽和雜環基；(f)兩個相鄰的碳原子被二硫鍵-S-S-置換；或者兩個或更多個、尤其是兩個或三個上述(a)-(f)中定義的亞烷基和/或修飾亞烷基的組合，任選包含取代基。
可考慮的取代基例如為低級烷基如甲基、低級烷氧基如甲氧基、低級酰基氧基如乙酰氧基或鹵基如氯。
可考慮的其它取代基例如為α-氨基酸、尤其是天然存在的α-氨基酸結合到連接體R4中獲得的取代基，其中碳原子被如(b)中定義的酰胺官能團-NH-CO-置換。在這種連接體中，亞烷基R4的部分碳鏈被基團-(NH-CHR-CO)n-置換，其中n在1-100之間，R代表各種α-氨基酸的殘基。
其它取代基為可導致連接體R4光裂解的取代基，如鄰硝基苯基。具體地說，這種取代基鄰硝基苯基位于與酰胺鍵相鄰的碳原子上，如在基團-NH-CO-CH2-CH(鄰硝基苯基)-NH-CO中，或為聚乙二醇鏈中的取代基，如在基團-O-CH2-CH(鄰硝基苯基)-O-中。其他可考慮的光裂解連接體例如為苯甲酰甲基、烷氧基二苯乙醇酮、苯甲基硫醚和三甲基乙酰乙二醇衍生物。
如上述(e)中定義置換碳原子的亞苯基例如為1，2-、1，3-或優選的1，4-亞苯基。如上述(e)中定義置換碳原子的飽和或不飽和環烷基例如為亞環戊基、亞環己基，或亞環己基還在1位或2位不飽和。如上述(e)中定義置換碳原子的飽和或不飽和亞二環烷基例如為亞二環[2.2.1]庚基或亞二環[2.2.2]辛基，任選在2位不飽和或在2位和5位雙重不飽和。如上述(e)中定義置換碳原子的雜芳基例如為亞三唑基(triazolidene)，優選1，4-亞三唑基，或亞異噁唑基(isoxazolidene)，優選3，5-亞異噁唑基。如上述(e)中定義置換碳原子的飽和或不飽和雜環基例如為2，5-四氫呋喃二基、2，5-二噁烷二基或亞異噁唑烷基(isoxazolidinene)，優選3，5-亞異噁唑烷基。可考慮的特殊雜環基是糖部分，如α-或β-呋喃糖基或α-或β-吡喃糖基。
連接體R4可帶有一個或多個相同或不同的標記，如1-100個相同或不同的標記，尤其是1-5個，優選1、2或3個，尤其是1個或2個相同或不同的標記。
底物的標記部分L可由本領域技術人員根據融合蛋白的應用選擇。標記可使標記融合蛋白易于從其所在環境中檢測和分離。其它可考慮的標記為在標記融合蛋白所在環境中可檢測和誘導改變的標記，和/或通過標記特異性引入融合蛋白的物理和/或化學性質有助于處理融合蛋白的標記。
標記L的實例包括光譜探針，如熒光團、發色團、磁性探針或對比劑；放射性標記分子；特異性與配偶體結合、為特異性結合配偶對一部分的分子；可與其它生物分子相互作用的分子；可與其它生物分子相互作用的分子庫；可與其它分子交聯的分子；暴露于H2O2和抗壞血酸時可產生羥基的分子，如束縛金屬螯合物；在光輻射下可反應性基團的分子，如孔雀綠；共價結合到固相支持體上的分子，其中固相支持體可為載玻片、微量滴定板或任何本領域技術人員已知的聚合物；可與其互補鏈進行堿基配對的核酸或其衍生物；具有膜插入性質的脂類或其它疏水分子；具有所需酶、化學或物理性質的生物分子；或又具有上述性質任何組合的分子。
當標記L為熒光團、發色團、磁性探針或放射活性標記等時，檢測采用適合標記的標準方法，無論在體外還是在體內使用該方法。可將該方法比作綠色熒光蛋白(GFP)的應用，該蛋白與目標蛋白遺傳融合，允許在活體細胞中檢測蛋白。標記L的具體實例還可為表現非線性光學性質的硼化合物，或為在標記底物與AGT融合蛋白反應時可改變其光譜性質的FRET對成員。
依靠標記L的特殊性質，包含目標蛋白和AGT的融合蛋白可結合到固相支持體上。與含AGT融合蛋白反應的底物的標記可在與AGT反應時已結合到固相支持體上，或隨后，即轉移到AGT后，用于將AGT融合蛋白結合到固相支持體上。標記可為特異性結合配偶對的一員，該結合配偶對的另一員以共價或其它任何方式結合或可結合到固相支持體上。可考慮的特異性結合配偶對例如為生物素和親合素或鏈親合素。結合配偶對的任一部分都可作為底物的標記L，而另一員連接到固相支持體上。容易結合到固相支持體上的標記的其它實例例如為麥芽糖結合蛋白、糖蛋白、FLAG標記，或與固相支持體表面互補官能團之間可發生化學選擇性反應的反應性取代基。這種反應性取代基和互補官能團對的實例例如為胺與活化羧基形成酰胺、疊氮化物與丙炔酸衍生物經歷1，3-偶極環加成反應、胺和另一個胺官能團與外加的雙-二羧酸衍生物類雙官能團連接試劑反應產生兩個酰胺鍵、或本領域中已知的其它組合。
方便的固相支持體的實例例如為化學修飾的氧化物表面，如二氧化硅、五氧化二鉭、二氧化鈦；玻璃表面，如載玻片；聚合物表面，如微量滴定板，尤其是功能化聚合物(如以小珠的形式)；化學修飾的金屬表面，如貴金屬表面(如金和銀的表面)；或由任何上述材料制成的合適傳感元件。不可逆結合和/或點樣的AGT底物然后可用于以空間分辨(spatially resolved)的方式連接AGT融合蛋白，尤其是通過點樣，在固相支持體上表示蛋白微陣列、DNA微陣列或小分子微陣列。
當受外界刺激時標記物L能產生反應基團(如羥基)，則該基團能使AGT融合蛋白以其類似物失活，以此來研究這些蛋白質在反應中的作用。此種標記有系留金屬螯合物，其與H2O2和抗壞血酸鹽接觸可以生成羥基，還有發色團如孔雀綠，其在激光輻照下可生成羥基。用發色團與激光生成羥基也即常見的發色基團結合的激光失活技術(CALI)。本發明中，用孔雀綠作為發色團標記AGT融合蛋白，隨后用激光輻照使AGT融合蛋白或以定時控制和空間分辨方式與AGT融合蛋白反應的蛋白失活。此方式適于體內或體外。除此之外，對與AGT融合蛋白的近似物鑒別，可用特定抗體檢測該蛋白質碎片，或利用其在二維膠體電泳中的消失進行鑒別，或通過分離技術和測序技術(如質譜或通過N端分解進行蛋白質測序)鑒定蛋白質碎片。
當標記L為可與其它蛋白、例如含官能團(如順丁烯二酰亞胺、活性酯、疊氮化物或其它本領域技術人員已知的基團)的分子交聯的分子時，使可與其它蛋白相互作用(體外或體內)的AGT融合蛋白與這種標記AGT底物接觸，導致AGT融合蛋白與其相互作用的蛋白通過標記共價交聯。這樣可鑒定與AGT融合蛋白相互反應的蛋白。用于光交聯的標記L例如為二苯甲酮。交聯的一個特殊方面是，標記L分子自身是AGT的底物，導致AGT融合蛋白的二聚。這種二聚體的化學結構可為對稱的(同源二聚體)或不對稱的(異源二聚體)。
其它可考慮的標記L例如為富勒烯、用于中子捕獲處理的硼烷、如用于自定位芯片(self-addressing chips)的核苷酸或寡核苷酸、肽核酸、金屬螯合物如特異性結合DNA的鉑螯合物。
如果底物帶有兩個或更多標記，這些標記可相同或不同。
本發明提供了在體外和體內標記AGT的方法。術語體內標記AGT融合蛋白包括在細胞所有區室內進行的標記，也指在胞外隙標記AGT融合蛋白。如果AGT融合蛋白的標記在體內完成而且與AGT融合的是膜蛋白、尤其是質膜蛋白，融合蛋白的AGT部分可連接到膜的任一面，如連接到質膜的胞質面或胞外面。
如果標記在體外進行，融合蛋白的標記可在細胞提取物中進行，或使用純化或富集形式的AGT融合蛋白。
如果標記在體內或在細胞提取物中進行，優先考慮標記宿主的內源性AGT。如果宿主細胞的內源AGT不接受O6-烷基鳥嘌呤衍生物或相關化合物作為底物，對融合蛋白的標記則是特異性的。在哺乳動物細胞中，如在人、小鼠或大鼠細胞中，可標記內源AGT。在同時標記內源AGT和AGT融合蛋白會產生問題的實驗中，可使用已知的AGT缺陷細胞系。
在一個具體的方面，本發明提供了測定候選化合物或候選化合物庫與靶蛋白或靶蛋白庫相互作用的方法。候選化合物和靶蛋白的實例包括配基和蛋白質、藥物和藥物靶點、或小分子和蛋白。在本發明的該具體方法中，融合AGT的目標蛋白包含轉錄因子的DNA結合域或轉錄因子的活化域。物質的推定蛋白靶點或蛋白庫與轉錄因子的DNA結合域或活化域連接，其連接方式可形成有功能的轉錄因子，并且本發明AGT酶底物的L標記為可能與目標物質相互作用的候選化合物或候選化合物庫。作為底物一部分的候選化合物或候選化合物庫然后被轉移到AGT融合蛋白上。轉移后，包含靶物質的ATG融合蛋白被候選化合物標記。與AGT融合蛋白連接的候選化合物和與DNA結合域或活化域融合的靶蛋白質的相互作用導致有功能轉錄因子的形成。活化的轉錄因子可驅動報道基因的表達，如果該方法在細胞外進行，若該報道基因的表達可給予細胞選擇優勢，則可檢測到該報道基因的表達。在具體實施例中，該方法可能涉及一個或多個其它步驟，例如檢測、分離、鑒定或定性候選化合物或靶物質。
在一個具體實例中，標記L為與未鑒定蛋白Y結合的藥物或生物活性小分子。期望可表達未鑒定靶蛋白Y的生物cDNA文庫與轉錄因子的活化域融合，并且AGT與轉錄因子的DNA結合域融合；或者，期望可表達未鑒定靶蛋白Y的生物cDNA文庫與轉錄因子的DNA結合域融合，并且AGT與轉錄因子的活化域融合。只有在該分子與存在于cDNA文庫中的靶蛋白Y結合并且分別融合到活化域或結合域上時，加入本發明包含該標記L的AGT底物導致有功能轉錄因子的形成和基因表達。如果基因表達與選擇優勢相連，則可鑒定出攜帶相應質粒的宿主，該質粒具有編碼該藥物或生物活性分子靶蛋白Y的基因。
在另一個具體實例中，標記L為化學分子庫。該庫期望包含在體內條件下與已知藥物靶蛋白Y結合的未鑒定化合物。靶蛋白Y與轉錄因子的活化域融合，并且AGT與轉錄因子的DNA結合域融合；或者，靶蛋白Y與轉錄因子的DNA結合域融合，并且AGT與轉錄因子的活化域融合。加入攜帶化合物庫的底物，導致庫中的化合物與AGT共價連接，該AGT分別與轉錄因子的DNA結合域或轉錄因子的活化域融合。只有在化學庫中的化合物通過AGT-底物鍵與轉錄因子中的DNA結合域或活化域連接，并分別與融合了轉錄因子活化域或DNA結合域的靶蛋白Y結合時，連接在AGT融合蛋白上的庫化合物(表示標記)與靶蛋白Y的相互作用才會導致有功能轉錄因子的形成和基因表達。如果基因表達與選擇優勢相連，則可確認導致宿主生長的庫分子。
當L為將R4和R1連接形成環狀底物的鍵時，優選化合物為環狀底物，其中連接R4和R1的鍵為連接連接體R4和氨基R6的鍵(如式2中的定義)。在這種優選環狀底物中，R2優選為寡核苷酸，即結合到單鏈寡聚脫氧核糖核苷酸中的β-D-2′-脫氧核糖基，該寡核苷酸如上面的詳述長2-99個核苷酸。該寡核苷酸可進一步被化學修飾，如此其可被檢測并因此具有標記的功能。取代基的化學修飾與上述對L標記的修飾本質上是相同的。
當L為其它R3-CH2-X-R1-R2基團時，底物為二聚化合物，在與包含AGT的融合蛋白反應時導致融合蛋白的二聚。
實施例實施例1谷胱甘肽S-轉移酶(C)hAGT融合蛋白hAGT克隆到表達載體pGEX2T(Pharmacia)的BamHl和EcoRl位點之間。蛋白質表達在大腸桿菌菌株JM83中進行。對數生長的培養物用1mM的IPTG誘導，表達在24℃下進行3.5小時。收集細胞，重懸于加入了1mM PMSF和2μg/mL抑酶肽的PBS，用溶菌酶和超聲波破碎。為了除去DNA，MgCl2調整為1mM，加入DNA酶至濃度為0.01mg/mL。混合物在冰上放置30分鐘，然后在40,000×g下離心分離細胞碎片。提取物上樣到平衡后的谷胱甘肽瓊脂糖，然后用一倍床體積的pH8.5的Tris·HCl和20倍床體積的PBS洗滌。然后GST-hAGT融合蛋白用50mM Tris·HCl(pH7.9)中的10mM還原谷胱甘肽洗脫。純化后的蛋白用pH7.2的50mMHEPES、1mM DTT和30％丙三醇透析，然后-80℃貯存。純化的GST-hAGT在體外與O6-苯甲基鳥嘌呤(Sigma)或O6-4-溴代噻吩甲基鳥嘌呤孵育。在90μl的總反應體積中，0.4μM的GST-hAGT與2μM溶于pH7.2的50mMHEPES的底物和1mM DTT在室溫下孵育。
在某些時間點上，一等份試樣用8.5pmol O6-苯甲基鳥嘌呤寡核苷酸猝滅，該核苷酸通過O6位與生物素基團連接(R.Damoiseaux等，Chem Biochem 4285，2001)，反應持續10分鐘，然后與SDS-Laemmli緩沖液混合，用于蛋白質印跡分析(中性鏈親合素-過氧化物酶偶聯物(PIERCE)，復活試劑+(NEN))。相應條帶的亮度用Kodak Image Station440測量。
實施例2乳清酸核苷-5′-磷酸脫羧酶Ura3(C)hAGT融合蛋白使用基于酵母穿梭載體pRS314的質粒(Sikorski和Hieter，Genetics 12219-27，1999)。在pRS314的BamHl和EcoRl限制性酶切位點中插入銅誘導的啟動子(CU-啟動子)。在Bgl II和Kpn I位點之間插入Ura3基因(帶有N端HA標記)，并在EcoR1和BgIII位點之間插入hAGT，形成hAGT-Ura3融合蛋白。
用0.1mM CuSO4誘導5mL OD600值0.3的培養物，孵育3小時，監測hAGT-Ura3融合蛋白的表達水平。離心3mL培養液收集細胞，重懸于50μL 2×Laemmli緩沖液，用3個冰凍-解凍循環破碎。樣品上樣于SDS-PAGE，然后進行蛋白質印跡(小鼠HA.11抗體(BABCO)；過氧物化酶偶聯的抗小鼠抗體A4416(Sigma)；復活試劑+(NEN))。
通過在含CuSO4且無尿嘧啶的平板上生長轉化體，測定Ura3的活力。通過ELISA法測定hAGT-Ura3融合蛋白的活力向50mL CM培養基中加入0.1mM CuSO4和100μM O6-苯甲基鳥嘌呤，與5mL靜置生長過夜的培養物孵育。蛋白表達進行約5小時，直到OD600達到1.0。收集的細胞重懸于酵母分解緩沖液(pH7.5的50mM HEPES；150mM NaCl；5mM EDTA；1％TX100；1mM DTT；1mM PMSF；2μg/mL抑酶肽)，用3個冰凍-解凍循環破碎。300μL所得提取物與5pmol在O6位連接生物素基團的O6-苯甲基鳥嘌呤-寡核苷酸孵育(R.Damoiseaux等，ChemBiochem 4285，2001)，然后包被到已經封閉的StreptaWell平板(Boehringer Mannheim)上，持續1小時。然后用標準方法進行ELISA(用HA.11和A4416抗體檢測；用過氧化物酶底物ABTS顯色(100mM檸檬酸鈉中，1.0mg/mL ABTS和0.01％H2O2)；在405nm處讀數)。
實施例3泛素(N)Ura3(C)hAGT融合蛋白為產生帶有N端精氨酸的hAGT，用PCR構建線狀泛素-hAGT融合蛋白，其中在構建物的兩側為EcoR1和BgIII限制性酶切位點。將構建物插入實施例2所述構建物hAGT-Ura3的EcoR1和BgIII位點之間，形成泛素-hAGT-Ura3融合蛋白。
泛素-hAGT-Ura3融合蛋白的表達水平和所獲融合蛋白的活力用實施例2中所述用于hAGT-Ura3的方法監測。
實施例4Tup1(N)W160hAGT融合蛋白Tup1涉及轉錄的葡萄糖抑制(F.E.Williams和R.Trumbly，MolCell Biol 106500-11，1990)。該核定位蛋白通過連接體DHGSG與W160hAGT的N端融合，該連接體含有克隆位點NcoI并連接Tup1的最后一個氨基酸天冬氨酸和hAGT的第一個氨基酸甲硫氨酸。為了抗體檢測，表位HA直接與hAGT的C端融合，然后是終止子。克隆的引物為ak121(N，Tup1)5′-GCATGAATTCATGACTGCCAGCGTTTCG-3′(SEQ ID No.1)、ak122(C，Tup1)5′-GGATCCCCATGGTCATTTGGCGCTATTTTTTTATAC-3′(SEQ IDNo.2)、ak125(N，hAGT)5′-CGTGACCATGGGAGTGGGATGGACAAGGATTGTGAAATG-3′(SEQ ID No.3)和ak132(C，HA)5′-GCATGGGTACCTTAAGCGTAATCTGGAACATCG-3′(SEQ ID No.4)。含表達載體p314AK1(其中Tup1-W160hAGT蛋白在pcup1啟動子的控制下)的L40酵母細胞培養物生長到OD600為0.6。通過加入CuSO4至100μM濃度并孵育細胞培養物2.5小時，誘導Tup1-W160hAGT的表達。通過冰凍/解凍循環裂解酵母細胞后，用蛋白質印跡(1.抗HA抗體(Babco)，2.抗小鼠-過氧化物酶偶聯物(Sigma))分析細胞提取物中表達的Tup1-W160hAGT融合蛋白的存在。當在體內用BGAF(通過對氨甲基與酰胺鍵相連而帶有5(6)-羧基熒光素二乙酸酯(diacetate of5(6)-carboxy-fluorescein)殘基的O6-(對氨甲基)苯甲基鳥嘌呤)標記核融合蛋白時，其活力可用熒光顯微鏡確證。
BGAF按照下述方法制備
在氬氣環境中，6.0mg(0.022mmol)O6-(4-氨甲基-苯甲基)鳥嘌呤溶于2mL無水DMF中(40℃，超聲30分鐘)。冷卻至室溫后，加入4.6μL三乙胺(0.033mmol)和14.8mg(0.027mmol)的5(6)-羧基熒光素N-丁二酰亞胺酯(異構體的混合物)。室溫下攪拌1小時后，除去溶劑，產物用快速柱色譜純化，使用甲醇/二氯甲烷分步梯度(1∶20、1∶10、1∶5)。在該條件下分離BGAF和BGAF的水解衍生物(稱BGFL)，并分別溶于400μL DMSO。通過熒光素的消光系數(pH7.4時ε492＝98.4×103M-1cm-1)，根據λ＝492nm處的吸光度測定BGFL的濃度。計算BGFL的濃度為4.4mM。產量1.11mg(0.0018mmol，8％)。Rf＝0.02(甲醇/二氯甲烷＝1/10)。MS(ESI)629.27(100[M+H]+)。C34H24N6O7M＝628.61g/mol。通過O6-(4-氨甲基-苯甲基)鳥嘌呤和熒光素的消光系數(ε280＝(7.1+53.3)mM-1cm-1＝60.4mM-1cm-1)，根據λ＝280nm處的吸光度測定BGAF的濃度。計算BGAF的濃度為0.8mM。產量0.23mg(0.3μmol，1.5％)。Rf＝0.38(甲醇/二氯甲烷＝1/10)。MS(ESI)713.35(100[M+H]+)。C38H28N6O9M＝712.68g/mol。
實施例5Tup1(N)增強型青色熒光蛋白ECFP(C)W160hAGT融合蛋白Tup1通過實施例4所述的連接體DHGSG融合到W160hAGT的N端。但是融合到hAGT C端的表位HA其后為熒光蛋白ECFP。克隆的引物為ak121(N，Tup1)(SEQ ID NO.1)、ak122(C，Tup1)(SEQ IDNo.2)、ak125(N，hAGT)(SEQ ID No.3)、ak126(ECFP，HA)5′-CTCGCCCTTGCTCACCATCCCGCTGCCGGACCCAGCGTAATCTGGAACATCG-3′(SEO ID No.5)、ak127(ECFP，HA)5′-CGATGTTCCAGATTACGCTGGGTCCGGCAGCGGGATGGTGAGCAAGGGCGAG-3′(SEQ ID No.6)和ak128(C，ECFP)5′-CTAGCTGGGTACCGTTACTTGTACAGCTCGTCCATGA-3′(SEQID No.7)。
含表達載體p314AK1(其中Tup1-W160hAGT-ECFP蛋白在pcup1啟動子的控制下)的L40酵母細胞培養物生長至OD600為0.6。通過向加入CuSO4至100μM濃度并孵育細胞培養物2.5小時，誘導Tup1-W160hAGT-ECFP的表達。通過冰凍/解凍循環裂解酵母細胞后，用蛋白質印跡(1.抗HA抗體(Babco)，2.抗小鼠-過氧化物酶偶聯物(Sigma))分析細胞提取物中表達的Tup1-W160hAGT融合蛋白的存在。當在體內用BGAF標記核融合蛋白并且核與殘留細胞分離時，其活力可用熒光顯微鏡確證。
實施例6LexA(C)hAGT融合蛋白LexA是用于酵母雙雜合法的大腸桿菌轉錄調節子的DNA結合域。hAGT與其C端融合，位于酵母表達載體pHybLexZeo(Invitrogen)限制性酶切位點EcoRI和NotI之間。所用的引物為ak101(N，hAGT)5′-CGATACGAATTCATGGACAAGGATTGTGAAATGAAACGC-3′(SEQ ID No.8)和ak102(C，hAGT)5′-TTCATAGCGGCCGCGTCAGTTTCGGCCAGCAGGC-3′(SEQ IDNo.9)。
實施例7細胞色素C過氧化物酶CCP(C)hAGT融合蛋白在hAGT-Ura3構建物(實施例2)中，Ura3被帶有D217P和D224Y突變的CCP(不含其線粒體靶向序列)置換(Iffland等，Biochem BiophysRes Commun 286126-132，2001)。為檢測融合蛋白的CCP活力，用導致hAGT-CCP表達的載體轉化酵母，將菌落轉移到硝化纖維素上，并且(經過3個冰凍/解凍循環后)暴露于含0.02％H2O2和5或20mMABTS的50mM KH2PO4緩沖液中。這種菌落在幾分鐘內染上深綠色，而不表達蛋白的菌落僅微弱的染色。
實施例8增強型青色熒光蛋白ECFP(C)W160hAGT融合蛋白熒光蛋白ECFP融合到W160hAGT的C端，其后為終止密碼子。用PCR進行的融合，使用的引物與融合蛋白Tup1-W160hAGT-ECFP(實施例5)所用的引物相同。W160hAGT-ECFP蛋白結合到哺乳動物表達載體pNuc(Clontech)的Nhe I和BamHI位點之間。
AGT缺陷CHO細胞用編碼W160hAGT-ECFP的載體轉染。瞬時表達24小時后，生長在0.18mm厚載玻片上的細胞被轉移到灌流室中，與BGFL(5μM)孵育5分鐘。細胞用PBS緩沖液洗滌三次，以除去過量的底物。對于熒光測定，使用Zeiss LSM510激光掃描共聚焦顯微鏡(Carl Zeiss AG)。用適當的濾鏡檢測熒光素或ECFP信號(在488nm激發)。調整掃描速率和激光密度，以避免熒光探針的光漂白和細胞的破壞或形態改變。
實施例9膜蛋白ER Sec62/DHFR(C)hAGT融合蛋白以酵母基因組DNA為模板，用分別與所需DNA片段5′和3′端互補的寡核苷酸引物進行PCR，得到編碼Sec62p蛋白N端結構域中ORF(可讀框)的片斷、過氧化物酶體膜蛋白Pex10p和Pex15p的全長ORF和酵母酪蛋白激酶(YCK1)N端片斷的ORF。所有5′-引物包含附加的BamHI位點，所有3′-引物包含附加的限制性酶切位點，使3′端可框內融合到pRS314載體上的CUP1-hAGT組件中，或使YCK1的DNA片斷可融合到pRS304載體上。Sec62p蛋白N端結構域的ORF框內插入CUP1-hAGT組件和小鼠二氫葉酸還原酶(DHFR)編碼序列之間，該DHFR還帶有編碼HA表位標記(Dha)的附加序列。以包含全長AGT的質粒DNA做為模板，用與hAGT的ORF5′和3′端互補的寡核苷酸引物進行PCR，獲得CUP1-hAGT組件。3′引物包含附加的BamHI位點，5′-引物包含附加的EcoRI位點，使3′可融合到pRS314和pRS304載體的酵母CUP1啟動子上。質粒CUP1-hAGT-SEC62-314、CUP1-hAGT-PEX10-314和CUP1-hAGT-PEX15-314轉化到酵母細胞中。通過在缺乏色氨酸的選擇性培養基上生長，控制質粒的存在。為獲得hAGT-YCK1融合基因的全序列，用Sal1剪切CUP1-hAGT-YCK1-304，使剪切質粒轉化到酵母細胞中后可與染色體YCK1同源重組。可用合適的寡核苷酸作引物，通過診斷PCR確證成功的重組。
hAGT-Sec62-Dha融合蛋白的功能測定100mL表達hAGT-Sec62-Dha的釀酒酵母細胞30℃培養至OD600約為0.5，并在細胞提取前4小時加入100μM CuSO4。離心后，細胞在液氮中磨碎，蛋白用含有150mM NaCl、pH7.5的20mM HEPES、1mM EDTA和蛋白酶抑制劑的混和緩沖液(Boehringer Mannheim，Germany)提取。4℃下20,000rpm離心15分鐘后，澄清提取物用10pmol含有底物BGBT的寡核苷酸在室溫下處理20分鐘。細胞提取物與15μL Dynabead孵育4小時，小珠用1mL提取緩沖液洗滌五次。洗滌后的小珠在30μLLaemmli緩沖液中煮沸，提取物進行SDS-PAGE。蛋白質印跡到硝化纖維素上后，通過與小鼠單克隆HA抗體和辣根過氧化物酶偶聯的兔抗小鼠抗體連續孵育，檢測純化的hAGT-Sec62-Dha。
實施例105-烴色胺受體5-HT3(N)hAGT融合蛋白含5-羥色胺受體5-HT3(小鼠)的pEAK8-5HT3R質粒由H.Vogel(EPFL Lausanne，Switzerland)小組提供。W160hAGT結合到受體的第四個環(胞質)中，位于突變引入的限制性酶切位點SnaB I和Pac I之間。
用于擴增W160hAGT的引物為ak144(N，W160hAGT)5′-GCATGCTACGTAATGGACAAGGATTGTGAAATG-3′(SEQ IDNo.10)和ak145(C，W160hAGT)5′-GAGCACTTAATTAAGTTTCGGCCAGCAGGCGG-3′(SEQ IDNo.11)。用編碼5-HT3-(W160hAGT)loop4-受體的質粒轉染AGT缺陷CHO細胞。瞬時表達24小時后，生長在0.18mm厚載玻片上的細胞被轉移到灌流室中，與BGFL(5μM)孵育5分鐘。細胞用PBS緩沖液洗滌三次，以除去過量的底物。對于熒光測定，使用Zeiss LSM510激光掃描共聚焦顯微鏡(Carl Zeiss AG)。用適當的濾鏡檢測熒光素信號(在488nm激發)。調整掃描速率和激光密度，以避免熒光探針的光漂白和細胞的破壞或形態改變。
實施例11人雌激素受體hER(C)hAGT融合蛋白包含人雌激素受體的pC1-hER載體由H.Vogel小組(EPFL，Lausanne，Switzerland)提供。W160hAGT與受體C端融合，位于限制性酶切位點NheI和XhoI之間。擴增W160hAGT所需的引物為ak136(N，W160hAGT)5′-ATCGAGCTAGCGCTACCGGTCGCCACCATGGACAAGGATTGTGAAATG-3′(SEQ ID No.12)和ak151(C，W160hAGT)5′-CGTAGCTCGAGAGTTTCGGCCAGCAGGC-3′(SEQ ID No.13)。
AGT缺陷CHO細胞用編碼W160hAGT-hER的載體轉染。瞬時表達24小時后，生長在0.18mm厚載玻片上的細胞被轉移到灌流室中，與BGFL(5μM)孵育5分鐘。細胞用PBS緩沖液洗滌三次，以除去過量的底物。對于熒光測定，使用Zeiss LSM510激光掃描共聚焦顯微鏡(Carl Zeiss AG)。用適當的濾鏡檢測熒光素信號(在488nm激發)。調整掃描速率和激光密度，以避免熒光探針的光漂白和細胞的破壞或形態改變。
位于核中的融合蛋白W160hAGT-hER的標記被確認。核與細胞的其它部分有明顯的區別。
實施例12SV40大T抗原核定位序列NLS(C)hAGT和NLS/ECFP(C)hAGT猿猴病毒40大T抗原核定位序列的三個拷貝(NLS3)融合到熒光蛋白ECFP的C端，該ECFP與融合到W160hAGT C端的HA標記融合，得到W160hAGT-HA-ECFP-NLS3，或者NLS3直接融合到W160hAGT的C端形成W160hAGT-NLS3。PCR融合使用的引物與用于融合蛋白Tup1-W160hAGT-ECFP的相同(實施例5)。然后W160hAGT-HA-ECFP-NLS3或W160hAGT-NLS3分別結合到哺乳動物表達載體pNuc(Clontech)中，位于限制性酶切位點Nhe I和Bgl II之間。引物為ak136(N，W160hAGT)(SEQ ID No.12)、ak137(C，ECFP)5′-CATGCAGATCTGAGTCCGGACTTGTACAGCTC-3′(SEQ ID No.14)和ak107(C，W160hAGT)5′-CCAGGCAGATCTGTTTCGGCCAGCAGGCGGGG-3′(SEQ ID No.15)。AGT缺陷CHO細胞用編碼W160hAGT-HA-ECFP-NLS3或W160hAGT-NLS3的pNuc載體轉染。瞬時表達24小時后，生長在0.18mm厚載玻片上的細胞被轉移到灌流室中，與BGFL(5μM)孵育5分鐘。細胞用PBS緩沖液洗滌三次，以除去過量的底物。對于熒光測定，使用Zeiss LSM510激光掃描共聚焦顯微鏡(Carl Zeiss AG)。用適當的濾鏡檢測熒光素或ECFP信號(在488nm激發)。調整掃描速率和激光密度，以避免熒光探針的光漂白和細胞的破壞或形態改變。
序列表<110>洛桑生態綜合技術聯合公司(Ecole Polytechnique fédérale de Lausanne(EPFL))<120>用O6-烷基鳥嘌呤-DNA烷基轉移酶標記蛋白<130>P303A<150>EP02405855.4<151>2002-10-03<160>15<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>1gcatgaattc atgactgcca gcgtttcg 28<210>2<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>合成引物
<400>6cgatgttcca gattacgctg ggtccggcag cgggatggtg agcaagggcg ag 52<210>7<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>合成引物<400>9ttcatagcgg ccgcgtcagt ttcggccagc aggc 34<210>10<211>33
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>10gcatgctacg taatggacaa ggattgtgaa atg 33<210>11<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>11gagcacttaa ttaagtttcg gccagcaggc gg 32<210>12<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>12atcgagctag cgctaccggt cgccaccatg gacaaggatt gtgaaatg 48<210>13<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物
<400>13cgtagctcga gagtttcggc cagcaggc28<210>14<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>14catgcagatc tgagtccgga cttgtacagc tc 32<210>15<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>15ccaggcagat ctgtttcggc cagcaggcgg gg 3權利要求
1.一種標記AGT融合蛋白，所述蛋白包含選自下述的目標蛋白酶、DNA結合蛋白、轉錄調控蛋白、膜蛋白、核受體蛋白、核定位信號蛋白、蛋白質輔因子、小單亞基GTP酶、ATP結合盒蛋白、細胞內結構蛋白、具有將蛋白靶向特定細胞區室的序列的蛋白、通常用作標記或親合標記的蛋白、以及上述蛋白質的結構域或亞結構域，前提條件是所述目標蛋白不包括噬菌體λ主要頭部蛋白D(gpD)以及蛋白MHHHHHHSSA、DHFR-HA、V5-NLS-B42、HA-Ura3、SSN6。
2.權利要求1的標記AGT融合蛋白，其中目標蛋白為膜蛋白。
3.權利要求1的標記AGT融合蛋白，其中目標蛋白為激酶。
4.權利要求1的標記AGT融合蛋白，其中目標蛋白為核受體蛋白。
5.權利要求1的標記AGT融合蛋白，其中目標蛋白為磷酸酶。
6.權利要求1的標記AGT融合蛋白，其中目標蛋白為蛋白酶。
7.權利要求1的標記AGT融合蛋白，所述蛋白組成為一個或多個融合到AGT N端、C端或N端和C端的目標蛋白和帶標記的底物。
8.權利要求1的標記AGT融合蛋白，其中AGT為人AGT置換、缺失或插入一個或多個氨基酸的突變體。
9.權利要求8的標記AGT融合蛋白，其中AGT為Asn157被甘氨酸置換且Ser159被谷氨酸置換的突變體和Gly160被丙氨酸或色氨酸置換的突變體。
10.權利要求8的標記AGT融合蛋白，其中AGT為Asn157被絲氨酸置換、Ser159被組氨酸置換且Gly160被天冬酰胺置換的突變體。
11.權利要求1的標記AGT融合蛋白，其中標記為光譜探針；放射性標記分子；特異性與配偶體結合、為結合配偶對一部分的分子；可與其它生物分子相互作用的分子；可與其它生物分子相互作用的分子庫；可與其它分子交聯的分子；暴露于H2O2和抗壞血酸時會產生羥基的分子；在光輻射下可產生反應性基團的分子；共價連接到固相支持物上的分子；可與其互補鏈進行堿基配對的核酸或其衍生物；具有膜插入性質的脂類或其它疏水分子；具有所需酶、化學或物理性質的生物分子；或擁有上述屬性任何組合的分子。
12.權利要求11的標記AGT融合蛋白，其中標記為熒光團、發色團、磁性探針或是對比劑。
13.權利要求12的標記AGT融合蛋白，其中標記為熒光團。
14.權利要求11的標記AGT融合蛋白，其中標記為特異性與配偶體結合、為結合配偶對一部分的分子。
15.權利要求11的標記AGT融合蛋白，其中標記為能夠與其它分子交聯的分子。
16.權利要求11的標記AGT融合蛋白，其中的標記為連接到固相支持物上的分子。
17.權利要求16的標記AGT融合蛋白，其中固相支持物為化學修飾的氧化物表面、玻璃表面、聚合物表面、功能化聚合物和貴金屬表面。
18.權利要求17的標記AGT融合蛋白，其中固相支持物為小珠、微量滴定板或是傳感元件的形式。
19.權利要求11的標記AGT融合蛋白，其中標記為可與其互補鏈進行堿基配對的核酸或其衍生物。
20.權利要求1的標記AGT融合蛋白，所述蛋白中包含多個標記。
21.一種AGT融合蛋白，所述蛋白包含選自下述的目標蛋白酶、DNA結合蛋白、轉錄調控蛋白、膜蛋白、核受體蛋白、核定位信號蛋白、蛋白質輔因子、小單亞基GTP酶、ATP結合盒蛋白、細胞內結構蛋白、具有將蛋白靶向特定細胞區室的序列的蛋白、通常用作標記或親合標記的蛋白、以及上述蛋白質的結構域或亞結構域，前提條件是所述目標蛋白不包括噬菌體λ主要頭部蛋白D(gpD)以及蛋白MHHHHHHSSA、DHFR-HA、V5-NLS-B42、HA-Ura3、SSN6。
22.權利要求21的AGT融合蛋白，其中目標蛋白為膜蛋白。
23.權利要求21的AGT融合蛋白，其中目標蛋白為激酶。
24.權利要求21的AGT融合蛋白，其中目標蛋白為核受體蛋白。
25.權利要求21的AGT融合蛋白，其中目標蛋白為磷酸酶。
26.權利要求21的AGT融合蛋白，其中目標蛋白為蛋白酶。
27.權利要求21的AGT融合蛋白，所述蛋白組成為一個或多個融合到AGT的N端、C端或N端和C端的目標蛋白，以及帶有標記的底物。
28.權利要求21的AGT融合蛋白，其中AGT為人AGT置換、缺失或插入一個或多個氨基酸的突變體。
29.權利要求28的AGT融合蛋白，其中AGT為Asn157被甘氨酸置換且Ser159被谷氨酸置換的突變體和Gly160被丙氨酸或色氨酸置換的突變體。
30.權利要求28的AGT融合蛋白，其中AGT為Asn157被絲氨酸置換、Ser159被組氨酸置換且Gly160被天冬酰胺置換的突變體。
31.一種人AGT的突變體，其中Asn157被甘氨酸置換且Ser159被谷氨酸置換，或其中Gly160被丙氨酸或色氨酸置換，或其中Asn157被絲氨酸置換、Ser159被組氨酸置換且Gly160被天冬酰胺置換。
32.一種檢測和處理目標蛋白的方法，所述方法特征為結合到AGT融合蛋白中的目標蛋白與帶有標記的適當AGT底物接觸，在設計為識別或處理標記的系統中利用標記檢測并任選進一步處理AGT融合蛋白。
33.權利要求32的方法，所述方法還包括從目標蛋白和AGT形成AGT融合蛋白的步驟。
34.權利要求32的方法，其中目標蛋白選自酶、DNA結合蛋白、轉錄調控蛋白、膜蛋白、核受體蛋白、核定位信號蛋白、蛋白質輔因子、小單亞基GTP酶、ATP結合盒蛋白、細胞內結構蛋白、具有將蛋白靶向特定細胞區室的序列的蛋白、通常用作標記或親合標記的蛋白、以及上述蛋白質的結構域或亞結構域，前提條件是所述目標蛋白不包括噬菌體λ主要頭部蛋白D(gpD)以及蛋白MHHHHHHSSA、DHFR-HA、V5-NLS-B42、HA-Ura3、SSN6。
35.權利要求34的方法，其中目標蛋白為膜蛋白。
36.權利要求34的方法，其中目標蛋白為激酶。
37.權利要求34的方法，其中目標蛋白為核受體蛋白。
38.權利要求34的方法，其中目標蛋白為磷酸酶。
39.權利要求34的方法，其中目標蛋白為蛋白酶。
40.權利要求32的方法，其中AGT融合蛋白組成為一個或多個融合到AGT的N端、C端或N端和C端的目標蛋白。
41.權利要求32的方法，其中AGT融合蛋白中的AGT為人AGT或人AGT置換、缺失或插入一個或多個氨基酸的突變體。
全文摘要
本發明涉及將標記從合適的底物轉移到O
文檔編號C12N9/10GK1717496SQ200380104559
公開日2006年1月4日 申請日期2003年10月1日 優先權日2002年10月3日
發明者A·朱勒拉特, A·克普勒爾, K·約翰遜, T·格羅內邁爾, S·根德賴茨希, A·布雷希特 申請人:洛桑生態綜合技術聯合公司