專利名稱：一種提高cp4-epsps在漢遜酵母中表達量的方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，具體涉及使用一個復合增強子以實現CP4-EPSPS融合蛋白基因在多型漢遜酵母細胞中以組成型方式高效表達的方法，其中包括1)使用一個復合增強子以提高密碼子優化后的CP4-EPSPS融合蛋白基因在漢遜酵母中的產量；幻采用畢赤酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子調控CP4-EPSPS融合蛋白基因在漢遜酵母中以組成型的方式表達；幻優化后的漢遜酵母發酵培養生長條件；4)利用納濾及鎳柱親和層析快速提純該重組外源蛋白的方法。而由此方法制備的CP4-EPSPS重組融合蛋白可作為蛋白質標準物質備選物應用于蛋白質溯源研究等領域。
背景技術：
轉基因植物蛋白質計量方法和計量標準的缺乏使得檢測結果無法溯源，因此難以保證檢測結果的準確性和可比性。現有的檢驗技術無法對轉基因食品中各種影響安全性的因素進行全面準確的測定。為了適應轉基因植物的發展和應用的要求，我國必須迅速發展轉基因蛋白質安全性評價，研究轉基因植物蛋白質計量方法和計量標準，建立轉基因植物蛋白量值溯源傳遞體系。1981年，Schnepf等人首次成功地克隆了編碼Bt殺蟲晶體蛋白，揭開了利用基因工程培育抗蟲植物的序幕。到目前為止，全球轉基因作物的目標基因種類已達到數百種，主要包括抗蟲、抗病、抗除草劑、抗逆和品質改良等。從現有產業化利用的轉基因植物來看，抗蟲和抗除草劑轉基因植物占的比例最大，廣泛應用的抗蟲基因主要有兩種，即來源于蘇云金芽孢桿菌的Bt基因和來源于植物的蛋白酶抑制劑因子基因。抗除草劑基因主要有來自農桿菌CP4菌株的EPSPS基因等。烯醇式丙酮基莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPQ是莽草酸途徑中的一個氨基酸合成必需酶，是許多除草劑如草甘膦作用的首選靶標酶。草甘膦是一種有機磷類除草劑，是目前推廣面積最大和經濟效益最高的除草劑，它可以特異地抑制EPSPS活性。科研人員將微生物來源的CP4-EPSPS基因導入多種農作物中，獲得的轉基因農作物具有良好的抗草甘膦效果。在各種轉基因作物中，抗草甘膦轉基因作物(含CP4-EPSPS)的種植和銷售最為廣泛。由美國Monsanto公司開發的抗草甘膦油菜和大豆在全球油菜和大豆種植面積中占很大的比例，近年來，我國每年進口的幾千萬噸大豆絕大部分都屬于這種轉基因作物。雖然現在市場上有大量的用于CP4-EPSPS轉基因蛋白質測定的試劑盒，但不同的廠商可能采用不同的工藝表達、分離純化原料，以及不同的方法確定參考物質的量值，而蛋白質檢測標準物質和量值溯源傳遞體系的嚴重缺乏使得不同試劑盒內所帶參考物質不能溯源到上一級的計量標準，也就無法保證不同試劑盒所帶參考物質量值的準確性與可溯源性，造成測定結果不準確和缺乏可比性，對生物安全監管帶來隱患，由此產生一系列法律、貿易等經濟和社會問題。因此，在我國范圍內，盡快研制CP4-EPSPS蛋白標準物質，建立起靈敏準確的定量測定方法及CP4-EPSPS轉基因植物蛋白量值溯源傳遞體系，對于今后保證測定結果的溯源性、準確性和可比性，顯得十分迫切且意義重大。
近幾年來，隨著人們對漢遜酵母(Hansenula polymorpha)生物學特性的深入研究，發現其作為外源基因表達宿主的優勢逐漸顯現。漢遜酵母也是一種甲醇營養型酵母，與畢赤酵母類似。漢遜酵母中甲醇代謝的主要途徑有兩種(Lodeboer A.M.，et al. , 1985)一種是在過氧化物酶體中進行，甲醇在甲醇氧化酶(methanol oxidase, MOX)作用下生成甲醛和H2O2，甲醛再經甲醛脫氫酶(formaldehyde dehydrogenase)和甲酸脫氫酶(formatedehydrogenase, FMD)作用下生成C02，H2O2在過氧化氫酶(catalase，CAT)的作用下生成H2O和& ；甲醇的另一個代謝途徑發生在過氧化物酶體外，甲醇在細胞質中經過一系列酶的催化作用最后轉變為糖類，其中二羥丙酮合成酶(dihydroxyacetone synthase,DHAS)是這一過程的關鍵酶。甲醇代謝過程中的各種關鍵酶，包括Μ0Χ、DHAS和CAT等的表達都是在轉錄水平進行調解的，它們受甲醇、甘油和山梨醇的誘導，受葡萄糖和乙醇的阻遏，但當葡萄糖濃度低于0. 時，阻遏作用即被解除。在甲醇完全誘導條件下，過氧化物酶體可占細胞總體積的80%，M0X和DHAS可占細胞總蛋白的15%，它們的啟動子具有極強的啟動下游基因表達的功能，目前已被用作外源基因在酵母中表達的常用啟動子。誘導型啟動子以其強啟動功能和嚴緊的調控機制被廣泛的應用于外源基因的表達，已有很多外源蛋白在這些啟動子的調控下在漢遜酵母細胞中得到高效的表達。目前用于漢遜酵母外源蛋白表達系統的誘導型啟動子都需要在一定劑量甲醇存在的條件下才能發揮作用，但由于甲醇是有毒物質，且易燃易爆，這樣就限制了該系統在醫藥或食品等領域的應用。因此，各種組成型啟動子就應運而生，已經成功應用于漢遜酵母外源蛋白表達系統的組成型啟動子有質膜AIPase啟動子(pPMAl)和翻譯延伸因子Ia啟動子(TEFl)等，這些組成型啟動子的應用不僅無需在發酵培養基中加入甲醇，而且也簡化了發酵工藝和降低了成本等。漢遜酵母作為外源蛋白表達宿主多采用營養缺陷型菌株來進行重組子的初步篩選，目前已得到多種營養缺陷型菌株，如亮氨酸缺陷型、甲硫氨酸缺陷型和酪氨酸缺陷型等(Seon AhCheon, et al.，2009)。同時，由于漢遜酵母對氨基糖苷類抗生素敏感，G418、Zeocin和潮霉素B等抗生素抗性基因也被廣泛地用作篩選標記。以漢遜酵母作為外源基因的表達宿主時，外源DNA整合到酵母基因組中主要可分為隨機整合和同源重組，其中同源重組需要導入的DNA中必須含有漢遜酵母的同源序列。同源序列與酵母基因組中某段DNA序列完全或部分一致，從而導致外源DNA在此位置可通過同源交換整合到酵母基因組中。漢遜酵母轉化常用的同源序列包括各種強啟動子和rDNA(Klabunde J. , et al. ,2003)序列，而本發明首次采用了漢遜酵母質膜AIPase基因作為同源整合序列。真菌質膜AIPase是上世紀70年代末首次在粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)中被發現的，隨后分別從粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)中得到提純。質膜ATPase是酵母質膜中含量最多的蛋白，占總質膜蛋白的15%，占總細胞蛋白的0. 3%，它的主要作用是作為一個跨膜的質子泵，維持細胞內的PH值和電化學梯度，從而使多種營養物質得以運輸。漢遜酵母質膜AIPase (Helen Cox, 2000)基因全長^97bp，編碼898個氨基酸。本發明中首次將其插入到漢遜酵母表達載體中作為外源基因整合的同源序列。作為外源基因的表達宿主，漢遜酵母具有許多優點1)漢遜酵母的最適生長溫度在37 43°C，菌體生長速度快，發酵時間短；2)以rDNA作為整合的同源序列，可以獲得高拷貝的轉化子，有可能極大地提高外源重組蛋白的表達量；幻多個外源基因能夠通過一步法同時被整合到酵母基因組中，并按照一定劑量關系同時或分別表達。上述優點使漢遜酵母表達系統迅速發展成為最具魅力的真核表達系統之一，目前，已經有多種外源蛋白基因在漢遜酵母中獲得了表達，見表1 表1在漢遜酵母中表達的部分外源蛋白
權利要求
1.一種使用復合增強子以提高CP4-EPSPS融合蛋白在漢遜酵母表達量的方法。
2.如權利要求1中的方法，其中所說的復合增強子具有序列表中的1所示的核苷酸序列。
3.如權利要求1中的方法，編碼CP4-EPSPS融合蛋白的DNA序列，其特征在于具有序列表3中所示的核苷酸序列。
4.如權利要求1中的方法，需構建一種表達質粒載體，其特征在于它含有權利要求2所述的復合增強子序列及權利要求3中所述的編碼CP4-EPSPS融合蛋白的DNA序列。
5.如權利4中所述的表達載體，其特征在于，在構建表達載體時，采用的起始載體為 PPIC9K或其他能夠組成型表達并分泌重組蛋白到胞外的質粒載體。
6.如權利要求1中的方法，需要一種酵母宿主細胞，其特征在于它包含權利要求4和5 中所述的表達載體。
7.如權利要求6中所述的宿主細胞，它是指漢遜酵母菌株A16或其他能夠表達外源基因的酵母菌株。
8.利用權利要求7所述的漢遜酵母菌株A16高效表達和生產CP4-EPSPS重組融合蛋白的方法，其中包括了四個階段1)種子液制備挑取酵母單菌落，接種于IOmLYPD液體培養基中，37°C振蕩培養過夜后，將該培養物轉接于IOOmL YPD培養基中，37°C振蕩培養M小時后，將該培養物轉接于3L BMGY培養基中，37°C振蕩培養48小時，然后將其作為種子液；2)初培養階段在50L發酵罐中盛放了30L基礎發酵培養基[lOXBasal Salts 2. 67%磷酸、0. 093%硫酸鈣、1. 82%硫酸鉀、1. 49%硫酸鎂、0. 413%氫氧化鉀+4%甘油]， 在接種前先加入氨水使該培養基的PH值維持在4. 0左右，再按照下述比例，在每升基礎發酵培養基中加入4. 37mL微量鹽溶液PTM1(0. 6%硫酸銅，0. 008%碘化鈉，0. 3%硫酸錳， 0. 02 %鉬酸鈉，0. 002 %硼酸，0. 05 %氯化鈷，2 %氯化鋅，6. 5 %硫酸亞鐵，0. 025 %生物素， 0. 5%硫酸)。按占基礎發酵培養基體積10%的比例接種此前制備好的種子液，37°C通氣攪拌(轉速自始至終維持在375轉/分)培養M小時左右；3)蛋白大量表達階段從接種后的第二天，通過蠕動泵流加補料液，補料液為50%甘油(其中含有12mL PTM1/L)，流加量為18mL/L/天。37°C通氣攪拌培養至72h，用氨水維持 PH值在4. 0左右，同時調整通氣量使此階段的溶氧量始終維持在20%以上。4)發酵液上清首先用截流分子量約為50KDa的中空纖維濾柱過濾，收集透過液，再用截流分子量為IOKDa的納濾膜處理，保留回流液。用蒸餾水將回流液稀釋10倍，然后再通過IOKDa的納濾膜處理，如此重復操作5次。將回流液冷凍干燥后，可得到初步提純的重組蛋白凍干粉。將其重新懸浮于50mL的20mM Tris-HCl緩沖液中(pH7. 9，含5mM咪唑， 0. 5MNaCl)。準備20mL的鎳柱，首先用無菌水洗柱(10倍柱床體積)，流速lmL/mim，然后用上樣緩沖液I (IOmM Tris-HCl, ρΗ7· 9，含0· 25Μ NaCl)進行平衡(10倍柱床體積)，流速為lmL/min。將上述蛋白樣品液以lmL/min的速度加入到柱子中。用上樣緩沖液I繼續平衡(10個柱床體積)，然后分別用含有50mM、100mM及400mM咪唑的IOmM Tris-HCl緩沖液 (PH7.9，含0. 25M NaCl)進行洗脫，流速為2mL/min，收集含目標蛋白階段的洗脫液，匯合后凍干。
9.如權利要求8所述的方法，其中所述的CP4-EPSPS重組融合蛋白經高度純化后可作為蛋白質標準物質備選物應用于蛋白質溯源研究等領域。
全文摘要
本發明涉及基因工程領域，具體涉及使用一個復合增強子以實現CP4-EPSPS融合蛋白基因在多型漢遜酵母細胞中以組成型方式高效表達的方法，其中包括1)使用一個復合增強子以提高密碼子優化后的CP4-EPSPS融合蛋白基因在漢遜酵母中的產量；2)采用畢赤酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子調控CP4-EPSPS融合蛋白基因在漢遜酵母中以組成型的方式表達；3)優化后的漢遜酵母發酵培養生長條件；4)利用納濾及鎳柱親和層析快速提純該重組外源蛋白的方法。而由此方法制備的CP4-EPSPS重組融合蛋白可作為蛋白質標準物質備選物應用于蛋白質溯源研究等領域。
文檔編號C12N15/113GK102559730SQ201210030210
公開日2012年7月11日 申請日期2012年2月13日 優先權日2012年2月13日
發明者劉德虎, 劉樹鵬, 李剛強, 王楠 申請人:中國農業科學院生物技術研究所