專利名稱：一種添加羥胺提高發酵法制備谷氨酰胺轉胺酶產量的方法
技術領域：
一種添加羥胺提高發酵法制備谷氨酰胺轉胺酶產量的方法，涉及吸水鏈霉菌發酵制備谷氨酰胺轉胺酶。
背景技術：
谷氨酰胺轉胺酶(Microbial transglutaminase，簡稱MTG)，催化蛋白質分子內的交聯、分子間的交聯、蛋白質和氨基酸之間的連接以及蛋白質分子內谷氨酰胺酰胺基的水解，從而進一步改善蛋白質功能性質，提高蛋白質的營養價值，生產出滿足人們需求的新型蛋白食品。現在谷氨酰胺轉胺酶已經廣泛應用在許多方面在肉制品加工中，谷氨酰胺轉胺酶的交聯作用將一些低價值的碎肉進行重組，從而改善其外觀、結構、風味，以提高其營養價值和市場價值；在食品加工過程中，谷氨酰胺轉胺酶可以保護食品蛋白質中的賴氨酸避免發生化學反應，從而保護限制性氨基酸；在乳制品加工中，谷氨酰胺轉胺酶提高蛋白質的營養性；在醫藥工業中，谷氨酰胺轉胺酶包埋脂類或脂溶性物質，形成耐熱耐水性的膜；在非肉類的豆類食品中，谷氨酰胺轉胺酶提高食品的彈性和持水能力；在紡織行業，谷氨酰胺轉胺酶還被用來提高蠶絲織物的品質。
現在生產MTG的方法主要是微生物發酵法生產，目前商業化的谷氨酰胺轉胺酶產品主要由日本味之素等公司生產。國內用微生物生產谷氨酰胺轉胺酶尚停留在研究階段，菌種主要是茂原鏈霉菌，生產水平很低。
發明內容
本發明的目的是一種添加羥胺提高發酵法制備谷氨酰胺轉胺酶產量的方法。
本發明的技術方案菌種吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)WSH03-13，CCTCC NO203062(中國專利03152956.9 2003年.)，由江南大學生物工程學院環境生物技術研究室保藏和提供。
培養基麥汁斜面培養基(g/L)麥汁50，葡萄糖20，酵母膏20，瓊脂20，pH7.0。
種子培養基(g/L)甘油20，葡萄糖20，酵母膏5，NaH2PO45，Na2HPO45，MgSO45，pH7.0。
發酵培養基(g/L)淀粉15，葡萄糖15，蛋白胨25，酵母膏5，碳酸鈣5，NaH2PO45，Na2HPO45，MgSO45，pH7.0。
培養方法將成熟的孢子接種到麥汁斜面上，32℃下培養7-8d。待孢子成熟后，刮取斜面上的孢子，用無菌水制成孢子懸液接種于種子培養基中，32℃搖床培養至對數生長后期。吸取種子培養液，按2-4％的接種量接種于發酵培養基中，32℃搖床培養48h。
谷氨酰胺轉胺酶活力的測定方法發酵液經離心后的清液稀釋5倍后用于活力的測定。
谷氨酰胺轉胺酶活力采用分光光度法在37℃下測定。吸取0.4ml稀釋樣品于試管中，加入1ml試劑A，37℃水浴保溫10min，加入0.4ml試劑B，終止反應，525nm比色。試劑A將100mg底物CBZ-GLN-GLY(Nalpha-Carbobenzyloxy-Glutamine Glycine)完全溶解于2ml 0.2N的NaOH中，并加入4ml a，2mlb，2ml c，調pH為6.0。(a0.2M三羥甲基氨基甲烷鹽酸(Tris-HCl)緩沖液，pH6.0；b1M羥胺；c0.01M GSH(還原型谷光甘肽))。試劑B3N HCl，12％TCA(三氯乙酸)，5％FeCl3·6H2O(溶于0.1N HCl中)按1∶1∶1混合配制。一個單位谷氨酰胺轉胺酶酶活定義(u/mL)37℃時每分鐘催化形成1μmol L-谷氨酸-γ-單羥胺酸的酶量。
提高谷氨酰胺轉胺酶產量的培養方式谷氨酰胺轉胺酶的測定原理是羥胺與底物Nα-CBZ-GLN-GLY反應生成L-谷氨酸-γ-單異羥肟酸，與鐵離子結合形成絡合物顯色，用比色法測定。因此認為羥胺是極有可能是谷氨酰胺轉胺酶合成的誘導物。系統中誘導物的存在能夠使酶提前處于工作狀態，使其產酶也處于誘導狀態從而促進產酶。
在發酵過程中，適時添加適量的羥胺可以促進產酶。通過在發酵過程中添加羥胺在發酵至36-40h添加0.3-0.7mmol/L羥胺，促進了系統產酶，發酵終了時發酵液中谷氨酰胺轉胺酶的酶活水平為5.1U/mL。
本發明的有益效果本發明選用的吸水鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicus)WSH03-13合成的谷氨酰胺轉胺酶為胞外酶，并且是迄今為止已報道過的熱、堿穩定性和蛋白質交聯特性最好的谷氨酰胺轉胺酶，用于食品加工以及紡織行業具有很大的潛力。所用的羥胺價格低廉，用量少，顯著提高了谷氨酰胺轉胺酶的產量，搖瓶培養的實驗水平達國內領先水平。
具體實施例方式
實施例1在發酵的38h添加0.5mmol/L的羥胺，發酵結束時，發酵液中谷氨酰胺轉胺酶的產量為5.3U/mL，比不加羥胺的對照例提高了32.5％。不添加羥胺的發酵液中谷氨酰胺轉胺酶的產量為4.0U/mL。
實施例2在發酵的36h添加0.3mmol/L的羥胺，發酵結束時，發酵液中谷氨酰胺轉胺酶的產量為4.6U/mL。
實施例3在發酵的40h添加0.7mmol/L的羥胺，發酵結束時，發酵液中谷氨酰胺轉胺酶的產量為5.1U/mL。
權利要求
1.一種提高發酵法制備谷氨酰胺轉胺酶產量的方法，其特征是采用吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)WSH03-13作為出發菌株，經液體發酵制備谷氨酰胺轉胺酶，通過在發酵過程中添加羥胺，實現了谷氨酰胺轉胺酶的高表達。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征是在發酵過程中添加羥胺，發酵至36-40h在發酵液中添加0.3-0.7mmol/L的羥胺。
全文摘要
一種添加羥胺提高發酵法制備谷氨酰胺轉胺酶產量的方法，涉及吸水鏈霉菌發酵制備谷氨酰胺轉胺酶。本發明采用吸水鏈霉菌為發酵菌株，經斜面培養和種子培養后，接種在發酵培養基中經液體發酵制備谷氨酰胺轉胺酶，通過在發酵過程中添加羥胺，實現了谷氨酰胺轉胺酶的高表達。本發明的優點是所用羥胺價格低廉，用量少，可顯著提高谷氨酰胺轉胺酶的產量，在其它培養條件相同的情況下，本發明比不添加羥胺的對照例產量提高約30％，達到發酵法制備谷氨酰胺轉胺酶的先進水平。
文檔編號C12P21/02GK1597928SQ20041004169
公開日2005年3月23日 申請日期2004年8月12日 優先權日2004年8月12日
發明者陳堅, 張程杰, 堵國成, 李寅 申請人:江南大學