通過重組多型漢遜酵母以組成型方式高效表達和生產t4溶菌酶的方法

專利名稱：：通過重組多型漢遜酵母以組成型方式高效表達和生產t4溶菌酶的方法
技術領域：
：本發明涉及基因工程領域，特別是涉及一種通過重組多型漢遜酵母以組成型方式高效表達和生產T4溶菌酶的方法。
背景技術：
：溶菌酶(Lysozyme，EC3.2.17)是指一類廣泛存在于自然界中且對多種革蘭氏陽性和陰性病原細菌、真菌以及某些病毒具有殺滅或抑制作用的蛋白水解酶，1922年由英國細菌學家Fleming首次發現。溶菌酶的主要殺菌方式是破壞細菌細胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的β_1，4糖苷鍵，造成細胞壁破裂和內溶物滲出從而導致細菌崩潰和死亡，因此，溶菌酶又被稱N-乙酰胞壁酸酶。在自然界中，溶菌酶的來源十分廣泛，可分為動物、植物和微生物來源的溶菌酶。動物來源的溶菌酶一般存在于人或哺乳動物的多種組織和分泌物中，如存在于眼淚、唾液、肝、腎、淋巴組織以及蛋清等。木瓜、蕪菁和蘿卜等植物中也能分離到溶菌酶，它們被認為在生物肌體的第一道防御屏障中起重要作用。目前已在多種微生物的體內都發現有溶菌酶的存在，如在球孢鏈霉菌、丙酮丁酸梭菌以及多種侵染細菌的噬菌體等體內。Τ4溶菌酶來源于侵染大腸桿菌的Τ4噬菌體，它是由Τ4噬菌體gpe基因所編碼(ArisakaF，etal.，2003)，基因全長為495個堿基，可編碼164個氨基酸，分子量18700Da。當噬菌體顆粒在宿主細胞內包裝完成后，在T4溶菌酶的作用下導致宿主_大腸桿菌細胞裂解并釋放出完整的噬菌體顆粒。迄今為止，T4溶菌酶已經有30多年的研究歷史，該酶及其多種突變體的晶體結構已經得到解析。一般認為，T4溶菌酶由兩個結構域所組成位于蛋白N端的α/β結構域和位于C端的α螺旋結構域。研究發現，Τ4溶菌酶的殺菌作用主要表現在兩個方面一是該酶具有N-乙酰胞壁酸酶活性；二是位于該酶C端帶正電荷的α螺旋域能夠與某些細菌或真菌帶負電荷的細胞膜結合并干擾宿主細胞的正常生理代謝，從而起到殺菌作用。位于Τ4溶菌酶蛋白C端的α螺旋結構域主要有4個，分別是α1(115-122)、α2(126-134)、α3(137-141)和α4(143-155)。人工合成的α2、α3或α4短肽雖然沒有N-乙酰胞壁酸酶活性，但仍表現出抗細菌或真菌的生物活性。同樣，將Τ4溶菌酶加熱變性后，發現雖然其N-乙酰胞壁酸酶生物活性完全喪失，但它仍保留著較強的殺菌能力。研究顯示，對Τ4溶菌酶蛋白結構進行改造和修飾能夠提高其殺菌活性或熱穩定性，例如，蛋白N端帶有6組氨酸標簽結構(6xHiS-Tag)的T4溶菌酶的殺菌活性為天然T4溶菌酶的2倍；而將N端第6位氨基酸殘基由疏水的甲硫氨酸(M)變成帶正電的賴氨酸(K)后，抗菌活性可提高4倍，但蛋白分子的穩定性下降，推測其殺菌活性的提高可能是由于蛋白C端的自由度增強，從而使α螺旋結構域能暴露在外以致于能更有效地與細胞膜靶標結合。Τ4溶菌酶除了能夠殺滅細菌外，對某些病原真菌也同樣具有抑制作用。雖然它不能穿過真菌分生孢子的細胞膜，但經該酶處理后的分生孢子不再膨大和發芽。Τ4溶菌酶對土豆原生質體膜也具有一定的破壞作用，但它對人和哺乳動物的細胞無毒害作用，因此，Τ4溶菌酶在醫藥、食品和飼料等領域都具有極大的應用潛力。從T4噬菌體感染的大腸桿菌細胞中提取T4溶菌酶，不僅生產工藝繁瑣，產量低，而且難以工業化。近幾年來，隨著人們對漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)生物學特性研究的逐漸深入，其作為外源基因表達系統的優勢也逐漸顯現。漢遜酵母屬于真菌門-子囊菌亞門_半子囊菌綱-內孢霉目-酵母科_酵母菌亞科，也是一種甲醇營養型酵母。目前已知的甲醇營養型酵母共有15個種，分屬于假絲酵母、漢遜酵母、畢赤酵母和球擬酵母等，它們都能夠在以甲醇為唯一碳源的培養基上生長。漢遜酵母中甲醇代謝的主要途徑有兩種(LodeboerA.M.，etal.,1985)一種是在過氧化物酶體中進行，甲醇在甲醇氧化酶(methanoloxidase，Μ0Χ)作用下生成甲醛和H2O2，甲醛再經甲醛脫氫酶(formaldehydedehydrogenase)和甲酸脫氫酶(formatedehydrogenase，FMD)作用下生成CO2,H2O2在過氧化氫酶(catalase，CAT)的作用下生成H2O和O2；甲醇的另一個代謝途徑發生在過氧化物酶體外，甲醇在細胞質中經過一系列酶的催化作用最后轉變為糖類，其中二羥丙酮合成酶(dihydroxyacetonesynthase,DHAS)是這一過程的關鍵酶。甲醇代謝過程中的各種關鍵酶，包括M0X、DHAS和CAT等的表達都是在轉錄水平進行調解的，它們受甲醇、甘油和山梨醇的誘導，受葡萄糖和乙醇的阻遏，但當葡萄糖濃度低于0.時，阻遏作用即被解除。在甲醇完全誘導條件下，過氧化物酶體可占細胞總體積的80%，MOX和DHAS可占細胞總蛋白的15%，它們的啟動子具有極強的啟動下游基因表達的功能，目前已被用作外源基因在酵母中表達的常用啟動子。誘導型啟動子以其強啟動功能和嚴緊的調控機制被廣泛的應用于外源基因的表達，已有很多外源蛋白在這些啟動子的調控下在漢遜酵母細胞中得到高效的表達。目前用于漢遜酵母外源蛋白表達系統的誘導型啟動子都需要在一定劑量甲醇存在的條件下才能發揮作用，但由于甲醇是有毒物質，且易燃易爆，這樣就限制了該系統在醫藥或食品等領域的應用。因此，各種組成型啟動子就應運而生，已經成功應用于漢遜酵母外源蛋白表達系統的組成型啟動子有質膜ATPase啟動子(pPMAl)和翻譯延伸因子Ia啟動子(TEFl)等，這些組成型啟動子的應用不僅無需在發酵培養基中加入甲醇，而且也簡化了發酵工藝和降低了成本等。漢遜酵母作為外源蛋白表達宿主多采用營養缺陷型菌株來進行重組子的初步篩選，目前已得到多種營養缺陷型菌株，如亮氨酸缺陷型、甲硫氨酸缺陷型和酪氨酸缺陷型等(SeonAhCheon,etal.，2009)。同時，由于漢遜酵母對氨基糖苷類抗生素敏感，G418、Zeocin和潮霉素B等抗生素抗性基因也被廣泛地用作篩選標記。以漢遜酵母作為外源基因的表達宿主時，外源DNA整合到酵母基因組中主要可分為隨機整合和同源重組，其中同源重組需要導入的DNA中必須含有漢遜酵母的同源序列。同源序列與酵母基因組中某段DNA序列完全或部分一致，從而導致外源DNA在此位置可通過同源交換整合到酵母基因組中。漢遜酵母轉化常用的同源序列包括各種強啟動子和rDNA(KlabundeJ.,etal.,2003)序列，而本發明首次采用了漢遜酵母質膜ATPase基因作為同源整合序列。真菌質膜ATPase是上世紀70年代末首次在粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)中被發現的，隨后分別從粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)中得到提純。質膜ATPase是酵母質膜中含量最多的蛋白，占總質膜蛋白的15%，占總細胞蛋白的0.3%，它的主要作用是作為一個跨膜的質子泵，維持細胞內的PH值和電化學梯度，從而使多種營養物質得以運輸。漢遜酵母質膜ATPase(HelenCox,2000)基因全長2697bp，編碼898個氨基酸。本發明中首次將其插入到漢遜酵母表達載體中作為外源基因整合的同源序列。作為外源基因的表達宿主，漢遜酵母具有其它表達系統難以比擬的優點1)漢遜酵母屬于真核微生物，能夠對外源的重組蛋白進行翻譯后加工和修飾，包括二硫鍵的生成和糖基化等；2)對于細胞內表達的重組外源蛋白，可以將其定位到過氧化物酶體中，防止胞內蛋白酶的降解以及某些重組蛋白對宿主細胞的傷害；3)對于細胞外表達的重組蛋白，宿主自身分泌蛋白少，易于重組蛋白的分離純化；4)漢遜酵母培養成本低，可在無機鹽中進行高密度發酵；5)菌體和代謝產物對人體或哺乳動物無毒害作用等。除了上述優點外，漢遜酵母還具備另外一些獨特的優勢，如1)漢遜酵母的最適生長溫度在3743°C，菌體生長速度快，發酵時間短；2)以rDNA作為整合的同源序列，可以獲得高拷貝的轉化子，有可能極大地提高外源重組蛋白的表達量；3)多個外源基因能夠通過一步法同時被整合到酵母基因組中，并按照一定劑量關系同時或分別表達。上述優點使漢遜酵母表達系統迅速發展成為最具魅力的真核表達系統之一，目前，已經有多種外源蛋白基因在漢遜酵母中獲得了表達，見表1表1在漢遜酵母中表達的部分外源蛋白<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>*BFSHα為Bovinefollicle-stimulationhomoneα亞基ScCnel為Sacchromycescerevisiaecalnexin在本發明之前，還沒有采用密碼子優化后的T4溶菌酶基因在漢遜酵母中以組成型方式表達該蛋白的的報道，沒有人使用漢遜酵母質膜ATPase基因作為同源序列將Τ4溶菌酶基因整合到漢遜酵母基因組內的報道，也沒有人在漢遜酵母中進行Τ4溶菌酶重組蛋白的高密度發酵生產。本發明首次按照酵母所偏愛的密碼子，人工合成了一個完整的Τ4溶菌酶基因，克隆了畢赤酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子以及漢遜酵母菌株A16的質膜ATPase基因，并利用上述元件，構建了一個全新的、組成型的和分泌型的漢遜酵母高效表達載體，在將該外源基因導入漢遜酵母細胞后，通過抗性篩選、活性檢測等方法，獲得了能夠高效表達T4溶菌酶的重組酵母工程菌株，再經高密度發酵、重組蛋白純化等一系列操作，最終制備的重組T4溶菌酶蛋白純品具生物活性，可廣泛應用于醫療、食品、飼料以及科研等領域。
發明內容本發明的第一個目的是提供一種密碼子得到優化的T4溶菌酶基因，其能夠在漢遜酵母細胞中得到穩定地高效表達。本發明的第二個目的是提供一種通過畢赤酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子調控使T4溶菌酶基因以組成型的方式在漢遜酵母中得到高效表達的方法。本發明的第三個目的是通過使用一個同源序列，使攜帶有T4溶菌酶外源基因、啟動子序列以及篩選標記等重要表達元件的質粒載體能夠被整合到漢遜酵母基因組中。本發明的第四個目的是提供最適的重組漢遜酵母生長和表達條件以及目標蛋白快速的純化方法。為達到上述目的，本發明的技術方案首先提供一種編碼T4溶菌酶蛋白的基因，其是按照酵母偏愛的密碼子優化過的、編碼或至少部分編碼T4溶菌酶蛋白的基因。所述的T4溶菌酶蛋白一級結構為SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。在本發明的一個優選實施方式中，所述T4溶菌酶蛋白基因具有或至少部分具有SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。然后所述T4溶菌酶蛋白基因被置于一個畢赤酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子操縱之下，在整合到漢遜酵母基因組中后，隨著重組酵母菌體的生長，T4溶菌酶外源基因能夠以組成型方式得到高效表達。進一步地，漢遜酵母菌株的質膜ATPase基因PMAl被克隆出來并被插入到一個上述的酵母表達質粒載體中，借助PMAl基因發生的同源重組，可將受畢赤酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子調控的T4溶菌酶基因及其它重要的表達元件同時整合到漢遜酵母基因組中，而得到的重組漢遜酵母菌株能夠穩定地高效表達T4溶菌酶重組蛋白并將其分泌到胞外。更進一步地，在構建高效表達載體時，采用的起始載體為PPIC9K，其多克隆位點前含有α-因子分泌信號肽核苷酸編碼序列，在與外源基因融合表達后，可引導外源重組蛋白向酵母細胞外分泌。這時，可在Τ4溶菌酶外源基因的5’端前添加酵母Kex2基因表達產物切割識別序列GAGAAAAGA，使外源重組蛋白在分泌到胞外時，α-因子分泌信號肽可以被酵母Kex2基因表達產物切割下來，從而不改變重組蛋白的N端序列。這樣，本發明一個優選的實施方式就是首先是編碼T4溶菌酶的基因被按照酵母所偏愛的密碼子進行優化并人工合成出來，然后，該基因被插入到一個帶有α-因子分泌信號肽核苷酸編碼序列的酵母表達載體上以便再形成一個新的融合蛋白基因。α-因子分泌信號肽的作用是操縱外源的重組Τ4溶菌酶向漢遜酵母胞外的分泌。在該質粒載體上，還含有一個組成型啟動子，該啟動子位于α-因子分泌信號肽與Τ4溶菌酶所形成的融合基因的上游，它操縱融合基因在漢遜酵母細胞中的高效表達。同時，該質粒載體中還含有漢遜酵母質膜ATPase基因，它在質粒載體整合到酵母基因組內的過程中上起到了同源序列的作用。該載體經線性化處理后，可通過電融合或氯化鋰等方法被導入到漢遜酵母細胞中，進而通過同源重組穩定整合到酵母染色體基因組內，此重組酵母在發酵培養過程中表達的T4溶菌酶重組蛋白在α-因子分泌信號肽的引導下得以分泌到胞外的培養基中。利用發酵液上清進行抑菌實驗，證明該重組蛋白具有與天然多肽相類似的抑菌活性。本發明還提供了上述重組漢遜酵母的最適的生長培養條件和外源蛋白表達條件，如培養基的成分、接種量、PH值、溶氧量和培養時間等，由此使該重組酵母工程菌的生長量和重組蛋白的分泌量都盡可能地達到最大化。通過離心除菌、納濾、離子交換層析等操作從發酵液中得到高純度的外源重組蛋白，以便為這種重組酵母的工業化生產、低成本發酵和純化奠定基礎。本發明利用漢遜酵母表達系統表達和生產Τ4溶菌酶重組蛋白，如果將其經過部分或完全純化，因其具有較強的抗菌活性和廣泛的抗菌譜故其有可能被應用于醫療、食品、飼料和科研等領域。例如，在動物飼料領域，本發明的Τ4溶菌酶重組蛋白作為飼料添加劑可以延長飼料的保質期，或預防和治療某些家畜的消化道細菌傳染性疾病等。本發明所指的重組蛋白可以是Τ4溶菌酶蛋白的全部，然而，在某些具體實施方案中，所表達的外源基因也可能只是該天然蛋白的一部分。有時，Τ4溶菌酶重組蛋白可與另外一個具有不同生物學功能的蛋白基因以獨立或融合方式同時在一個酵母細胞內表達，目的是為了方便提純或提高其生物活性。蛋白的融合可以通過蛋白翻譯后加工、共價結合的方式，或者通過DNA重組技術使基因在翻譯表達前就相互拼接在一起，而這兩種技術是本領域技術人員早已熟知的技術。發酵產品中Τ4溶菌酶重組蛋白的純度直接關系到該重組蛋白的應用范圍及所生產相關產品成本的高低，按照一個優選的實施方案，為了快速純化大量的Τ4溶菌酶重組蛋白，可以首先將酵母發酵液上清液使用不同截流分子量的過濾裝置進行預處理，然后再通過離子交換層析，在純化過程中的每一個環節，都可使用SDS-PAGE電泳進行檢測，通過上述方法可獲得純度達到99%的Τ4溶菌酶重組蛋白。本發明還提供了經過優化的重組漢遜酵母培養生長條件以及Τ4溶菌酶重組蛋白的快速純化方法，它包括以下三個階段1)菌體培養階段，以10%的接種量接種酵母工程菌，經過2430小時的培養，酵母菌體濕重將達到95100g/L左右；2)碳源飼喂和蛋白表達階段，在培養2496小時后，酵母菌體的濕重將達到180190g/L左右，在此培養過程中不斷補加碳源，并維持一定的PH值和溶氧量，使菌體高密度發酵，在酵母菌體生長的同時，重組T4溶菌酶蛋白得到高效表達；3)蛋白純化，發酵液經過離心和三次不同規格的濾膜過濾處理，最后再經過一次陽離子交換層析處理，T4溶菌酶重組蛋白的純度可達99%以上。按照一個具體的實施方案，優化的重組漢遜酵母工程菌株發酵生產重組蛋白的方法，包括(1)菌體培養在基礎發酵培養基中發酵，接種前先加入適量氨水，使該培養基的PH值維持在5.56.0左右，然后在每升基礎發酵培養基中加入4.37mL微量鹽溶液PTMl；按體積比910%的比例接種種子液，3637°C、375380轉/分通氣攪拌培養2430小時左右；(2)飼喂碳源和蛋白表達流加補料液，補料液為含有12mLPTMl/L的50%甘油，流加量為1718mL/L/天，3637°C、375380轉/分通氣攪拌培養7296個小時，過程中使溶氧量始終大于20%，溫度維持在3637°C，pH維持在5.56.0左右；在上述過程中用到的培養基及試劑配方為基礎發酵培養基=IOXBasalSalts+4%甘油；PTMl0.6wt%硫酸銅，0.008wt%碘化鈉，0.3wt%硫酸錳，0.02wt%鉬酸鈉，0.002wt%硼酸，0.05丨％氯化鈷，2丨％氯化鋅，6.5wt%硫酸亞鐵，0.025丨％生物素，0.5wt%硫酸。本發明在詳細介紹酵母表達系統時僅提到了漢遜酵母A16菌株，然而，正如本領域專家所早已熟知的酵母表達系統那樣，許多種漢遜酵母表達系統都可以利用本發明所提供的方法進行遺傳轉化、表達和生產。因此，所有這些漢遜酵母表達系統都應包括在本發明的權利要求范圍之內。就像下面實例中所要詳細描述的那樣，本發明描述的酵母轉化方法中所用的質粒載體是一個整合型的質粒表達系統，按照一個優先的實施方案，本發明所使用的質粒表達載體是一個得到改造后的PPIC9K，其原先的AOXl誘導型啟動子被畢赤酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶組成型啟動子所取代，同時質粒表達載體中還包含有用于外源基因整合到酵母基因組內的同源序列，該序列可以是PMAl或其他同源序列。采用本發明所述方法，可有效地將密碼子優化后的T4溶菌酶外源基因通過PMAl基因序列以同源重組的方式整合到漢遜酵母基因組中，獲得的酵母工程菌株能夠以組成型方式穩定和高效地表達T4溶菌酶重組蛋白，同時提供了該重組蛋白的發酵和純化工藝，適用于規模化生產T4溶菌酶蛋白。圖1為T4溶菌酶基因密碼子優化和改造前后對比，N代表密碼子優化和改造前的基因序列；M代表密碼子優化和改造后的基因序列；圖2為組成型酵母高效表達載體mT4-ATP-GPIC9K的構建過程；圖3為光吸收法測定重組T4溶菌酶的溶菌活性縱坐標為OD35tlIim光吸收值，橫坐標為發酵工程菌上清液濃縮倍數，18為濃縮18倍；ATP-GPIC9K為陰性對照，T4為工程菌發酵上清液；圖4為SDS-PAGE電泳檢測T4溶菌酶重組蛋白表達情況M為標準分子量蛋白(BluePlusProteinmarker1294KDa，北京TransGenBiotech公司產品)；CK-為陰性對照，GPIC9K轉化的重組酵母菌株培養72小時發酵液上清；16分別為HP-T4培養24、48、72、96、120和144小時發酵上清液;圖5為SDS-PAGE電泳檢測純化后的T4溶菌酶重組蛋白多肽1為經過脫鹽-分子篩_離子交換層析_凍干等操作所獲得的重組蛋白純品；2為蛋白標準分子量(北京TransGenBiotech公司產品)。具體實施例方式下面結合附圖和實施例，對本發明的具體實施方式作進一步詳細描述。以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。實施例1密碼子優化后的T4溶菌酶基因的人工合成T4溶菌酶基因來源于T4噬菌體，其密碼子與原核生物較接近，而漢遜酵母屬于真核生物，故它們在基因密碼子偏好方面存在著一定的差異，而這種差異很可能會影響到T4溶菌酶基因及其轉錄產物在漢遜酵母細胞中的穩定性和表達效率。為提高T4溶菌酶的生物產量，根據業已公布的T4溶菌酶基因的DNA序列和氨基酸序列(GenBank，登錄號NY000866)，在不改變其氨基酸序列的前提下(見SEQIDN0.1)，按照酵母所偏愛的密碼子(SharpPM,etal.，1986)，人工設計和合成了新的T4溶菌酶成熟蛋白的DNA編碼序列，密碼子優化和改造后的Τ4溶菌酶基因與改造前相比，改變了其中的138個核苷酸堿基，總共涉及到116個密碼子，而G+C含量由原來的36.6%變為現在的49.5%，基因改造前后對比見附圖1。與此同時，為了便于此后酵母表達載體的構建，在人工合成該Τ4溶菌酶核苷酸編碼序列的過程中，在該基因的5’端第一個翻譯起始密碼子ATG前合成和添加了限制性酶切位點XhoI以及酵母Kex2基因表達產物切割識別序列GAGAAAAGA；在該基因的3’端終止密碼子TAA后增加了限制性酶切位點NotI(上述基因拼接和合成工作由上海博亞生物技術公司代為完成)。實施例2T4溶菌酶基因的克隆將上述人工合成的T4溶菌酶基因DNA片段直接插入到pEASY_T1(購自北京TransGenic公司)質粒中的T位點內，按照該公司所提供的方法，得到含有中間質粒載體mT4-T的細菌克隆，然后，通過DNA測序，確定其所含的T4溶菌酶基因是正確和完整的(DNA測序由北京標凱科技有限公司完成)。實施例3畢赤酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子的克隆根據已知的畢赤酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子序列(GenBank:U62648.1)，分別合成位于啟動子兩端的引物F和R，其中F為5‘-ATGGATCCTTTTTTGTAGAAATGTCTTGGTGTC-C-3‘(劃線部分為BamHI切點)(見SEQIDNO.5)，R為5‘-ATGAGCTCTGTGTTTTGATAGTTGTTCAATTGATTG-3'(劃線部分為SacI切點)(見SEQIDNO.6)，以畢赤酵母基因組DNA為模板(基因組提取方法參見《分子克隆實驗指南第三版》485頁)，以F和R為引物，通過PCR，擴增獲得甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子序列(GAPDH)，將擴增片段直接插入到pEASY-Tl質粒中的T位點內，按照該公司所提供的方法，得到含有中間質粒載體GAPDH-T的細菌克隆，然后，通過核苷酸測序分析，確定GAPDH是正確和完整的，見SEQIDNO.3。實施例4漢遜酵母質膜ATP酶基因的克隆根據已知的漢遜酵母質膜ATP酶基因核苷酸序列(見GeneBank:AF109913)，分別設計和合成引物primer1和primer2，其中Primerl序列為5-ATCATATGATGCTGCAACTGAACCAACCAAGGAG-3，，(見SEQIDNO.7);Primer2序列為5，-ATGCATGCTCAGTTGGACTTCTCGTGCTGAGTAGAG-3，(見SEQIDN0.8)。Primerl和primer2分別添加有NdeI(CATATG)和SphI(GCATGC)限制性內切酶切位點，用于后續的酵母表達載體的構建。以漢遜酵母基因組DNA為模板，PCR擴增漢遜酵母質膜ATP酶基因，PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，切割目的條帶并用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的DNA片段，然后直接連接到pEASY-Tl質粒中的T位點內(購自TransGenic公司)，按照該公司所提供的方法，得到含有質膜ATP酶基因的細菌克隆ATP-T，然后，通過核苷酸測序分析，確定質膜ATP酶基因是正確的，見SEQIDN0.4。實施例5表達載體mT4-ATP-GPIC9K的構建用限制性內切酶BamHI和SacI進行雙酶切，將連接在中間質粒載體GAPDH-T中的GAPDHDNA片段切下來，通過瓊脂糖凝膠電泳分離和回收該DNA片段。用同樣的限制性內切酶處理質粒PPIC9K(美國Invitrogen公司產品)，通過瓊脂糖凝膠電泳分離和回收線性化后的PPIC9K質粒DNA，然后將上述兩個DNA片段混合后并用連接酶連接在一起便得到中間質粒載體GPIC9K(見附圖2)，然后用上述質粒載體轉化大腸桿菌細胞DH5α(購自美國GIBCO公司)以方便進行該質粒的復制和保存。用限制性內切酶NdeI和SphI進行雙酶切，將連接在中間質粒載體ATP-T中的漢遜酵母質膜ATP酶基因DNA片段切下來，通過瓊脂糖凝膠電泳分離和回收該DNA片段。用同樣的限制性內切酶處理質粒GPIC9K，通過瓊脂糖凝膠電泳分離和回收線性化后的GPIC9K質粒DNA，然后將上述兩個DNA片段混合后并用連接酶連接在一起便得到中間質粒載體ATP-GPIC9K(見附圖2)，然后用上述質粒載體轉化大腸桿菌細胞DH5α以方便進行該質粒的復制和保存。用限制性內切酶XhoI和NotI進行雙酶切，將插入在中間質粒載體mT4-T中的T4溶菌酶基因DNA片段切下來，通過瓊脂糖凝膠電泳分離和回收該DNA片段。用同樣的限制性內切酶處理質粒ATP-GPIC9K，通過瓊脂糖凝膠電泳分離和回收線性化后的ATP-GPIC9K質粒DNA，將上述兩個DNA片段混合后并用連接酶連接在一起便得到漢遜酵母表達載體mT4-ATP-GPIC9K(見附圖2)，然后用上述質粒載體轉化大腸桿菌細胞DH5α(購自美國GIBCO公司)以方便進行該質粒的復制和保存。質粒載體pPIC9K購自美國Invitrogen公司，它是一個酵母誘導型表達質粒載體，它含有一個高效的誘導型啟動子-醇氧化酶啟動子(AOXl)，在甲醇的誘導下，可調控下游插入外源基因的高效表達。在該表達載體多克隆位點前含有α-因子分泌信號肽核苷酸編碼序列，在與外源基因融合表達后，可引導外源重組蛋白向酵母細胞外分泌。在分泌到胞外的過程中，該信號肽可以被酵母Kex2基因表達產物切割下來，從而不改變重組蛋白的N端序列。實施例6:mpGPIC9K質粒DNA的制備首先用堿裂解法(參見《分子克隆試驗指南》)，從上述的大腸桿菌DH5α細胞中小制備提取mT4-ATP-GPIC9K質粒DNA，然后用12倍過量的限制性內切酶XbaI進行酶切，使之完全線性化，可利用瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切是否完全。然后用酚和氯仿分別抽提上述酶切產物，乙醇沉淀，棄上清，收集沉淀，經冷凍干燥后，將沉淀重新溶解在無菌的去離子水中，-20°C保存備用。實施例7酵母細胞的遺傳轉化將_72°C保存的漢遜酵母菌液(菌株A16來自中國農業大學)接種到5mLYPD中(1%酵母提取物，2%胰蛋白胨，2%葡萄糖)，37°C震蕩培養1天左右，將培養好的菌液以接種量重新接種于IOOmLYPD中，37°C震蕩過夜培養(8h)至OD600=1.3-1.5，4000轉/分離心5分鐘，倒掉上清，將沉淀的酵母細胞重懸在40mL溶液a(50mM磷酸鉀緩沖液，pH7.5,25mMDTT)中，37°C溫浴15min，4000轉/分離心5分鐘，倒掉上清，將沉淀的酵母細胞重懸在200mL冰預冷的溶液b(270mM蔗糖，IOmMTris-HCl,pH7.5，ImMMgCl2)中，4000轉/分離心5分鐘，倒掉上清，將沉淀的酵母細胞重懸在IOOmL預冷的溶液b中，4000轉/分離心5分鐘，倒掉上清，將沉淀的酵母細胞重懸在ImL預冷的溶液b中，吸取SOuL于1.5mL離心管中，與上述線性化表達載體mT4-ATP-GPIC9K質粒DNA(45ug)充分混勻，然后轉移到冰浴后的0.2cm無菌電擊杯中，利用電擊儀Precisi0nPUlseTM(BTX公司產品)將線性化的表達載體mT4-ATP-GPIC9K質粒DNA導入酵母感受態細胞中，使用的電擊參數為電壓1.5kV,電容50uF，電阻125Ω。電擊完成后，立即向電擊杯中加入ImL室溫的YPD培養基(1%酵母提取物，2%酪蛋白胨，2%葡萄糖)，充分混勻后，37°C靜置1小時，然后涂布于固體YPD培養基(液體培養基中加入了2%瓊脂粉，0.2mg/mLG418)上，平板倒置于37°C恒溫培養箱中23天，至轉化重組子出現。實施例8高表達酵母菌株的篩選將在YPD培養基(0.2mg/mLG418)上生長的酵母單菌落(轉化子)用無菌牙簽逐一挑取到含有梯度G418的YPD培養基(分別含有0.5mg/mL、lmg/mL、l.5mg/mL、2mg/mLG418)上，平板倒置于37°C恒溫培養箱中12天。隨著攜帶有G418抗性基因的外源質粒整合到酵母基因組中的拷貝數的增加，轉化子對G418的抗性增強。挑取能夠在含有2mg/mLG418的YPD平板上生長的轉化子，接種于IOOmLBMGY培養基[1%酵母提取物，2%酪蛋白胨，IOOmM磷酸鉀緩沖液(ρΗ7·0)，1.34%ΥΝΒ，0·00004%Biotin，甘油(ν/ν)]中，37°C震蕩培養4天，發酵液10000轉/分離心5分鐘，收集含有重組T4溶菌酶的上清液，該上清液可直接用于殺菌活性的測定。重組T4溶菌酶的溶菌活性采用紫外/可見光分光光度法。所用的溶壁微球菌(MicrococcusLysodeikticus)購自中國科學院微生物研究所菌種保藏中心，菌種編號1.0634。將微球菌接種于500mLLB培養基中，28°C培養過夜，用0.05MTris-HCl(ρΗ7·2)洗菌體兩次，重懸于IOmL相同緩沖液中，冷凍干燥。凍干菌用相同緩沖液配制成0.5g/L的懸浮液作為底物。將0.ImL待測酶液加入0.9mL底物溶液中，37°C靜置1小時，測定OD35tl光吸收值，檢測結果見附圖3。從附圖3可知，經表達載體mT4-ATP_GPIC9K轉化所獲得的重組酵母菌株培養上清液能夠使溶壁微球菌凍干菌懸液變澄清，隨著發酵上清液濃縮倍數的增加，其吸光度逐漸降低，這表明重組T4溶菌酶是具有溶菌活性的。而陰性對照(轉ATP-GPIC9K空質粒表達載體的漢遜酵母培養上清液)隨著濃縮倍數的提高其光吸收值沒有產生任何顯著的變化。隨機挑取10株能夠在2mg/mLG418的YPD平板上生長的轉化子，發酵培養，取發酵液上清進行抑菌活性測定。測定結果發現所有能夠在2mg/mLG418的YPD平板上生長的轉化子都具有抑菌活性，并且抑菌活性強弱差別不明顯。從中隨機挑選出一株作為工程菌加以保存，并將其命名為HP-T4。實施例9重組酵母菌的高密度發酵1、種子液的制備挑取單菌落，將重組酵母菌株HP-T4接種于IOmLBMGY培養基中，37°C震蕩培養過夜，以10%的接種量轉接于IOOmLBMGY培養基，37°C震蕩培養過夜，再以10%的接種量轉接于ILBMGY培養基，28°C震蕩培養過夜，將其轉接到4LBMGY培養基中，37°C震蕩培養2天，作為高密度發酵的種子液。2、重組酵母在50L發酵罐中的高密度發酵本發酵過程可以分為以下兩個階段1)菌體培養階段在50L發酵罐(鎮江東方生物工程設備技術有限責任公司)中盛放了30L基礎發酵培養基(IOXBasalSalts2.67%磷酸、0.093%硫酸鈣、1.82%硫酸鉀、1.49%硫酸鎂、0.413%氫氧化鉀+4%甘油)，在接種前先加入氨水使該培養基的PH值維持在5.56.0左右(氨水同時也可作為酵母菌體生長的氮源)，再按照下述比例，在每升基礎發酵培養基中加入4.37mL微量鹽溶液PTMl(0.6%硫酸銅，0.008%碘化鈉,0.3%硫酸錳，0.02%鉬酸鈉，0.002%硼酸，0.05%氯化鈷，2%氯化鋅，6.5%硫酸亞鐵，0.025%生物素，0.5%硫酸)。按910%的比例接種此前制備好的種子液，3637°C通氣攪拌(轉速自始至終維持在375380轉/分)培養2430小時左右。在該階段的進行過程中，隨著酵母菌體的生長，培養基中的溶氧量將由100%逐漸降低，當培養基中的碳源消耗完后，溶氧量將再度升高至80%以上，此時菌體的濕重將達9095g/L。2)飼喂碳源和蛋白表達階段(2496h)在接種后的第二天，通過蠕動泵流加補料液，補料液為50%甘油(其中含有12mLPTMl/L)，流加量為1718mL/L/天。3637°C通氣攪拌(轉速自始至終維持在375380轉/分)培養，4850h后菌體的濕重將達170180g/L。隨著菌體的生長，pH值逐漸降低，用氨水維持pH值在5.56.0左右，同時調整通氣量使此階段的溶氧量始終維持在20%以上。在培養的第34天，繼續流加50%的甘油(其中含有12mLPTM1/L)，每天大概加入700720mL，溶氧量始終大于20%，溫度維持在3637°C，pH維持在5.56.0左右。每隔24小時取數毫升發酵液經5000rpm4°C下離心10分鐘，取30uL發酵液上清液進行SDS-PAGE檢測，發現有肉眼可觀察到的一條蛋白帶，分子量約為19KDa，與推測中的T4溶菌酶重組蛋白分子量基本吻合。此夕卜，從電泳圖中發現，在培養120小時后，重組T4溶菌酶的表達量達到最高峰(見附圖4)。實施例10重組蛋白的純化待一個發酵周期全部結束之后，留取500mL發酵液作為種子液(接種量為5%)直接進行下一輪的發酵過程。類似的操作累計進行3輪，在每輪發酵過程中，均對菌體的生長量和T4溶菌酶重組蛋白的表達量進行了測定。另外，在每輪發酵過程完全結束后，還取少許菌液涂布于YPD固體平板上，并從中任意挑取10個酵母單菌落，快速提取其基因組(蔡傳奇等，2001)DNA，進行PCR檢測，結果發現，菌體的生物量、生長速度以及重組蛋白的表達量在各輪發酵過程中基本保持穩定，另外，PCR的檢測結果也證實重組漢遜酵母菌株具有很好的遺傳穩定性(見表2)。表2HP-T4菌株的遺傳穩定性和外源蛋白表達穩定性的測定<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>在一個發酵周期結束之后，除留下500mL發酵液作為種子液外，其余的發酵液用于T4溶菌酶重組蛋白的純化。發酵液經5000rpm4°C離心10分鐘，留取上清。發酵液上清首先用截流分子量為50KDa的中空纖維濾柱(天津膜天膜工程技術有限公司，產品型號M0F-503，使用方法見該公司說明)過濾，收集透過液，澄清的透過液再用截流分子量為IOKDa的納濾膜(上海朗極化工科技有限公司，產品編號2426538，使用方法見該公司說明)處理，保留回流液，終體積約為700mL。將此回流液進行脫鹽處理，向700mL回流液中加入6.3L蒸餾水，即將回流液稀釋10倍，然后將稀釋液再次通過上述IOKDa的納濾膜處理，此時得到的回流液中鹽離子濃度也相應稀釋10倍，如此重復操作5次，即回流液中鹽離子濃度稀釋IO5倍，最終得到700mL回流液，將此回流液冷凍干燥后，可得到初步提純的重組蛋白凍干粉(純度大于60%左右)。該蛋白凍干粉樣品可通過離子交換層析得到進一步的純化，以滿足不同的生產需求。所使用的陽離子離子交換樹脂為CM-Sephadex-C25(美國GE公司產品)。按照該公司產品說明，對樹脂進行預處理，然后進行裝柱(裝柱方法見產品說明，層析儀為上海滬西分析儀器廠有限公司產品_型號MA99-3)，具體操作方法如下1)蛋白凍干粉加入5倍體積的蒸餾水進行稀釋，然后用丙醋酸將該稀釋液pH值調至5.55.8。2)樣品上柱(注若凍干粉樣品為2g+500mL蒸餾水時，使用1.5x50cm的層析柱，樹脂床體積高度為40cm)，流速3mL/分鐘。用紫外蛋白檢測儀及記錄儀記錄洗脫液流出過程。3)洗柱，待樣品快全部進入樹脂后，用0.IM磷酸鹽緩沖液含ICT3MMgSO4(pH6.5)進行洗柱，流速3mL/分鐘，至0D280nm吸光值為零，約需緩沖液為56倍柱體積。4)洗脫，用0.IM磷酸鹽緩沖液含KT3MMgSO4和0.5MNaCl(pH6.5)進行目標蛋白洗脫，流速3mL/分鐘，用紫外蛋白檢測儀監視蛋白流出情況并收集最大蛋白洗脫部分(目的蛋白峰一般出現在加入洗脫液后不久)，收集含目的蛋白的洗脫液。5)將洗脫液移置透析袋中，對蒸餾水進行透析過夜，期間更換蒸餾水數次，目的是為了去除其中所含的NaCl。6)透析液通過冷凍干燥，可得到目標蛋白干粉，室溫下可長期保存。視使用目的不同，可加工成各種劑型，如食品添加劑，針劑等。在上述純化流程中，每個操作步驟之后都留取少量樣品以便進行總蛋白量、純度和回收率的測定(見表3)。最終制得的重組蛋白純品進行SDS-PAGE電泳，經考馬斯亮藍染色和脫色后，電泳圖經LabWork軟件(美國UVP公司產品)分析，結果顯示重組蛋白濃度達到99%以上(見附圖5)，重組蛋白的表達量約為0.89g/L。表3T4溶菌酶重組蛋白的純化<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>參考文獻l、SeonAhCheon，eta1．，Yeast，2009，26507—5122、ArisakaF,etal.,TheInternationalJournalofBiochemistry&CellBiology,2003,35(1):16_213、LodeboerAM，etal.，Nucleicacidsresearch,1985,13(9):3063_30824、KlabundeJ,etal.,FEMSYeastResearch,2003,(4):185_1935、CoxH,etal.，Yeast，2000(16):1191_12036、ChenZY,etal.,Appl.Microbiol.Biotechnol.,2008(79):545_5547、QianWD,etal.，Prot.Expr.Puri.2009(68)183—1898、張冬冬等，微生物學通報，2009，36(6)=0794-07989、GellissenG,etal.，DrugRes.，1996,46:943_94810、孟凡紅等，中國生物工程雜志，2006，12:11_1711、蔡傳奇等，生物工程學報，2001，17(2)155-16012、SharpPΜ,etal.，NeucleicAcidsRes.，1986，14:5125_514權利要求一種編碼T4溶菌酶蛋白的基因，其特征在于，其是按照酵母偏愛的密碼子優化過的、編碼或至少部分編碼T4溶菌酶蛋白的基因。2.如權利要求1所述的基因，其特征在于，所述的T4溶菌酶蛋白一級結構為SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。3.如權利要求1或2所述的基因，其特征在于，其具有或至少部分具有SEQIDN0.2所示的核苷酸序列。4.權利要求1-3任一項所述的基因用于構建高效表達和生產T4溶菌酶的重組多型漢遜酵母。5.一種通過重組多型漢遜酵母以組成型方式高效表達和生產T4溶菌酶的方法，包括T4溶菌酶外源基因的人工合成、高效表達載體的構建、高表達酵母重組子的篩選、重組酵母的發酵以及外源重組蛋白的表達和純化，其特征在于所述T4溶菌酶外源基因為權利要求1-3任一項所述的基因；構建高效表達載體時采用了畢赤酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子。6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，在構建高效表達載體時，用漢遜酵母質膜ATPase基因作為同源序列將T4溶菌酶基因整合到漢遜酵母基因組內。7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，在構建高效表達載體時，采用的起始載體為PPIC9K。8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述T4溶菌酶外源基因的5’端前添加了酵母Kex2基因表達產物切割識別序列GAGAAAAGA。9.一種重組T4溶菌酶蛋白的表達質粒載體，其特征在于其為質粒圖譜如附圖2所示的載體mT4-ATP-GPIC9K。10.一種表達重組T4溶菌酶蛋白的工程菌株，其特征在于，包含權利要求9所述的表達質粒載體。11.根據權利要求10所述的工程菌株，其特征在于，宿主細胞是多型漢遜酵母A16菌株或其它能夠表達外源蛋白的漢遜酵母菌株。12.采用權利要求10或11所述的工程菌株發酵生產重組蛋白的方法，包括(1)菌體培養在基礎發酵培養基中發酵，接種前先加入適量氨水，使該培養基的PH值維持在5.56.0左右，然后在每升基礎發酵培養基中加入4.37mL微量鹽溶液PTM1；按體積比910%的比例接種種子液，3637°C、375380轉/分通氣攪拌培養2430小時左右；(2)飼喂碳源和蛋白表達流加補料液，補料液為含有12mLPTMl/L的50%甘油，流加量為1718mL/L/天，3637°C、375380轉/分通氣攪拌培養7296個小時，過程中使溶氧量始終大于20%，溫度維持在3637°C，pH維持在5.56.0左右；在上述過程中用到的培養基及試劑配方為基礎發酵培養基10XBasalSalts+4%甘油；PTM10.6wt%硫酸銅，0.008wt%碘化鈉，0.3wt%硫酸錳，0.02wt%_酸鈉，0.002wt%硼酸，0.05襯％氯化鈷，2襯％氯化鋅，6.5wt%硫酸亞鐵，0.025襯％生物素，0.5wt%硫酸。全文摘要本發明公開了一種在多型漢遜酵母細胞中以組成型方式表達和生產T4溶菌酶重組蛋白的方法，其中包括1)使用密碼子得到優化后的T4溶菌酶基因以提高其在真核表達系統-漢遜酵母細胞中的生物產量；2)采用漢遜酵母來源的質膜ATP酶核苷酸編碼序列作為外源質粒載體整合到漢遜酵母基因組中的同源序列；3)采用畢赤酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子調控T4溶菌酶基因在漢遜酵母中以組成型的方式高效表達；4)特定的漢遜酵母工程菌發酵培養生長條件以提高T4溶菌酶重組蛋白的生物產量以及快速提純該重組外源蛋白的方法。而由此方法最終制備的T4溶菌酶重組蛋白純品具生物活性，可廣泛應用于醫療、食品、飼料以及科研等領域。文檔編號C12N9/36GK101831451SQ201010158438公開日2010年9月15日申請日期2010年4月22日優先權日2010年4月22日發明者劉德虎,李剛強,王楠申請人:中國農業科學院生物技術研究所