環孢菌素a發酵生產方法

專利名稱：環孢菌素a發酵生產方法
技術領域：
本發明涉及一種環孢菌素A發酵工藝。
背景技術：
環孢菌素A(cyclosporin A，CyA)首先由瑞士山道士公司于1970年在巴塞爾微生物研究所進行抗真菌藥物篩選時，從美國和挪威的土壤中分離到兩種不完全真菌即光澤柱孢菌(Cylindrocarpon lucidum)和多孔木霉(Beauveria bassiana)產生有抗真菌活性的環孢菌素A。1974年進行動物體內免疫活性研究，1978年首次應用于臨床腎移植試驗。1980年實現環孢菌素A的全合成。1983年美國FDA批準用于臨床器官移植。其詳細的資料在Process Biochemistry 1991，26157～166文獻中已經有公開的報道。
作為一種免疫抑制劑，環孢菌素A的主要特點是抑制作用選擇性，即主要抑制T細胞的增殖與分化。環孢菌素A抑制T細胞的活化，抑制Th產生白細胞介素-2和-3，以及β干擾素等各種淋巴因子和白細胞介素-2受體的表達，從而抑制了細胞毒T細胞(Tc)的產生。在藥理劑量下，環孢菌素A對抑制性T細胞的產生沒有抑制作用，這一點對移植耐受性的形成很有意義。環孢菌素A對B細胞和巨噬細胞的增殖和功能沒有直接的抑制作用。這些特點是以前任何免疫抑制劑所沒有的。從而使免疫抑制劑的研究和應用進入了一個新的的被稱之為環孢菌素時代。
另外，研究表明環孢菌素A對自身免疫性疾病如類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡、牛皮癬、再生障礙性貧血、皮膚肌炎、內源性葡萄膜炎以及腎病綜合癥的治療有效。對血吸蟲病、瘧疾也有療效。還可以防止愛滋病病毒的擴散，以及對某些植物病如蘋果腐爛病等有效。
目前，環孢菌素A由液體發酵生產。通過研究發現，在其生物合成過程中，所有催化反應導致它的形成都是以氨基酸為前體，因此適當調整外源氨基酸的成分可以生物合成出許多不同的同系物。這既為尋找新的環孢菌素類化合物提供了可能，但同時對生產出高組分的環孢菌素A造成了一定的困難，因為它對培養基的要求比較高。目前已經發現有10種以上的微生物能夠產生這種化合物，而工業應用比較多的微生物包括上面提及的兩種外(光澤柱孢菌(Cylindrocarpon lucidum)和多孔木霉(Beauveriabassiana)，還有鐮刀孢霉等。
自上世紀八十年代以來，由于環孢菌素A的使用給器官移植帶來了巨大的變化，尤其是進入九十年代，無論從數量上還是質量上器官移植的發展都是空前的。因此提供一種新的制備環孢菌素A的方法，是有關部門所十分期望的。

發明內容
本發明所要解決的技術問題在于公開一種環孢菌素A的發酵生產方法，以克服現有技術存在的上述缺陷，滿足有關領域發展的需要。
本發明的方法包括下列步驟(1)斜面培養培養基重量組成玉米粉1.0～3.0％；葡萄糖1.0～2.0％；瓊脂1.5～2.5％，余量為水；pH6.0～6.5；溫度23～28℃，培養時間6～8天；(2)種子培養然后將菌種在如下的培養基和培養條件下進行培養培養基重量組成玉米粉1.0～5.0％；葡萄糖1.0～3.0％；KH2PO40.05～0.5％；KCl 0.01～0.05％；MgSO4.7H2O 0.001～0.005％；NaNO30.01～0.05％，余量為水；pH6.0～7.0；溫度23～30℃；
裝量10～20ml/250ml；或25～50ml/750ml；培養時間1～2天；所說的菌種是鐮孢霉屬(Fusarium solan)ATCC 46829。
術語“裝量”指的是在一定體積的發酵容器中加入的培養基的體積；(3)將發酵生產環孢菌素A的菌種接種于培養基中，接種量為5～15％，然后發酵培養；發酵培養的工藝條件為培養基重量組成玉米粉2.0～5.0％；葡萄糖1.0～3.0％；面粉1.0～4.0％；干酪素0.6～2.0％；MgSO4.7H2O 0.001～0.005％；KH2PO40.05～0.5％；NaNO30.02～0.15％；KCl 0.01～0.05％；CaCO30.1～0.5％，余量為水；優選的組分和重量百分比含量為面粉4.0％，干酪素2.0％；MgSO4.7H2O 0.005％，KH2PO40.2％，NaNO30.15％，KCl 0.05％，余量為水；pH6.0～6.5；溫度25～28℃；裝量10～20ml/250ml；或25～50ml/750ml；培養時間為4～5天；(4)然后采用常規的方法，從發酵培養產物中收集環孢菌素A。
進一步，在發酵培養時進行補料，補料采用的培養基的濃度為原發酵培養基濃度的30～40％，補料從發酵培養20～26小時開始至96小時，全程補料體積為基礎體積的30～40％。
所述“基礎體積”是指發酵開始時在發酵器中裝入的培養基的體積。
本發明的方法，相對于原來的生產配方具有較大的優越性，使用新配方發酵時CyA產生菌具有菌體合成能力增強、菌體自溶延緩等特點，同時，由于采用新配方在大規模培養時不發生泡沫現象，可采用補料工藝，由此克服了工藝中菌體合成速率過快和合成量過高而造成溶解氧不足的缺點，延長了發酵周期。同時，由于單位菌體合成CyA的能力大大地得到提高，有效組分的含量提高7％左右、放罐體積增加27％以上、放罐總十億提高159％以上，以及發酵指數提高82％以上。成品質量無明顯差別，規格符合標準。因此，在基本不增加每罐批提取成本的前提下，大大降低了每公斤CyA的制造成本。
分析樣品的制備和測試分析樣品的制備將待測發酵液樣品5ml置于10ml離心管內，加入等量的甲醇，搖勻，浸泡1h。以3000r/min速度離心分離10min，上清液置于另一10ml刻度試管內。再加入一定量(與已有的上清液相加等于10ml)的甲醇于菌絲體中，進行第二次浸泡后以同樣方法分離。合并上清液(如少于10ml，精確加入甲醇至10ml)，搖勻，吸取1ml上清液置于2ml錐形離心管內以1000r/min的速度高速離心1min。得到的上清液可直接用于HPLC分析。
HPLC分析測試色譜柱十八烷基硅烷鍵合反向柱(Hypersil ODS 250×4.6mm，5μm)，由大連化物所國家色譜中心提供。
分析系統使用Backman黃金系統支持，Backman125泵和Backman168檢測器。
色譜條件柱溫60℃；流速0.85ml/min；流動相甲醇-0.1％KH2PO4緩沖液(80∶20)；檢測波長210nm。
具體實施例方式
實施例1(1)將鐮孢霉屬(Fusarium solan)ATCC 46829。進行斜面培養，培養基重量組成為玉米粉3.0％；葡萄糖2.0％；瓊脂2.0％，余量為水；pH 6.5；溫度25℃，培養時間7天；(2)種子培養
然后將菌種在如下的培養基和培養條件下進行培養培養基重量組成玉米粉3.0％；葡萄糖2.0％；KH2PO40.2％；KCl0.05％；MgSO4.7H2O 0.005％；NaNO30.05％，余量為水；pH6.5；溫度25℃；裝量為20ml/250ml；培養時間2天；(3)將發酵生產環孢菌素A的菌種接種于培養基中，接種量為7％，然后發酵培養；發酵培養的工藝條件為培養基重量組成玉米粉3.0％；葡萄糖3.0％；面粉4.0％；干酪素1.2％；MgSO4.7H2O 0.005％；KH2PO40.2％；NaNO30.15％；KCl0.05％；CaCO30.2％，余量為水；pH6.5；溫度25℃；裝量為20ml/250ml；培養時間為4天。
(4)然后采用常規的方法，從發酵培養產物中收集環孢菌素A。
采用前述的分析測試方法進行檢測，結果如下環孢菌素A發酵單位為950μg/ml；環孢菌素A有效組分含量70％。
實施例2采用實施例1相同的方法，種子培養和發酵培養的裝量均為50ml/750ml；發酵培養培養基重量組成玉米粉3.0％；葡萄糖3.0％；面粉4.0％；干酪素0.6％；MgSO4.7H2O 0.005％；KH2PO40.2％；NaNO30.15％；KCl0.05％；CaCO30.2％，余量為水；采用前述的分析測試方法進行檢測，結果如下環孢菌素A發酵單位為850μg/ml；環孢菌素A有效組分含量69％。
實施例3環孢菌素A通氣培養的研究在進行實驗室發酵條件優化試驗時，首先研究了通氣對CyA生物合成的影響。結果發現，通氣對CyA的生物合成量影響非常大。表1所示為25℃、培養時間為4d和培養基裝量分別為50ml/750ml、100ml/750ml、150ml/750ml和200ml/750ml條件下環孢菌素A產生菌生物合成CyA和其它有關參數的代謝情況。
表1不同通氣條件下CyA產生菌生物合成和其它有關參數的代謝情況裝 量 CyA效價 CyA含量 菌絲 pH總糖 還原糖氨基酸(ml) (μg/ml)(面積％) 量 (mg/ml) (mg/ml) (mg/ml)50 892 86.1 355.63 1.31 0.10 31.1100963 87.7 395.47 2.32 0.29 35.1150654 83.3 455.49 2.55 0.42 35.3200321 84.7 425.87 3.74 0.44 39.2*即每100ml發酵液中菌絲體體積(ml)，以下個表同。
根據實驗結果，中等程度的通氣條件(100ml/750ml)，有利于CyA的生物合成。過高(50ml/750ml)或過低(大于100ml/750ml)的通氣條件都將不利于CyA的生物合成。
實施例4環孢菌素A培養溫度的研究在進行實驗室發酵條件優化試驗時，接著研究了培養溫度對CyA生物合成的影響。結果發現，培養溫度對CyA的生物合成量影響非常大。表2所示為培養基裝量為50ml/750ml、培養時間為4d和培養溫度分別25、28和30℃條件下CyA產生菌的生物合成和其他有關參數的代謝情況。
表2不同溫度下CyA產生菌生物合成和其它有關參數的代謝情況溫度CyA效價 CyA含量 菌絲 pH總糖 還原糖 氨基酸(℃)(μg/ml)(面積％) 量 (mg/ml) (mg/ml) (mg/ml)25 892 86.1 35 5.63 1.31 0.10 31.128 653 82.1 43 6.13 3.07 0.48 42.030 321 83.7 31 6.23 3.07 0.58 49.0根據實驗結果，25℃發酵條件有利于CyA的生物合成，而培養溫度偏高不利于CyA的生物合成。
實施例5環孢菌素A發酵培養基的研究在培養基試驗中所用的不同來源和不同加工方法的有機和天然氮源包括干酪素、豆粉、棉籽餅粉、蠶蛹粉、玉米漿、花生粉、麩皮粉、玉米胚芽粉、麩質粉、奶粉、酵母粉、蛋氨酸、硝酸鈉、硫酸銨等30余種。
在培養基試驗中所用的不同來源和不同加工方法的有機和天然碳源包括玉米粉、面粉、米粉、豆油、菜油、豬油、淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖、糊精、β-環糊精和甘油等近20種。
在培養基試驗種所用的無機鹽和微量元素包括氯化鈉、氯化銨、氯化鉀、硫酸銨、硫酸鎂、硝酸鈉、硝酸銨、磷酸鹽等10余種。
以上培養基試驗采用單因子或多因子添加法以及正交試驗等方法來觀察對CyA生物合成量和有效組分含量的影響。
采用培養溫度為25℃、培養基裝量為50ml/750ml或20ml/250ml的條件來進行各種有關培養基成分及其濃度的優化試驗，并將獲得的高單位培養基配方進一步作培養溫度、培養基裝量和pH等試驗以保證產生菌在新的培養基環境下發揮最大的能力。
經過對實驗室收集到的30余種不同來源和不同加工方法的有機和天然的氮源，近20種不同來源和不同加工方法的有機和天然的碳源以及10余種無機鹽和微量元素進行了4000多次的培養基配方篩選試驗，最終獲得了目前在實驗室水平發揮最佳的新配方。用原始配方和新配方培養CyA產生菌時的各種參數變化(培養溫度為25℃、培養基裝量為50ml/750ml，用原始配方時的發酵周期為4d，用新配方的培養基裝量為50ml/750ml，發酵周期為5d)的結果見表3所示。
新配方的組成(％)面粉4.0；干酪素(加熱自制)2.0；MgSO4.7H2O0.005；KH2PO40.2；NaNO30.15；KCl 0.05；pH6.5。
表3用原始配方和新配方(括號內數據)培養CyA產生菌的各種參數變化發酵時 CyA效價CyA含量 菌絲量 pH 總糖 還原糖 氨基酸間(h)(μg/ml) (面積％) (mg/ml) (mg/ml (mg/ml))0 0(0) 0(0) 5.345.61 1.3832.1(35.7)(5.73) (6.40) (2.56)2442(35)95.1(96.3) 16 5.275.13 0.8645.3(42.1)(19)(5.82) (6.20) (2.27)48127 91.3(94.2) 18 5.414.31 0.5143.4(46.2)(135)(25)(5.66) (4.68) (1.07)72296 88.7(89.5) 30 5.513.63 0.3642.1(44.8)(338)(37)(5.65) (4.26) (0.66)96683 85.4(87.7) 33 5.72 2.15 0.2737.8(41.7)(937)(39)(5.47) (2.85) (0.53)120 896 86.1(87.2) 31 5.63 1.31 0.1036.3(38.0)(1623)(34)(5.41) (2.17) (0.38)實施例6根據實施例3和實施例5的結果，采用實施例的方法進一步比較在不同通氣條件下，用新老發酵配方培養CyA產生菌時的影響，其結果如表4所示。
表4不同通氣條件下使用新發酵配方對CyA產生菌生物合成和其它有關參數的影響裝量 CyA效價 CyA含量(面 菌絲 pH總糖 還原糖 氨基酸(ml) (μg/ml) 積％) 量 (mg/ml) (mg/ml) (mg/ml)501623 87.2 345.41 2.170.38 38.0100 1597 88.2 426.62 2.200.36 39.2150 1120 83.5 346.93 2.170.22 38.7200 510 81.8 366.43 1.890.10 40.6根據實驗結果，采用新配方后通氣程度應該適當提高，否則CyA的生物合成量有所下降。
實施例7
根據實施例5和實施例5的結果，采用實施例的方法進一步比較在不同溫度條件下，用新老發酵配方培養CyA產生菌時的影響，其結果如表5所示。
表5不同溫度下使用新發酵配方對CyA產生菌生物合成和其它有關參數的影響溫 度 CyA效價CyA含量 菌絲 PH 總糖 還原糖 氨基酸(℃) (μg/ml) (面積％) 量 (mg/ml) (mg/ml) (mg/ml)251623 87.2 345.41 2.17 0.3838.02886585.4 405.43 2.13 0.3846.23072185.7 375.21 2.63 0.1037.8根據實驗結果，用新配方培養時的溫度仍然采用25℃為好，其不僅發酵單位有了很大的提高，且有效組分含量也有所提高，相反菌絲量有所下降，這都有利于下游的分離純化。
實施例8環孢菌素A在20噸發酵罐上的研究根據實驗室研究結果，可知用于CyA發酵的新配方相對于原來的生產配方具有較大的優越性。工廠在中試放大過程中根據使用新配方發酵時CyA產生菌具有菌體合成能力增強、菌體自溶延緩等特點，做了大量工藝條件優化工作，重點對新配方進行了進一步的調整。
同時，由于采用實驗室得到的新配方在大規模培養時不發生泡沫現象，從而采取了補料工藝。由此克服了工藝中菌體合成速率過快和合成量過高而造成溶解氧不足的缺點，延長了發酵周期。同時，由于單位菌體合成CyA的能力大大地得到提高，因此，在基本不增加每罐批提取成本的前提下，大大降低了每公斤CyA的制造成本。表6為采用新老發酵工藝生產CyA的生物效價、CyA的組分含量、放罐體積、放罐總億和發酵指數的比較。
補料工藝為原基礎發酵配方2倍稀釋，并從發酵至24小時開始流加至96小時結束。整個補料體積為基礎體積的三分之一。
表6新老工藝發酵生產CyA的有關參數比較(評均)參數 CyA效價 CyA含量 放罐體積 放罐總億 發酵指數(μg/ml) (面積％) (L)(十億)老工藝1028.771.6 11155 11.106 0.0496新工藝2023 76.5 14198 28.74 0.0906提高％96.66 6.84 27.28 158.88 82.66*為20t罐8批數據的平均值。
實施例9為了使在實驗室所獲得的新配方能夠放心地應用于中試和生產規模試驗，對用新舊配方培養CyA產生菌地的產物(在相同的HPLC條件下出現的峰)進行了全波長掃描比較，結構發現沒有任何變化，證明用新、舊配方培養CyA產生菌的產物相同。因此可進行中試和工業化生產規模試驗。
權利要求
1.一種環孢菌素A發酵生產方法，其特征在于，包括下列步驟(1)斜面培養培養基重量組成為玉米粉1.0～3.0％；葡萄糖1.0～2.0％；瓊脂1.5～2.2％，余量為水；(2)種子培養然后將菌種在如下的培養基和培養條件下進行培養培養基重量組成為玉米粉1.0～3.0％；葡萄糖1.0～2.0％；KH2PO40.1～0.2％；KCl 0.01～0.05％；MgSO4.7H2O 0.001～0.005％；NaNO30.01～0.05％，余量為水；所說的菌種是鐮孢霉屬(Fusarium solan)ATCC 46829。(3)將發酵生產環孢菌素A的菌種接種于培養基中發酵培養；培養基重量組成為玉米粉1.0～3.0％；葡萄糖1.0～3.0％；面粉2.0～4.0％；干酪素0.6～2.5％；MgSO4.7H2O 0.001～0.005％；KH2PO40.05～0.2％；NaNO30.05～0.15％；KCl 0.01～0.05％；CaCO30.1～0.2％；余量為水；pH6.0～6.5；溫度23～28℃；培養時間為4～5天；(4)然后采用常規的方法，從發酵培養產物中收集環孢菌素A。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，斜面培養時pH6.0～6.5；溫度23～28℃，培養時間6～8天。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，種子培養時的pH6.0～6.5；溫度23～28℃。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，種子培養時的裝量為10～20ml/250ml或25～50ml/750ml；培養時間1～2天。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，發酵培養的pH6.0～6.5；溫度23～28℃。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，發酵培養的裝量為10～20ml/250ml或25～50ml/750ml；培養時間為4～6天。
7.根據權利要求1～6任一項所述的方法，其特征在于，在發酵培養時進行補料，補料采用的培養基的濃度為原發酵培養基濃度的30～40％，補料從發酵培養20～26小時開始至90～100小時。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，全程補料體積為基礎體積的30～40％。
9.一種環孢菌素A原料發酵培養基，其特征在于，組分和重量百分比含量為面粉4.0％，干酪素2.0％；MgSO4.7H2O 0.005％，KH2PO40.2％，NaNO30.15％，KCl 0.05％，余量為水。
全文摘要
本發明屬于生物醫藥領域微生物藥物技術。本發明提供了一種環孢菌素A原料發酵生產新工藝。本發明的工藝采用了新的培養基成分和濃度，以及新的培養條件，使環孢菌素A產生菌的生物合成周期延長，克服了大生產過程中出現的泡沫問題，從而能夠采用補料工藝，最終在20t生產規模使發酵液中環孢菌素A的發酵單位上升100％、有效組分的含量提高7％左右、放罐體積增加27％以上、放罐總十億提高159％以上，以及發酵指數提高82％以上。成品質量無明顯差別，規格符合標準。
文檔編號C12PGK1570130SQ20041001817
公開日2005年1月26日 申請日期2004年5月9日 優先權日2004年5月9日
發明者陳代杰, 吳暉, 李繼安, 戈梅, 吳萍, 吳飛, 夏云飛 申請人:上海醫藥工業研究院