一種重組多形漢遜酵母菌及其構建方法與應用的制作方法

專利名稱：一種重組多形漢遜酵母菌及其構建方法與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種重組多形漢遜酵母菌及其構建方法與應用，特別是涉及一種重組多形漢遜酵母菌及其構建方法與其在生產外源蛋白中的應用。
背景技術：
酵母菌作為單細胞真核生物，既具有原核生物生長快，遺傳操作簡單的特點，又具有與高等真核生物相似的基因表達調控和翻譯后修飾機制，因此是生產真核生物活性蛋白理想的表達系統。在過去20多年的時間里，釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)作為第一個真核基因表達系統得到了廣泛的應用。但這一表達系統在應用過程中也存在諸多不足之處，如外源基因表達水平不高、表達蛋白的分泌水平低及多肽鏈糖基化過度、菌株不穩定等。而其他的酵母菌株，尤其是甲醇營養型酵母在外源基因的表達上則顯示出更大的優勢重組菌株遺傳穩定性高，外源蛋白的表達量和分泌效率比釀酒酵母高10-100倍，且沒有過度糖基化的現象，因此適于大規模發酵生產目的蛋白。其中的多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)除具有上述優點外，還具有其特有的優勢(1)可利用甲醇氧化酶基因(MOX)啟動子和甲醛脫氫酶基因(FMD)啟動子等強啟動子高效地啟動外源基因的表達；(2)非同源重組的頻率高，因而重組質粒可以高拷貝整合到染色體上，易獲得高拷貝整合的轉化子；(3)表達的外源蛋白通常貯存在過氧化物酶體內，可使其免受胞內蛋白酶的降解，并且降低了對細胞的毒害作用；(4)能用廉價的培養基進行高密度發酵，進一步提高外源基因的表達水平；(5)耐高溫，最適生長溫度為37℃-43℃，生長速率快，大規模發酵的培養時間短、污染率低。因此，多形漢遜酵母是目前國際上公認的最為理想的外源基因表達系統之一，適于大規模工業化生產外源蛋白。
有效的酵母表達系統包括兩個主要元件啟動外源基因高效表達的載體系統和具有特定篩選標記的宿主細胞。在多形漢遜酵母表達系統中，主要利用的是帶有營養缺陷篩選標記(leu、ura、trp或ade)的宿主細胞。由于多形漢遜酵母同源重組的頻率較低，只有當兩側的同源序列大于1kb時才可能利用類似于釀酒酵母的基因阻斷法獲得基因阻斷突變株，因此目前使用的營養缺陷型菌株多是通過化學誘變得到的，它們突出的缺點是遺傳穩定性較低，難于獲得理想的轉化子，而且可能存在多重突變效應，使細胞的生理生化特性與野生型細胞存在明顯差異，為大規模工業生產帶來不便。因此通過現代生物學技術構建遺傳穩定的、只有特定基因功能被阻斷的基因表達宿主菌是多形漢遜酵母表達系統更好地應用于工業生產亟待解決的問題。

發明內容
本發明的目的是提供一種遺傳較穩定的重組多形漢遜酵母菌。
本發明所提供的重組多形漢遜酵母菌，是乳清酸苷-5-磷酸脫羧酶基因(HURA3被阻斷的多形漢遜酵母菌。
所述重組多形漢遜酵母菌的代表是多形漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha)HU-11 CGMCC No.1218，已于2004年09月13日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCC No.1218。其菌落呈凸起狀、乳白色、有光澤、邊緣整齊，細胞呈橢圓形，該菌株的最適生長溫度為37℃，pH為5.5。
本發明的第二個目的是提供一種構建上述重組多形漢遜酵母菌的方法。
本發明所提供的構建上述重組多形漢遜酵母菌的方法，包括以下步驟1)構建乳清酸苷-5-磷酸脫羧酶基因被篩選標記基因滅活的重組載體；2)將步驟1)中的重組載體導入野生型多形漢遜酵母菌中，篩選得到乳清酸苷-5-磷酸脫羧酶基因(HURA3)被阻斷的多形漢遜酵母菌。
其中，所述篩選標記基因可為G418抗性基因、新霉素抗性基因或銅離子抗性基因。
所述G418抗性基因可為KanMX。
所述KanMX可來源于pFA6a-KanMX。
用于構建所述乳清酸苷-5-磷酸脫羧酶基因(HURA3)被篩選標記基因滅活的重組載體的出發載體可為基因工程領域中的質粒載體、絲狀噬菌體載體或酵母菌穿梭載體，優選為pUC18、pUC19、pUC118、pUC119等，尤其優選為pUC18或pUC19。
所述野生型多形漢遜酵母菌優選為多形漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha)JCM3621。
所述乳清酸苷-5-磷酸脫羧酶基因被篩選標記基因滅活的重組載體可為pHURK。
所述重組多形漢遜酵母菌為多形漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha)HU-11CGMCC No.1218。
本發明的重組多形漢遜酵母菌可用于生產外源蛋白，在實際應用中，可將目的基因導入多形漢遜酵母表達載體，得到重組表達載體，將含有目的基因的重組表達載體轉化多形漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha)HU-11 CGMCC No.1218，利用營養缺陷互補篩選獲得重組菌，對重組菌進行誘導培養，得到外源蛋白。
所述外源蛋白為淀粉酶或植酸酶。
本發明利用小片段同源序列介導的同源整合及多形漢遜酵母細胞內高頻率非同源重組的發生構建了乳清酸苷-5-磷酸脫羧酶基因(HURA3)被阻斷的重組多形漢遜酵母菌。
本發明通過基因工程手段，構建了遺傳穩定、尿嘧啶營養缺陷型的重組多形漢遜酵母菌(尿嘧啶營養缺陷型多形漢遜酵母基因工程宿主菌)，特別是多形漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha)HU-11 CGMCC No.1218，該菌株比目前國內外所用的營養缺陷型宿主菌遺傳穩定性高，回復突變率低，便于進行遺傳轉化和重組菌株的篩選，并保持了野生型菌株的生理生化特性，有利于重組菌株的培養和外源蛋白的高效表達，具有較高的工業應用價值。


圖1為重組質粒p18HURA的構建示意2為尿嘧啶營養缺陷型多形漢遜酵母基因工程宿主菌的構建示意3為質粒pMOX-Amy的物理圖譜圖4為質粒pMOXα-Amy的物理圖譜圖5為質粒pMOXα-appA的物理圖譜具體實施方式
下述實施例中所有涉及含量的百分數均為質量百分數。
下述實施例中所用限制性內切酶均購自TaKaRa公司。
實施例1、多形漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha)HU-11 CGMCC No.1218的構建及其生物量和生物活性的檢測一、構建含有多形漢遜酵母菌的乳清酸苷-5-磷酸脫羧酶基因(HURA3)的重組質粒p18HURA如圖1所示，重組質粒p18HURA的構建過程如下1、多形漢遜酵母菌的乳清酸苷-5-磷酸脫羧酶基因(HURA3)的獲得根據已報道的多形漢遜酵母菌的HURA3的核苷酸序列設計的引物序列如下引物15′-CCAGGATCCTCAACATTTCCCTGAATAAT-3′(序列表中的序列1)(劃線部分堿基為BamHI識別位點)引物25′-CGAGAATTCTCACTAGTATTCCCGCGACT-3′(序列表中的序列2)(劃線部分堿基為EcoRI識別位點)以多形漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha)JCM3621(ATCC34438)的總DNA為模板，在引物1和引物2的引導下進行PCR反應擴增HURA3，PCR反應體系為模板DNA 0.6μg，引物1 0.5μmol/L，引物2 0.5μmol/L，dNTP 200μmol/L，10×PCR緩沖液5μL，pfu DNA聚合酶(Promega公司)1單位，用去離子水補至50μL，混勻后加入20μl石蠟油；用國產PCR儀TC-96AE設置PCR反應條件為94℃5分鐘，循環1次；94℃40秒，70℃1分鐘，50℃1分鐘，29個循環；94℃40秒，70℃15分鐘，50℃1分鐘，循環1次。
將PCR產物回收并純化后，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果表明得到了大小約0.9kb的DNA片段，與預期的大小一致，將其命名為HURA3。
2、將步驟1的PCR產物經BamHI和EcoRI酶切后，與經同樣酶酶切的質粒載體pUC18(TaKaRa公司)在T4DNA連接酶作用下，16℃反應10-16小時進行連接，得到重組質粒，將其命名為p18HURA。將重組質粒p18HURA用BamHI和EcoRI限制性內切酶進行酶切鑒定，結果表明PCR擴增到的HURA3片段與GenBank中的HURA3片段具有相同的酶切圖譜；采用雙脫氧終止法測定插入重組質粒p18HURA的HURA3的核營酸序列，結果表明HURA3與已報道的HURA3的序列同源性為100％，說明擴增得到了多形漢遜酵母菌乳清酸苷-5-磷酸脫羧酶基因的編碼序列。
二、HURA3基因被阻斷的重組質粒pHURK的構建pHURK的構建過程如圖2所示，具體步驟如下1、含有G418抗性基因(KanMX)的載體pFA6a-KanMX(Wach A，Brachat A，Poehlmann R，Philippsen P.(1994)New heterologous modules for classical orPCR-based gene disruptions in Saccharomyces cerevisiaea.Yeast，101793-1808)；2、用限制性內切酶EcoRV和SacI雙酶切實施例1的重組質粒p18HURA，用限制性內切酶SmaI和SacI雙酶切步驟1的質粒載體pFA6a-KanMX，將上述酶切產物分別經低熔點瓊脂糖凝膠電泳回收約3.6Kb的p18HURA線性片段和1.48Kb的G418抗性基因(KanMX)片段，并將回收的DNA片段分別溶于TE緩沖液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)，-20℃保存備用；3、將步驟2的p18HURA線性片段和G418抗性基因(KanMX)片段用T4DNA連接酶連接，得到p18HURA載體中HURA3被阻斷，即HURA3基因功能被阻斷的重組質粒，將其命名為pHURK，連接反應體系為3μl去離子水，1μl 10×連接緩沖液，1μl濃度為0.05pmol/μl的線性化的p18HURA，4μl濃度為0.02pmol/μl的KanMX片段和1μl T4DNA連接酶；連接條件為22℃，溫育10-16小時。再將連接產物轉化大腸桿菌感受態細胞，用藍白斑法篩選陽性克隆，挑取白色單菌落接種于含有氨芐青霉素(50μg/ml)的LB液體培養基中37℃培養12-24小時后，用堿裂解法提取質粒，得到重組質粒pHURK。
三、多形漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha)HU-11 CGMCC No.1218的獲得轉化溶液的配制0.1M醋酸鋰溶液(LiAc-TE)將醋酸鋰溶于TE緩沖液(pH8.0)，使其終濃度為0.1M；40％PEG-4000醋酸鋰溶液將20克PEG4000溶于0.1M LiAc-TE中，定容至50ml；小牛胸腺DNA4mg小牛胸腺DNA溶于1ml TE緩沖液(pH8.0)，4℃ 12-24小時，反復抽吸混勻，置于100℃沸水中煮沸10分鐘后，迅速冰浴，冷卻后進行分裝，-20℃保存備用。
將步驟二的質粒pHURK用酵母菌完整細胞轉化法轉化野生型多形漢遜酵母JCM3621，經篩選獲得尿嘧啶營養缺陷型(因HURA3基因功能被阻斷)菌株，具體步驟如下1、將野生型多形漢遜酵母JCM3621接種于YEPD斜面培養基進行活化，用接種環挑取一環菌體接種于5ml YEPD液體培養基中，37℃ 150rpm搖床振蕩培養，取1.5ml處于對數生長期的菌體細胞懸液，5000rpm離心1分鐘收集菌體，用0.5ml 0.1M醋酸鋰溶液將收集的菌體清洗后，再將菌體細胞重懸于100μl 0.1M醋酸鋰溶液中，得到菌體細胞懸液；向菌體細胞懸液中加入5-10μg質粒pHURK和10μg小牛胸腺DNA，37℃保溫10分鐘，再加入700μl 40％PEG-4000醋酸鋰溶液，混勻，37℃保溫1.5小時；轉化體系中加入二甲亞砜，使其終濃度為10％(v/v)，45℃水浴熱擊5分鐘；再加入1ml液體YEPD培養基，37℃保溫30分鐘，離心收集菌體細胞，將收集的菌體細胞重懸于2ml含1mg/ml G418的液體YEPD培養基中，37℃培養12小時；2、將菌液稀釋1000倍后，取200μL涂布于含0.1mg/ml G418的YEPD平板上，37℃培養3-5天，篩選轉化子；3、篩選轉化子中的尿嘧啶營養缺陷型菌株，具體步驟如下挑取步驟2中在YEPD抗性平板上長出的單菌落于無菌水中混勻，室溫靜置4小時，然后分別接種于固體YNB(酵母菌生長基本培養基)培養平板、添加35μg/ml尿嘧啶(Ura)的固體YNB培養平板和固體YEPD平板上，37℃培養48小時，獲得在添加35μg/ml尿嘧啶(Ura)的固體YNB培養平板和YEPD平板上能夠正常生長，而在YNB培養基上不能生長的菌株，將上述菌株在YEPD平板上劃線培養，每個菌株挑取50個單菌落分別置于無菌水中，室溫靜置4小時后，分別接種于以葡萄糖作碳源的YNB培養平板、添加35μg/ml尿嘧啶(Ura)的YNB培養平板以及以甲醇作碳源的YNB、添加35μg/ml尿嘧啶(Ura)的YNB培養平板培養平板上，37℃培養48小時，結果表明在含尿嘧啶的YNB培養基上能夠生長，而在缺乏尿嘧啶的YNB培養基上不能存活的菌株為尿嘧啶缺陷型菌株，其它表型(甲醇利用、37℃生長良好)均與野生型相同；4、對步驟3獲得的尿嘧啶營養缺陷型菌株進行鑒定1)用質粒YEp352(Hill JE，Meyers AM，Koerner TJ，Tzagoloff A，Yeast/E.colishuttle vectors with multiple unique restriction sites.Yeast，1993，9163-167.)轉化上述尿嘧啶缺陷型菌株，獲得能夠被釀酒酵母乳清酸苷-5-磷酸脫羧酶基因(ScURA3)互補的菌株，從生物學功能上證明上述尿嘧啶營養缺陷型菌株即為HURA3基因功能缺失的多形漢遜酵母菌突變株；2)提取多形漢遜酵母野生型菌株JCM3621和步驟1)獲得的尿嘧啶營養缺陷型菌株的總DNA。用限制性內切酶HindIII和PstI酶切質粒pFA6a-KanMX，回收0.7kb的G418抗性基因內部的DNA片段，以此為探針進行Southern雜交檢測，結果野生型菌株和尿嘧啶營養缺陷型菌株的總DNA均未產生雜交信號，表明通過質粒pHURK引入細胞內的KanMX既沒有插入到HURA3基因內部，也沒有插入到染色體的其他部位；3)以步驟2)提取的尿嘧啶營養缺陷型菌株的總DNA為模板，在步驟一的引物1和引物2的引導下，進行高保真PCR反應擴增菌株內的HURA3基因，對PCR產物用雙脫氧法進行核苷酸序列測定，通過序列分析和同源性比較，表明在獲得的HURA3基因功能缺失的多形漢遜酵母突變株的HURA3基因內部插入了5個堿基，造成第10個密碼子之后發生移碼突變，使得細胞不能產生有活性的乳清酸苷-5-磷酸脫羧酶，將該HURA3基因功能缺失的尿嘧啶營養缺陷型多形漢遜酵母突變株(Hansenulapolymorpha)命名為HU-11，該菌株已于2004年09月13日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏號為CGMCC №1128，即為尿嘧啶營養缺陷型多形漢遜酵母基因工程宿主菌-多形漢遜酵母菌(Hansenulapolymorpha)HU-11 CGMCC No.1218(構建過程如圖2所示)。
四、檢測尿嘧啶營養缺陷型多形漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha)HU-11 CGMCCNo.1218的生物量將野生型多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)JCM3621和尿嘧啶營養缺陷型多形漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha)HU-11 CGMCC No.1218接種于YEPD斜面培養基進行活化，用接種環從斜面上挑取一環菌體接種于2ml YEPD液體培養基中，37℃振蕩培養16小時；再按10％接種量轉接于10ml YEPD液體培養基中，37℃搖床振蕩培養16小時；離心收集菌體細胞，將細胞用無菌水洗兩次，稱重后，將細胞分成等量的四份，兩份細胞為一組，將兩組細胞分別接種于50ml YEPD液體培養基中和50ml以甲醇代替YEPD中的葡萄糖的液體培養基中，再將每組中的兩份細胞分別于37℃搖床振蕩培養24小時和48小時，離心收集細胞，用無菌水洗一次，再次離心后，將收集的細胞沉淀稱重，計算其生物量。在以葡萄糖為碳源的培養基中，培養24小時，野生型菌株和尿嘧啶營養缺陷型菌株的生物量分別為27.2g/L和26.7g/L，培養48小時，生物量分別為37.8g/L和37.5g/L；以甲醇為碳源的培養基中，野生型菌株和尿嘧啶營養缺陷型菌株的生物量分別為23.4g/L(24小時)、31.7g/L(48小時)和22.9g/L(24小時)、31.5g/L(48小時)。因此多形漢遜酵母菌(Hansenulapolymorpha)HU-11 CGMCC No.1218和野生型多形漢遜酵母菌在生物量上無明顯差異，生長較穩定。
五、尿嘧啶營養缺陷型多形漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha)HU-11 CGMCCNo.1218的遺傳穩定性分析將上述構建的HURA3基因功能被阻斷的尿嘧啶營養缺陷型多形漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha)HU-11 CGMCC No.1218接種于YEPD液體培養基中傳代培養30次，取200μl經稀釋后細胞涂布于YEPD平板，37℃培養48小時，隨機挑取100個單菌落分別置于2ml無菌水中，在室溫下饑餓4-6小時；取饑餓后的菌液分別接種于以葡萄糖為碳源的YNB平板和添加35μg/ml尿嘧啶的YNB平板上以及用甲醇作碳源的YNB平板和添加35μg/ml尿嘧啶的YNB平板上，37℃培養48小時，結果表明單菌落在添加尿嘧啶的YNB基本培養基上都生長，在沒有添加尿嘧啶的YNB基本培養基上則完全不能生長，且沒有出現回復突變現象，證明本發明構建的多形漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha)HU-11 CGMCC No.1218是一株遺傳穩定，并保持了野生型多形漢遜酵母菌生理生化特性的尿嘧啶營養缺陷型突變株。
實施例2、淀粉酶基因在多形漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha)HU-11 CGMCCNo.1218中的胞內表達1)以載體YIp5(Struhl K，Stinchcomb DT，et al.High-frequencytransformation of yeastAutonomous replication of hybrid DNA molecules.ProcNatl Acad Sci USA，1979，761035-1039)為出發載體。用限制性內切酶SalI分別酶切質粒YIp5和pHARS(Roggenkamp R，Hansen H，et al.Transformation of themethylotrophic yeast Hansenula polymorphabby autonomous replication andintegration vectors.Mol Gen Genet，1986，202302-308)，低熔點瓊脂糖凝膠電泳分別回收5.6kb的線性YIp5 DNA片段和0.5kb的多形漢遜酵母自主復制序列HARS，并將回收的DNA片段分別溶于TE緩沖液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)中，進行連接反應，連接反應體系為3μl去離子水，1μl 10×連接緩沖液，1μl濃度為0.05pmol/μl的線性化的YIp5，4μl濃度為0.06pmol/μl的HARS片段和1μl T4DNA連接酶；連接條件為16℃，溫育10-16小時。再將連接產物轉化大腸桿菌感受態細胞，通過四環素抗性失活篩選陽性克隆，挑取失去四環素抗性的單菌落接種于含有氨芐青霉素(50μg/ml)的LB液體培養基中37℃培養12-24小時后，用堿裂解法提取質粒，得到重組質粒pIHARS5。用EcoRI完全酶切質粒pIHARS5后，再用SalI進行部分酶切，低熔點瓊脂糖凝膠電泳回收6.1DNA片段，溶于TE緩沖液中；用SalI和MunI酶切質粒pMPT121(Godecke S，Eckart M，et al.Identification ofsequences responsible for transcriptional regulation of the stronglyexpressed methanol oxidase-encoding gene in hansenula polymorpha，Gene，1994，13935-42)，低熔點瓊脂糖凝膠電泳回收1.8kb含甲醇氧化酶基因啟動子和終止子序列及多克隆位點的DNA片段(MOXp-MOXt)，將回收的DNA片段進行連接，轉化大腸桿菌感受態細胞，將轉化子接種于含有氨芐青霉素(50μg/ml)的LB液體培養基中37℃培養12-24小時后，用堿裂解法提取質粒，得到重組質粒pHAM1。
根據報道的扣囊復膜孢酵母α-淀粉酶基因(AMY)的核苷酸序列設計引物amy1(5′-CCGAATTCAATATGCAAATTTCAAAAGC-3′，劃線部分為EcoRI識別位點)和amy2(5′-CTGAATTCTCATGAACAAATGTCAGAAGC-3′，劃線部分為EcoRI識別位點，以扣囊復膜孢酵母(中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC No.2.1626)染色體DNA為模板進行PCR反應擴增α-淀粉酶基因(AMY)。用EcoRI分別酶切PCR擴增的α-淀粉酶基因和質粒pHAM1，低熔點瓊脂糖凝膠電泳回收1.5kb的DNA片段和7.9kb的線性載體片段，上述片段在T4DNA連接酶作用下進行連接反應，轉化大腸桿菌感受態細胞，將轉化子接種于含有氨芐青霉素(50μg/ml)的LB液體培養基中37℃培養12-24小時后，用堿裂解法提取質粒，獲得重組載體pMOX-Amy，該質粒的物理圖譜如圖3所示，該質粒帶有ScURA3基因作為遺傳轉化的篩選標記；2)遺傳轉化將重組質粒pMOX-Amy轉化多形漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha)HU-11 CGMCC No.1218，在酵母菌基本培養基上，通過營養缺陷互補篩選轉化子，可在以葡萄糖為碳源的YNB平板生長的菌株為轉化子；3)驗證轉化子挑取多形漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha)HU-11 CGMCCNo.1218和轉化子單菌落置于2ml無菌水中，在室溫條件下饑餓4-6小時，取饑餓后的菌液分別接種于以葡萄糖為碳源的YNB培養平板和添加35μg/ml尿嘧啶(Ura)的YNB培養平板以及以甲醇為碳源的YNB培養平板和添加35μg/ml尿嘧啶(Ura)的YNB培養平板上，37℃培養48小時，結果表明轉化子在不含尿嘧啶(Ura)的兩種不同碳源的YNB培養平板均能夠正常生長，從營養需求上驗證了轉化子。
4)多拷貝轉化子篩選將轉化子接于基本培養基YNB中，連續傳代培養30次，稀釋后涂YEPD平板，提取單菌落總DNA，以淀粉酶基因AMY為探針進行Southern雜交檢測，結果表明獲得了AMY高拷貝整合的重組菌株，將其命名為HU11-AMY，將重組HU11-AMY菌接種于YEPD斜面上，37℃培養48小時，4℃保存。
5)重組菌株培養將多形漢遜酵母重組菌株HU11-AMY活化后，用接種環挑取一環細胞接種于10毫升YNB液體培養基中，37℃搖床振蕩培養14-20小時獲得的菌液作為液體菌種，將液體菌種按10％的接種量接入裝有100毫升以總還原糖含量為2％的甘蔗糖蜜為碳源的合成培養基(5.0g磷酸二氫鉀，10g磷酸一銨，4.5g七水合硫酸鎂，5.0g硫酸銨，2.3g氯化鉀，0.5g氯化鈉，0.75g氯化鈣，0.1g硫酸鐵銨，8mg五水合硫酸銅，30mg七水合硫酸鋅，40mg硫酸錳，0.1g硫胺素，0.3mg生物素，適量甘蔗糖蜜，用水定容至1升)，37℃振蕩培養48小時；6)誘導培養在上述培養物中添加甲醇至終濃度為1％，37℃搖床振蕩培養48小時，期間每隔8小時按0.5％比例補加甲醇；7)培養結束后，5000轉/分鐘離心5分鐘收集細胞，按常規方法測定細胞內淀粉酶活性，表明在上述條件下，每升培養液的細胞濕重為80-85克，每克濕細胞的淀粉酶為28-32個酶活力單位。
實施例3、淀粉酶基因在多形漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha)HU-11 CGMCCNo.1218中的分泌表達1)設計并合成引物amy3(5′CCCTGCAGAATATGCAAATTTCAAAAGC-3′，劃線部分為PstI識別位點)，與實施例2中的引物amy2一起，以扣囊復膜孢酵母(中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，CGMCC No.2.1626)染色體DNA為模板，進行PCR反應擴增α-淀粉酶基因(AMY)。
設計并合成引物αP1(5′-TAAGAATTCAAAATGAGATTTCCTT-3′，劃線部分為EcoRI識別位點)和αP2(5′CGTCTGCAGCTCAGCTTCAGCCTCTCTT-3′，劃線部分為PstI識別位點)，以質粒pMETαB(Invitrogen公司)為模板，進行PCR反應擴增約0.3kb的編碼釀酒酵母α-因子信號肽的序列MFα1s。
用限制性內切酶EcoRI酶切實施例2中構建的質粒pHAM1，用限制性內切酶EcoRI和PstI酶切本實施例中PCR擴增產物AMY和MFα1s，低熔點瓊脂糖凝膠電泳回收7.9kb的線性pHAM1片段、1.5kb的α-淀粉酶基因AMY和0.3kb的α-因子信號肽序列MFα1s，上述三個DNA片段在T4DNA連接酶作用下進行連接反應，轉化大腸桿菌感受態細胞，將轉化子接種于含有氨芐青霉素(50μg/ml)的LB液體培養基中37℃培養12-24小時后，用堿裂解法提取質粒，獲得重組載體pMOXα-Amy，該質粒的物理圖譜如圖4所示，該重組質粒帶有ScURA3基因作為遺傳轉化的篩選標記，而且在外源基因編碼序列上游有分泌信號序列，可以進行外源蛋白的分泌表達；
步驟2)-6)與實施例2相同；7)培養結束后，5000轉/分鐘離心5分鐘收集細胞和上清液，按常規方法測定細胞外淀粉酶活性，表明在上述條件下，每升培養液的細胞濕重為83-87克，每升培養液總的淀粉酶為2300-2560個活力單位，其中上清液中的酶活力為總活力的91％，細胞內的淀粉酶活力僅為總活力的9％。
實施例4、植酸酶在多形漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha)HU-11 CGMCCNo.1218中的分泌表達1)質粒YEp352(Hill JE，Meyers AM，Koerner TJ，Tzagoloff A.Yeast/E.colishuttle vectors with multiple unique restriction sites.Yeast，1993，9163-167.)為出發載體，用EcoRI和SalI雙酶切質粒YEp352，回收5.2kb線性DNA片段，按實施例2步驟1)所述方法分別回收含甲醇氧化酶基因啟動子和終止子序列及多克隆位點的DNA片段(MOXp-MOXt)和多形漢遜酵母自主復制序列HARS，首先將線性YEp352與HARS進行連接反應，16℃反應8小時后，反應體系中再加入MOXp-MOXtDNA片段，16℃繼續反應8小時，連接產物轉化大腸桿菌感受態細胞，通過藍白菌落篩選陽性克隆，將白色轉化子接種于含有氨芐青霉素(50μg/ml)的LB液體培養基中37℃培養12-24小時后，用堿裂解法提取質粒，獲得重組載體pYEAM1。
根據報道的大腸桿菌植酸酶基因appA核苷酸序列設計并合成引物AP1(5′-CAACTGCAGATGAAAGCGATCTTAATCCCAT-3′，劃線部分為PstI識別位點)和AP2(5′-CCAGAATTCATTACAAACTGCACGCCGGT-3′，劃線部分為EcoRI識別位點)，以大腸桿菌(中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，CGMCC No.1.1420)基因組DNA為模板，進行PCR反應擴增1.3kb的植酸酶基因appA。用EcoRI酶切質粒pYEAM1，回收7.5kb線性DNA片段，用PstI和EcoRI酶切PCR產物，低熔點瓊脂糖凝膠電泳回收1.3kb appA基因，上述兩種DNA片段與實施例3回收的0.3kb的α-因子信號肽序列MFα1s一起進行連接，連接產物轉化大腸桿菌感受態細胞，將轉化子接種于含有氨芐青霉素(50μg/ml)的LB液體培養基中37℃培養6小時后，快速提取質粒，電泳檢測，將質粒大小正確的轉化子接種于含有氨芐青霉素(50μg/ml)的LB液體培養基中37℃培養16小時后，用堿裂解法提取質粒，獲得重組質粒pMOXα-appA，該質粒的物理圖譜如圖5所示，該質粒帶有ScURA3基因作為轉化酵母菌的篩選標記；步驟2)-6)與實施例2和3相同；7)培養結束后，5000轉/分鐘離心5分鐘收集細胞和上清液，按常規方法測定細胞內、外植酸酶活性，表明在上述條件下，每升培養液的細胞濕重為83-87克，每升培養液中的植酸酶為1700-1800個活力單位，其中92％的植酸酶分泌到培養液中。
序列表<160>2<210>1<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1ccaggatcct caacatttcc ctgaataat29<210>2<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2cgagaattct cactagtatt cccgcgact29
權利要求
1.一種重組多形漢遜酵母菌，是乳清酸苷-5-磷酸脫羧酶基因被阻斷的多形漢遜酵母菌。
2.根據權利要求1所述的重組多形漢遜酵母菌，其特征在于所述重組多形漢遜酵母菌為多形漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha)HU-11 CGMCC No.1218。
3.一種構建權利要求1所述重組多形漢遜酵母菌的方法，包括以下步驟1)構建乳清酸苷-5-磷酸脫羧酶基因被篩選標記基因滅活的重組載體；2)將步驟1)中的重組載體導入野生型多形漢遜酵母菌中，篩選得到乳清酸苷-5磷酸脫羧酶基因被阻斷的多形漢遜酵母菌。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于所述篩選標記基因為G418抗性基因、新霉素抗性基因或銅離子抗性基因；所述G418抗性基因為KanMX。
5.根據權利要求3或4所述的方法，其特征在于用于構建所述乳清酸苷-5-磷酸脫羧酶基因被篩選標記基因滅活的重組載體的出發載體為質粒載體、絲狀噬菌體載體或酵母菌穿梭載體；所述質粒載體為pUC18、pUC19、pUC118或pUC119。
6.根據權利要求3或4所述的方法，其特征在于所述野生型多形漢遜酵母菌為多形漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha)JCM3621。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于所述乳清酸苷-5-磷酸脫羧酶基因被篩選標記基因滅活的重組載體為pHURK。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于所述重組多形漢遜酵母菌為多形漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha)HU-11 CGMCC No.1218。
9.權利要求1或2所述重組多形漢遜酵母菌在生產外源蛋白中的應用。
10.根據權利要求9所述的應用，其特征在于所述外源蛋白為淀粉酶或植酸酶。
全文摘要
本發明公開了一種重組多形漢遜酵母菌及其構建方法與應用，其目的是提供一種遺傳較穩定的重組多形漢遜酵母菌及其構建方法與其在生產外源蛋白中的應用。本發明所提供的重組多形漢遜酵母菌，是乳清酸苷－5－磷酸脫羧酶基因被阻斷的多形漢遜酵母菌。其構建方法包括以下步驟1)構建乳清酸苷－5－磷酸脫羧酶基因被篩選標記基因滅活的重組載體；2)將步驟1)中的重組載體導入野生型多形漢遜酵母菌中，篩選得到乳清酸苷－5－磷酸脫羧酶基因被阻斷的多形漢遜酵母菌。本發明的重組多形漢遜酵母菌將在外源蛋白的生產中發揮重要作用。
文檔編號C12N15/81GK1651570SQ20041008051
公開日2005年8月10日 申請日期2004年9月30日 優先權日2004年9月30日
發明者何秀萍, 張博潤, 汪和睦 申請人:天津博薈生物技術有限公司