專利名稱：環二肽類化合物的生物制備方法及用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及已知環二肽類化合物的生物制備方法及用途。
背景技術：
環二肽類化合物在人、動物、植物、真菌和細菌中均有發現，結構不同的環二肽，其生物功能差異顯著，具體包括有抑制雜草、調節鈣離子通道、抗菌、專一催化立體構型和作為細菌生理調控的信號分子等生物活性。因此，環二肽類化合物在藥物、抗生素和農用生物除草劑的研制等方面具有巨大的開發潛力。
國內有幾家科研院所在進行環二肽類化合物的研究開發，中山大學周世寧等從南海紅樹林真菌和海洋細菌發酵液中分離提純到環二肽化合物；中國科學院昆明植物化學開放研究實驗室汪有初等從北五味子果實中分離得到3個環二肽即環(亮-脯)、環(苯丙-異亮)和環(苯丙-亮)；蚌埠醫學院陶林等用化學方法合成環L-苯丙-L-脯；中國科學院昆明植物研究所植物化學與西部植物資源國家重點實驗室熊江等從多蕊商陸根的乙醇提取物中分離到環二肽類化合物。
國外對環二肽類化合物的研究比較活躍，主要集中在對生物活性的探討上，Yasuo kimura等從penicillium sp.中分離得到環(L-色-L-苯丙)，研究表明其在100ml/l下能強烈抑制水芹種子萌發，促進萵苣根的生長；Milne，P.J.等研究了4個環二肽化合物環(L-苯丙-L-脯)、環(L-酪-L-脯)、環(L-色-L-脯)和環(L-色-L-色)，結果表明這4個環二肽化合物均具有潛在的抗肌肉緊張、抗瘤和抗生素活性；Holden，Matthew T.G.等從假單胞菌發酵液中分離得到2個環二肽化合物環(D-丙-L-纈)、環(L-酪-L-脯)，研究表明對生物發光起信號調節作用。
從上世紀90年代開始，對環二肽類化合物研究開始轉向細菌，但是從野油菜黃單胞菌反枝莧致病變種發酵液中提取分離純化得到環二肽類化合物在國內外尚屬首次；而且從該發酵液中提取環二肽類化合物方法簡便可行，較化學合成成本低。
發明內容
本發明的目的在于以微生物學原理為基礎，以從根際土壤或植物組織上分離得的野油菜黃單胞菌反枝莧致病變種為菌種，經發酵、分離、提純，得到環二肽類化合物；進一步的生物活性試驗表明該類化合物對部分雜草及水稻有較強抑制作用。因此，本發明的著眼點在于以新篩選的植物致病細菌為菌種用生物的方法制備具有廣泛生物活性的環二肽類化合物及其在雜草防除中的應用。
本發明的環二肽類化合物(式1)的生物制備方法，cyclo-(-A1-A2-)(式1)其中，A1為Pro、Phe、Leu、一種脂肪族氨基酸或一種芳香族氨基酸；A2為Try、Phe、Ile、一種脂肪族氨基酸或一種芳香族氨基酸；其特征是包括以下步驟1)以保藏編號為CGMCC NO.0902的高效生物除草菌野油菜黃單胞菌反枝莧致病變種(Xanthomonas campestris pv.retroflexus)為菌種，在常規固體培養基中對該菌種進行斜面培養，復壯，25-30℃培養9-24h；然后進行種子培養，在400ml三角瓶中盛2/3體積的液體培養基，液體培養基的配方為牛肉膏0.5-2.2％，蛋白胨0.2-4％，葡萄糖0.2-4％，NH4H2PO40.05-0.5％，NaCl0.1-2.0％，以水補足體積；調初始PH6.0-7.4，在121-125℃下滅菌20-30min，冷卻后以1％的接種量接種，25-30℃培養12-32h。
2)發酵罐中盛2/3體積的液體培養基，液體培養基的配方同上述種子液體培養基的配方，以6-12％的接種量接種，通氣量按體積比為1∶0.6-1.5，25-30℃培養54-120h，得發酵液；3)發酵液離心得上清液減壓濃縮，用丙酮多次沉淀去除多糖，減壓蒸去丙酮，將剩留液pH調至3-7，用等體積的乙酸乙酯提取數次，然后合并乙酸乙酯提取液，將其減壓蒸餾濃縮至干，用1-5毫升的甲醇溶解，用硅膠柱分離，以石油醚∶乙酸乙酯按體積比從10∶1到4∶6梯度洗脫；再將鹽酸水解后茚三酮顯色的部分用硅膠柱分離，薄層層析法分析后將性質相同的組分合并，制得環二肽類化合物。
本發明具有以下優點1.用生物的方法從菌發酵液中分離提純到環二肽類化合物，相對于化學合成，其方法簡便可行，對環境沒有污染；2.用生物的方法從菌發酵液中分離提純到環二肽類化合物，相對于化學合成，其周期短(一般為5-7天一個循環)；所用原料廉價，易于形成大規模批量生產，生產成本低；
3.用高效生物除草菌野油菜黃單胞菌反枝莧致病變種(Xanthomonascampestris pv.retroflexus)為菌種發酵生產環二肽類化合物，部分環二肽產率較高；該環二肽類化合物表現有較強的生物活性，可用于開發成為生物除草劑。
圖1是環二肽類化合物的生物制備工藝流程圖；圖2是環(-脯-苯丙-)對植物根的生物抑制活性測定圖；圖3是環(-脯-苯丙-)對植物莖的生物抑制活性測定圖；圖4是環(-異亮-苯丙-)對植物根的生物抑制活性測定圖；圖5是環(-異亮-苯丙-)對植物莖的生物抑制活性測定圖；圖6是環(-色-苯丙-)對植物根的生物抑制活性測定圖；圖7是環(-色-苯丙-)對植物莖的生物抑制活性測定圖。
具體實施例方式
實施例1環二肽類化合物的生物制備1)將高效生物除草菌野油菜黃單胞菌反枝莧致病變種(Xanthomonascampestris pv.retroflexus)菌種，在常規固體培養基中進行斜面培養，復壯，25℃培養24h；然后進行種子培養，在400ml三角瓶中盛2/3體積的液體培養基，液體培養基的配方為(按質量/體積比)牛肉膏2.2％，蛋白胨0.4％，葡萄糖0.2％，NH4H2PO40.5％，NaCl2.0％，以水補足體積；調初始PH值為6.0，在121℃下滅菌20min，冷卻后以1％的接種量接種，25℃培養32h。
2)發酵罐中盛2/3體積的液體培養基，液體培養基的配方同上述種子液體培養基的配方，以10％的接種量接種，通氣量按體積比為1∶1.5，27℃培養120h，得發酵液；3)發酵液離心得上清液，減壓濃縮，丙酮多次沉淀去除多糖，減壓蒸去丙酮，將剩留液pH調至7，用等體積的乙酸乙酯提取三次，最后減壓蒸餾濃縮至干，用4毫升的甲醇溶解，用硅膠柱分離，以石油醚∶乙酸乙酯按體積比從10∶2到4∶6梯度洗脫；再按常規方法將鹽酸水解后茚三酮顯色的部分用硅膠柱分離純化，薄層層析法分析后將性質相同的組分合并，得8個組分，經氣、液色譜，質譜，核磁共振分析證實為環(-脯-苯丙-)、環(-異亮-苯丙-)、環(-色-苯丙-)、環(-脯-色-)、環(-脯-亮-)、環(-苯丙-苯丙-)、環(-脯-酪-)、環(-色-色)，其中環(-脯-苯丙-)、環(-異亮-苯丙-)的含量分別達200mgL-1和100mgL-1。以10噸的發酵罐為例，發酵一次，經分離純化可分別得純環(-脯-苯丙-)和環(-異亮-苯丙-)各1.5kg和0.8kg。
實施例2環二肽類化合物的生物制備1)將高效生物除草菌野油菜黃單胞菌反枝莧致病變種(Xanthomonascampestris pv.retroflexus)菌種，在常規固體培養基中進行斜面培養，復壯，25℃培養24h；然后進行種子培養，在400ml三角瓶中盛2/3體積的液體培養基，液體培養基的配方為牛肉膏0.5％，蛋白胨0.2％，葡萄糖0.5％，NH4H2PO40.05％，NaCl0.5％，以水補足體積；調初始PH值為6.0，在121℃下滅菌20min，冷卻后以1％的接種量接種，25℃培養28h。
2)發酵罐中盛2/3體積的液體培養基，液體培養基的配方同上述種子液體培養基的配方，以6％的接種量接種，通氣量按體積比為1∶0.6，25℃培養100h，得發酵液；3)發酵液離心得上清液，減壓濃縮，丙酮多次沉淀去除多糖，減壓蒸去丙酮，將剩留液pH調至7，用等體積的乙酸乙酯提取三次，最后減壓蒸餾濃縮至干，用5毫升的甲醇溶解，用硅膠柱分離，以石油醚∶乙酸乙酯按體積比從9∶2到5∶5梯度洗脫；再按常規方法將鹽酸水解后茚三酮顯色的部分用硅膠柱分離純化，薄層層析法分析后將性質相同的組分合并，得8個組分，經氣、液色譜，質譜，核磁共振分析證實為環(-脯-苯丙-)、環(-異亮-苯丙-)、環(-色-苯丙-)、環(-脯-色-)、環(-脯-亮-)、環(-苯丙-苯丙-)、環(-脯-酪-)、環(-色-色)，其中環(-脯-苯丙-)、環(-異亮-苯丙-)的含量分別達100mgL-1和50mgL-1。以10噸的發酵罐為例，發酵一次，經分離純化可分別得純環(-脯-苯丙-)和環(-異亮-苯丙-)各0.8kg和0.4kg。
實施例3環(-脯-苯丙-)的植物生長抑制活性測定將反枝莧、早熟禾等雜草和水稻種子催芽，選飽實露白種子各10粒置培養皿內，將環(-脯-苯丙-)化合物配成5、50、500mgL-1三個濃度梯度，每皿加液10ml，各設三個重復，置于人工氣候箱內，在溫度25、濕度75％、12小時光照條件下培養6天，測根莖長度，與清水對照對比，求出抑制率，見圖2，圖3。試驗表明，環(-脯-苯丙-)對所測三種植株的根莖均有抑制作用，其中對根的抑制明顯高于對莖的抑制，而不同植物又呈現差異，其中對反枝莧雜草的抑制又明顯高過其它兩種植物。
實施例4環(-異亮-苯丙-)的植物生長抑制活性測定將反枝莧、早熟禾等雜草和水稻種子催芽，選飽實露白種子各10粒置培養皿內，將環(-異亮-苯丙-)化合物配成5、50、500mgL-1三個濃度梯度，每皿加液10ml，各設三個重復，置于人工氣候箱內，在溫度25、濕度75％、12小時光照條件下培養6天，測根莖長度，與清水對照對比，求出抑制率，見圖4，圖5。試驗表明，環(-異亮-苯丙-)對所測三種植株的根莖均有抑制作用，其中對根的抑制明顯高于對莖的抑制，但總體活性要低于環(-脯-苯丙-)。
實施例5環(-色-苯丙-)的植物生長抑制活性測定將反枝莧、早熟禾等雜草和水稻種子催芽，選飽實露白種子各10粒置培養皿內，將環(-色-苯丙-)化合物配成5、50、500mgL-1三個濃度梯度，每皿加液10ml，各設三個重復，置于人工氣候箱內，在溫度25、濕度75％、12小時光照條件下培養6天，測根莖長度，與清水對照對比，求出抑制率，見圖6，圖7。試驗表明，環(-色-苯丙-)對所測三種植株的根莖均有抑制作用，其中對根的抑制要高于對莖的抑制，不同植物抑制率不同，其中對早熟禾雜草根的抑制明顯高過其它兩種植物。
權利要求
1.環二肽類化合物(式1)的生物制備方法，cyclo-(-A1-A2-)(式1)其中，A1為Pro、Phe、Leu、一種脂肪族氨基酸或一種芳香族氨基酸；A2為Try、Phe、Ile、一種脂肪族氨基酸或一種芳香族氨基酸；其特征是包括以下步驟1)以保藏編號為CGMCC NO.0902的高效生物除草菌野油菜黃單胞菌反枝莧致病變種(Xanthomonas campestris pv.retroflexus)為菌種，在常規固體培養基中對該菌種進行斜面培養，復壯，25-30℃培養9-24h；然后進行種子培養，在400ml三角瓶中盛2/3體積的液體培養基，液體培養基的配方為牛肉膏0.5-2.2％，蛋白胨0.2-4％，葡萄糖0.2-4％，NH4H2PO40.05-0.5％，NaCl0.1-2.0％，以水補足體積；調初始PH值為6.0-7.4，在121-125℃下滅菌20-30min，冷卻后以1％的接種量接種，25-30℃培養12-32h。2)發酵罐中盛2/3體積的液體培養基，液體培養基的配方同上述種子液體培養基的配方，以6-12％的接種量接種，通氣量按體積比為1∶0.6-1.5，25-30℃培養54-120h，得發酵液；3)發酵液離心得上清液，減壓濃縮，用丙酮多次沉淀去除多糖，減壓蒸去丙酮，將剩留液pH調至3-7，用等體積的乙酸乙酯提取數次，然后合并乙酸乙酯提取液，將其減壓蒸餾濃縮至干，用1-5毫升的甲醇溶解，用硅膠柱分離，以石油醚∶乙酸乙酯按體積比從10∶1到4∶6梯度洗脫；再將鹽酸水解后茚三酮顯色的部分用硅膠柱分離，薄層層析法分析后將性質相同的組分合并，制得環二肽類化合物。
2.根據權利要求1所述的環二肽類化合物的用途，其特征在于該環二肽類化合物用于防除反枝莧、藜、決明、早熟禾和馬唐雜草。
全文摘要
本發明的環二肽類化合物的生物制備方法是以保藏編號為CGMCC NO.0902的高效生物除草菌野油菜黃單胞菌反枝莧致病變種為菌種，經發酵、分離、提純得多個環二肽類化合物，本發明方法簡便可行，對環境沒有污染；所用原料廉價，易于形成大規模批量生產，生產成本低，產率較高。經測定，本發明方法制得的環二肽類化合物對反枝莧、藜、決明、早熟禾、馬唐等雜草表現出較好的生物除草活性。
文檔編號C12P21/02GK1557961SQ200410015840
公開日2004年12月29日 申請日期2004年1月13日 優先權日2004年1月13日
發明者李永泉, 李明智, 莊曉峰, 孫自玲, 徐凌 申請人:浙江大學