專利名稱：一個與大豆油分含量相關的數量性狀基因位點的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域中一個與大豆油分含量相關的數量性狀基因位點。
背景技術：
大多數重要農藝性狀，如產量、品質、熟期等均表現數量性狀的遺傳特點，即受許多數量基因座位(或位點)(Quantitative Trait Loci，QTLs)和環境因子的共同作用。長期以來，數量遺傳學是以統計推理為基礎的，即將控制數量性狀的多基因作為一個整體，通過數理統計學的一級和二級統計量來剖析描述QTLs的遺傳特征。但這無法確定控制數量性狀的QTLs的數目，更無法確定單個QTL的遺傳效應以及它們在染色體上的位置。如果能將多基因性狀分解成若干個單一的遺傳組分，則可實現用研究單基因的方法去研究QTLs，并進而定位乃至克隆QTLs。許多學者運用傳統標記在不同生物上進行了類似的研究，但由于所用的常規標記的局限性，難以實現對單個QTL的遺傳效應的追蹤。DNA分子標記技術及分子連鎖圖譜的迅猛發展，提供了這種可能。
微衛星是以少數幾個核苷酸為核心單位多次串聯重復的DNA序列，是一種簡單序列重復(simple sequence repeats，SSR)，兩側一般是保守序列。由于它具有多態性高、共顯性、容易用PCR檢測和結果穩定可靠等特點，因此是一種十分理想的分子標記。
全球大豆總產量的85％用于榨油，油分含量是大豆的一種重要數量性狀。國內外在這方面開展了一些研究。Mian等(1996)利用Young×PI416937的F4代120個株系對油分進行分析，得到了3個QTL位點，位于A1和L連鎖群上。Qiu等(1999)利用Peking×Essex的F3代200個株系找到了1個與油分相關的QTL位點，位于H連鎖群。Specht等(2001)利用Minsoy×Noir的236株RIL群體找到了9個與油分相關的QTL位點，分別位于A1、D1a、D1b、F、G、I、J、L、O等連鎖群上。Chapman等(2003)利用Essex×Williams的F2代207個株系轉到了5個與油分相關的QTL位點，分別位于D2、B1等連鎖群上。國內只有吳曉雷等(2001)利用科豐1號×南農1138-2的RIL群體的201株系，找到了2個與油分相關的QTL位點，分別位于B2、M等連鎖群上。
發明創造內容本發明的目的是提供與大豆油分含量相關的一個數量性狀基因位點。
本發明所提供的與大豆油分含量相關的數量性狀基因位點，名稱為Qsoil1，定位于大豆的GM4-B2連鎖群，位于Satt556(或Satt474)和Satt094兩個SSR引物位點之間，與Satt094位點的遺傳距離為11.0cM，與Satt556(或Satt474)位點的遺傳距離為28.2cM。
Qsoil1檢測的LR值為23.23(對應LOD值為5.04)，可解釋21.98％的遺傳變異，加性效應為-0.43。
GM4-B2連鎖群如圖1所示，包括Satt094、Satt556、Satt474、Satt272、Satt168、Satt020、Sct_094和Sat_083等引物位點；位于“0cM”的SSR引物位點是Satt094，Satt556(或Satt474)與Satt094的遺傳距離為39.2cM，Satt272與Satt094的遺傳距離為45.4cM，Satt168與Satt094的遺傳距離為64.9cM，Satt020與Satt094的遺傳距離為82.7cM，Sct_094與Satt094的遺傳距離為86.1cM，sat_083與Satt094的遺傳距離為98.6cM。
實驗證明，以15個大豆高油品種品系的總DNA為模板，以Satt094(序列表中的序列1和序列2)或Satt556(序列表中的序列3和序列4)為引物進行PCR擴增，擴增得到的帶型與高油親本Charleston帶型的符合率為73.3％或86.7％。說明Qsoil1位點與大豆油分含量關系密切，證明Qsoil1是與大豆油分含量相關的一個數量性狀基因位點。
在實際應用中，可以油分含量未知的大豆品種品系的總DNA為模板，以下述引物之一Satt094(序列表中的序列1和序列2)、Satt556(序列表中的序列3和序列4)和Satt474(序列表中的序列5和序列6)為引物進行PCR擴增，如果擴增得到的帶型與已知的高油大豆品種帶型一致，則該油分含量未知的大豆品種品系為高油品種品系。
本發明定位了一個與大豆油分含量相關的數量性狀基因位點Qsoil1，可用該SSR引物位點進行高油輔助育種，快速高效地選擇高油后代個體，選育高油品種。因此本發明的與大豆油分含量相關的數量性狀基因位點，將在高油大豆的育種和生產中發揮重要作用。
圖1為大豆GM4-B2連鎖群遺傳圖譜圖2為群體油分含量頻率分布3為GM4-B2連鎖群油分QTL分析圖譜具體實施方式
實施例1、Qsoil1的獲得
1、準備材料以美國半矮桿大豆品種Charleston(♀)為母本和以東北農業大學大豆研究所的東農594(♂)為父本，按常規方法得到由154個株系構成的F10代重組自交系(RIL)群體。
種植F10代RIL群體的154個株系，隨機區組設計，5m行長，三次重復。秋季株行收獲，利用Perten 8620測定油分含量，并去除不能正常成熟的11個單株(油分含量不準確)。該群體的油分含量頻率分布結果如圖2所示，表明油分含量呈正態分布，符合重組自交系群體理論分布。
2、總DNA的提取采用改良的SDS法(Keim P，Olson TC，and Shoemaker RC.A rapid protocolfor isolating soybean DNA.Soybean Genetics Newsletter，1988，15150-152)提取步驟1中大豆各株系的總DNA。
3、SSR分析按照soybase網址(http//129.186.26.94/)上提供的大豆微衛星序列合成共500對SSR引物，其名稱分別為Satt225、Satt300、Satt276、Satt409、Satt455、Satt470、Satt233、Satt119、Satt589、Satt453、Satt415、Satt298、Satt197、Satt509、Satt063、Satt020、Satt416、Satt126、Satt338、Satt565、Satt371、Satt316、Satt286、Satt305、Satt408、Satt436、Satt203、Satt603、Satt502、Satt271、Satt141、Satt290、Satt095、Satt186、Satt389、Satt154、Satt002、Satt231、Satt369、Satt045、Satt573、Satt144、Satt334、Satt516、Satt423、Satt146、Satt218、Satt554、Satt335、Satt510、Satt472、Satt288、Satt012、Satt303、Satt130、Satt309、Satt142、Satt302、Satt314、Satt192、Satt148、Satt330、Satt049、Satt239、Satt587、Satt431、Satt596、Satt285、Satt588、Satt381、Satt242、Satt373、Satt006、Satt182、Satt551、Satt323、Satt463、Satt590、Satt387、Satt530、Satt152、Satt479、Satt259、Satt487、Sat_001、Sat_003、Sat_009、Sat_020、Sat_022、Sat_033、Sat_036、Sat_038、Sat_039、Sat_040、Sat_042、Sat_043、Sat_044、Sat_062、Sat_064、Sat_069、Sat_071、Sat_074、Sat_076、Sat_077、Sat_083、Sat_084、Sat_085、Sat_086、Sat_087、Sat_088、Sat_089、Sat_090、Sat_091、Sat_092、Sat_093、Sat_094、Sat_095、Sat_096、Sat_097、Sat_099、Sat_103、Sat_104、Sat_105、Sat_106、Sat_107、Sat_108、Sat_109、Sat_110、Sat_111、Sat_112、Sat_113、Sat_114、Sat_115、Sat_116、Sat_117、Sat_118、Sat_119、Sat_120、Sat_121、Sat_122、Sat_123、Sat_124、Sat_125、Sat_126、Sat_127、Sat_128、Sat_129、Sat_130、Sat_131、Sat_132、Sat_133、Sat_134、Sat_135、Sat_136、Sct_001、Sct_010、Sct_026、Sct_028、Sct_033、Sct_034、Sct_046、Sct_064、Sct_065、Sct_067、Sct_094、Sct_137、Sct_147、Sct_186、Sct_187、Sct_188、Sct_189、、Scaa001、Scaa003、Satt385、Satt165、Satt538、Satt187、Satt359、Satt583、Satt474、Satt556、Satt294、Satt476、Satt307、Satt184、Satt368、Satt157、Satt537、Satt458、Satt543、Satt185、Satt355、Satt269、Satt394、Satt138、Satt253、Satt434、Satt440、Satt571、Satt380、Satt244、Satt167、Satt326、Satt398、Satt462、Satt540、Satt536、Satt584、Satt393、Satt473、Satt243、Satt042、Satt511、Satt236、Satt519、Satt430、Satt168、Satt070、Satt272、Satt390、Satt429、Satt597、Satt190、Satt524、Satt164、Satt422、Satt277、Satt482、Satt402、Satt198、Satt579、Satt600、Satt350、Satt528、Satt311、Satt256、Satt230、Satt452、Satt569、Satt030、Satt490、Satt324、Satt566、Satt505、Satt442、Satt279、Satt293、Satt419、Satt127、Satt270、Satt414、Satt287、Satt132、Satt247、Satt046、Satt260、Satt446、Satt523、Satt284、Satt567、Satt308、Satt245、Satt022、Satt159、Satt009、Satt477、Satt188、Satt358、Satt038、Satt050、Satt076、Satt079、Satt080、Satt082、Satt094、Satt117、Satt134、Satt139、Satt149、Satt150、Satt151、Satt153、Satt155、Satt160、Satt162、Satt163、Satt166、Satt169、Satt172、Satt173、Satt174、Satt175、Satt179、Satt180、Satt189、Satt191、Satt193、Satt195、Satt196、Satt199、Satt200、Satt201、Satt202、Satt204、Satt211、Satt216、Satt220、Satt226、Satt229、Satt237、Satt240、Satt248、Satt249、Satt251、Satt252、Satt254、Satt257、Satt258、Satt262、Satt263、Satt266、Satt267、Satt273、Satt274、Satt278、Satt289、Satt292、Satt301、Satt318、Satt320、Satt321、Satt325、Satt327、Satt329、Satt331、Satt336、Satt341、Satt342、Satt343、Satt349、Satt354、Satt365、Satt370、Satt372、Satt376、Satt382、Satt383、Satt413、Satt420、Satt421、Satt424、Satt426、Satt428、Satt435、Satt437、Satt439、Satt445、Satt449、Satt457、Satt459、Satt460、Satt468、Satt495、Satt504、Satt514、Satt515、Satt521、Satt522、Satt527、Satt539、Satt541、Satt545、Satt547、Satt555、Satt558、Satt570、Satt574、Satt576、Satt581、Satt586、Satt031、Satt041、Satt100、Satt123、Satt145、Satt156、Satt238、Satt241、Satt264、Satt282、Satt337、Satt345、Satt348、Satt353、Satt356、Satt375、Satt396、Satt405、Satt417、Satt467、Satt471、Satt520、Satt531、Satt549、Satt550、Satt552、Satt560、Satt564、Satt592、GMABAB、GMENOD2B、GMGLPSI2、GMRUBP、SOYHSP176、SOYGPATR、SOYLBC、SOYNOD26A、SOYPRP1、GMSC514、Sat_181、Sat_182、Sat_183、Sat_185、Sat_186、Sat_187、Sat_189、Sat_190、Sat_191、Sat_192、Sat_193、Sat_217、Sat_218、Sat_219、Sat_220、Sat_221、Sat_222、Sat_223、Sat_224、Sat_226、Sat_227、Sat_228、Sat_247、Sat_250、Sat_251、Sat_252、Sat_253、Sat_254、Sat_255、Sat_256、Sat_258、Sat_259、Sat_260、Sat_319、Sat_320、Sat_321、Sat_322、Sat_324、Sat_325、Sat_326、Sat_330、Sat_331、Sat_332、Sat_333、Sat_352、Sat_353、Sat_354、Sat_355、Sat_356、Sat_357、Sat_358、Sat_359、Sat_360、Sat_361、Sat_362、Satt613、Satt614、Satt615、Satt617、Satt618、Satt619、Satt620、Satt621、Satt622、Satt623、Satt633、Satt634、Satt635、Satt636、Satt637、Satt638、Satt640、Satt641、Satt643、Satt644、Satt646、Satt716、Satt717、Satt718、Satt720、Satt723。其中引物Satt094、Satt556、Satt474、Satt272、Satt168、Satt020、Sct_094、Sat_083的序列分別如表1所示。
表1.部分SSR引物核苷酸組成
以步驟2中提取的總DNA為模板，利用上述500對SSR引物進行PCR擴增。其中PCR反應體系為采用20μl反應體系，包括30ng大豆總DNA，各1.5μmol/L的上游引物和下游引物，2.5μmol/L dNTP，1.5μl 10×緩沖液，1U Taq酶，用超純水補足20μl。循環擴增程序為95℃預變性5min，進入循環94℃變性30sec；47℃復性30sec；72℃延伸30sec；循環20次后在72℃延伸5min，置于4℃下保存。擴增產物利用銀染法顯示，照相，統計帶型。
4、數據處理將來源于親本Charleston(♀)帶型記為1，來源于東農594(♂)帶型記為2，雙親雜合帶型為3，缺失或模糊帶型記為0。利用Mapmaker/EXP3.0作圖軟件，構建分子標記連鎖圖譜。應用Group命令進行連鎖分析和分組(LOD＝5.0)，連鎖標記少于8個的用Compare命令進行優化排序，多于8個的用Ripple命令排序，錯誤檢測水平設為1％，利用Kosambi函數將重組率轉化為遺傳圖距(cM)。根據已由Cregan等定位的SSR標記作為錨定標記以確定相應的連鎖群，構建的大豆遺傳圖譜如圖1所示。
利用MapChart 2.1版本繪制連鎖圖譜。利用Windows QTL Cartographer V2.0進行復合區間作圖掃描農藝性狀的QTLs，以似然比LR(Likehood Ratio)大于11.5，即對應LOD值大于2.5作為QTLs存在的閾值，并分析確定由Satt094與Satt556兩個引物區間得到的Qsoil1為與大豆油分含量相關的一個數量性狀基因位點。由圖3可知Qsoil1定位于大豆的GM4-B2連鎖群，位于Satt556(或Satt474)和Satt094兩個引物位點之間，與Satt094位點的遺傳距離為11.0cM，與Satt556(或Satt474)位點的遺傳距離為28.2cM。Qsoil1檢測的LR值為23.23(對應LOD值為5.04)，可解釋21.98％的遺傳變異，加性效應為-0.43。圖3中，連鎖群-4(B2)，是代表大豆公共遺傳連鎖圖譜上的第四條連鎖群，代號為B2。
實施例2、Qsoil1是與大豆油分含量相關的一個數量性狀基因位點的證實實驗材料包括高油親本Charleston和高油大豆品種品系紅豐9號、東農46、東農47、瑞士CH21507、綏農10號、墾農18、瑞士SIERA、東農Q012、東農Q028、東農Q059、東農Q072、東農Q082、東農Q114、東農Q156、東農32299。
按照實施例1的方法進行以下操作提取上述大豆品種的總DNA，以上述大豆品種的總DNA為模板，分別以Satt094(序列表中的序列1和序列2)和Satt556(序列表中的序列3和序列4)為引物進行PCR擴增，結果表明Satt094擴增的結果在15個高油品種品系中，共有11個擴增帶型與高油親本Charleston帶型一致，符合率為73.3％；Satt556擴增的結果在15個高油品種品系中，共有13個擴增帶型與高油親本Charleston帶型一致，符合率為86.7％。說明Qsoil1位點與大豆油分含量關系密切，證明Qsoil1是與大豆油分含量相關的一個數量性狀基因位點。
序列表<160>6<210>1<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1ccaagtgcca atgaag 16<210>2<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2atccatggtt ttttgatg 18<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3gcgataaaac ccgataaata a21<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>4gcgttgtgca ccttgttttc t 21<210>5<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>5gcgaaatttg gaaatgacat cttagaa 27<210>6<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>6gcgacgggag aaattggatg tgaagaa 2權利要求
1.一個與大豆油分含量相關的數量性狀基因位點，定位于大豆的GM4-B2連鎖群，位于SSR引物位點Satt556或Satt474和Satt094之間，與Satt094位點的遺傳距離為11.0cM，與Satt556或Satt474位點的遺傳距離為28.2cM。
2.根據權利要求1所述的數量性狀基因位點，其特征在于所述數量性狀基因位點的LR值為23.23，可解釋21.98％的遺傳變異，加性效應為-0.43。
3.根據權利要求1或2所述的數量性狀基因位點，其特征在于所述GM4-B2連鎖群包括SSR引物位點satt094、satt556、satt474、satt272、satt168、satt020和sct_094、sat_083。
全文摘要
本發明公開了與大豆油分含量相關的一個數量性狀基因位點。本發明所提供的與大豆油分含量相關的數量性狀基因位點，定位于大豆的GM4－B2連鎖群，位于SSR引物位點Satt556或Satt474和Satt094之間，與Satt094位點的遺傳距離為11.0cM，與Satt556或Satt474位點的遺傳距離為28.2cM。所述數量性狀基因位點LR值為23.23，可解釋21.98％的遺傳變異，加性效應為－0.43。可用該位點的DNA克隆制備轉基因大豆，分析油分含量，逐步縮小DNA范圍尋找主基因。本發明的與大豆油分含量相關的數量性狀基因位點，將在高油大豆的育種和生產中發揮重要作用。
文檔編號C12N15/11GK1757728SQ200410080460
公開日2006年4月12日 申請日期2004年10月10日 優先權日2004年10月10日
發明者李文濱, 陳慶山, 張忠臣, 楊慶凱, 劉春燕, 張文慧, 張力軍, 郭強, 藤偉麗 申請人:東北農業大學