專利名稱：重組人溶菌酶霧化溶液及吸入劑對抗耐藥菌在制藥中的新用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種重組人溶菌酶霧化溶液及吸入劑的新用途，特別是涉及制藥領域中重組人溶菌酶霧化溶液及吸入劑在對病毒、細菌、耐藥菌在制藥中的新用途。
背景技術：
抗生素創造了許多醫學奇跡，使許多疾病消失無蹤，如肺炎、腦膜炎、產褥熱、敗血癥、結核等。21世紀的今天，耐藥菌的發展令人觸目驚心。如耐青霉素的肺炎鏈球菌，過去對青霉素、紅霉素、磺胺等藥品都很敏感，現在幾乎“刀槍不入”。肺炎克雷伯氏菌對西力欣、復達欣等16種高檔抗生素的耐藥性高達51.85％-100％。而耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(MRSA)除萬古霉素外已經無藥可治。從細菌的耐藥發展史可以看出，在某種新的抗生素出現以后，就有一批耐藥菌株出現。開發一種新的抗生素一般需要10年左右的時間，而一代耐藥菌的產生只要2年的時間，抗生素的研制速度遠遠趕不上耐藥菌的發展速度。目前急需開發一種針對不同耐藥菌株均有效的“超級抗生素”用于臨床治療。
發明內容
本發明的目的在于提供一種重組人溶菌酶霧化溶液及吸入劑對抗耐藥菌在制藥中的新用途。
實際上，本發明涉及重組人溶菌酶霧化溶液及吸入劑作為制備治療由病毒、細菌、耐藥菌引起的肺炎或預防肺炎的藥中的應用。
涉及發明涉及重組人溶菌酶霧化溶液及吸入劑作為制備治療由病毒、細菌、耐藥菌引起的或預防氣管炎的藥中的應用。
涉及發明涉及重組人溶菌酶霧化溶液及吸入劑作為制備治療由病毒、細菌、耐藥菌引起的或預防咽喉炎疾病的藥中的應用。
涉及重組人溶菌酶霧化溶液及吸入劑作為制備治療由病毒、細菌、耐藥菌引起的或預防鼻竇炎的藥中的應用涉及重組人溶菌酶霧化溶液及吸入劑作為制備治療由RNA、DNA病毒或非典型肺炎SAES、細菌、耐藥菌引起的氣管炎、肺炎及肺膿腫在藥中的應用。
為了更好地理解本發明的實質，下面將用重組人溶菌酶霧化溶液及吸入劑的藥理試驗及結果來說明其在制藥領域中的新用途。
基因重組人溶菌酶以配制200毫升培養基為準，用磷酸6毫升、硫酸鎂3克，硫酸鉀4克，氫氧化鉀1克，硫酸鈣1.5克，加蒸餾水至200毫升，高壓滅菌后接種甘油管種子，搖床轉數為每分鐘250轉，培養溫度為20-35℃，在恒溫床上培養36-48小時。進行種子罐培養，最后進行生產罐培養。將發酵表達完成的培養液進行提取純化，對提取純化的蛋白濃縮液進行凍干，測蛋白測活性保存。將合格的基因重組人溶菌酶凍干粉溶于水中制得霧化溶液、吸入劑1500U～30000U/ml備用。
一對小鼠的模型試驗A、耐藥肺炎球菌上呼吸道感染所致小鼠肺炎模型的制備選用健康昆明種小鼠10只，雌雄各半，體重為18-22克，挑取一定量的耐藥肺炎球菌用噴霧方式感染小鼠上呼吸道，致小鼠肺炎10只，感染后即霧化溶液及吸入劑對受試藥30000U/ml/20g鼠重，觀察一周，每日三次給藥，記錄小鼠有效率。實驗結果表明重組人溶菌酶霧化溶液及吸入劑對耐藥肺炎球菌上呼吸道感染所致小鼠肺炎有明顯療效。結果如下表
B、耐藥金葡球菌上呼吸道感染所致小鼠氣管炎、支氣管炎模型的制備選用健康昆明種小鼠20只，雌雄各半，體重為18-22克，分兩組，每組10只，選取一定量的耐藥金葡球菌用噴霧方式感染小鼠上呼吸道致小鼠氣管炎10只、支氣管炎10只，感染后即霧化溶液及吸入劑對受試藥30000U/ml/20g鼠重，觀察一周，每日三次給藥，記錄小鼠有效率。實驗結果表明重組人溶菌酶霧化溶液及吸入劑對耐藥金葡球菌上呼吸道感染所致小鼠氣管炎、支氣管炎有明顯療效。結果如下表
C、耐藥化膿性鏈球菌上呼吸道感染所致小鼠急慢性化膿性咽喉炎模型的制備選用健康昆明種小鼠10只，雌雄各半，體重為18-22克，挑取一定量的耐藥化膿性鏈球菌用噴霧方式感染小鼠上呼吸道感染所致小鼠急慢性咽喉炎10只，感染后即霧化溶液及吸入劑對受試藥30000U/ml/20g鼠重，觀察一周，每日三次給藥，記錄小鼠有效率。實驗結果表明重組人溶菌酶霧化溶液及吸入劑對耐藥化膿性鏈球菌上呼吸道感染所致小鼠急慢性化膿性咽喉炎有明顯療效。結果如下表
D、耐藥化膿性鏈球菌上呼吸道感染所致小鼠扁條體炎模型的制備選用健康昆明種小鼠10只，雌雄各半，體重為18-22克，挑取一定量的化膿性鏈球菌用噴霧方式感染小鼠上呼吸道致扁條體炎小鼠10只，感染后即霧化溶液及吸入劑對受試藥30000u/ml/20g鼠重，觀察一周，每日三次給藥，記錄小鼠有效率。實驗結果表明重組人溶菌酶霧化溶液及吸入劑對化膿性鏈球菌感染所致扁條體炎有明顯療效。結果如下表
E、厭氧性球菌上呼吸道感染所致小鼠口腔炎模型的制備
選用健康昆明種小鼠10只，雌雄各半，體重為18-22克，挑取一定量的厭氧性球菌用噴霧方式感染小鼠上呼吸道致小鼠口腔炎10只，感染后即口腔霧化溶液及吸入劑對受試藥1500 1/20g鼠重，觀察一周，每日六次給藥，記錄小鼠有效率。實驗結果表明重組人溶菌酶霧化溶液及吸入劑對厭氧性球菌上呼吸道感染所致小鼠口腔炎有明顯療效。結果如下表
F重組人溶菌酶藥物體外預防、抑制冠狀病毒的試驗(一)、試驗目的檢測重組人溶菌酶藥物體外預防、抑制冠狀病毒的效果，為加快藥物的篩選進度，提供試驗依據。
(二)、試驗材料1.驗證藥物重組人溶菌酶 蛋白含量4.3845mg 由長春奇龍生物技術研究所提供2.陽性對照藥物注射用更昔洛韋批號020802 由湖北科益藥業股份有限公司提供。
3.細胞人宮頸癌傳代細胞(HELA)由本室提供。
4.病毒冠狀病毒04號分離株(SARS病人血清04號標本)由佑安醫院提供。
5.CO2培養箱NUAIR US AUTO FLOW提供6.(XSZ-D2)由重慶光學儀器廠生產
7.其它試劑、器材等均由本室提供。
(三)、試驗方法預備試驗1.重組人溶菌酶對HELA細胞的毒性測定HELA細胞以40萬/ml濃度接種96孔培養板，37℃、5％CO2培養2小時，加入驗證藥物，重組人溶菌酶倍比稀釋為6000ug/ml～11.7ug/ml，陽性對照藥物更昔洛韋稀釋為6000ug/ml～11.7ug/ml，每濃度接種3孔，每孔100μl，同時設正常細胞對照，37℃ 5％CO2孵箱培養6天，每天在倒置顯微鏡下觀察細胞形態變化(CPE)，以25％以下形態變化為“+”，26％～50％形態變化為“++”，51％75％形態變化為“+++”，76％～100％形態變化為“++++”，用Reed-Muench法，計算藥物半數中毒濃度(TD50)和最大無毒濃度(TD0)。
2.在HELA細胞培養內對冠狀病毒04號的毒力的測定冠狀病毒04號的分離(SARS病人血清分離)HELA細胞以每毫升40萬濃度接種試管，37℃ 5％CO2培養24小時，棄掉培養液，每管加入SARS病人血清0.2ml，33℃轉鼓培養5小時后，加入維持液1ml，同時設正常細胞對照，33℃轉鼓培養5～7天。細胞出現CPE變化后，采用PCR的方法檢測冠狀病毒，04號標本PCR陽性，確定為冠狀病毒分離株。用終末稀釋法純化病毒2次，PCR檢測冠狀病毒仍為陽性，經免疫熒光測定雙份SARS病人血清，IgM陽性，IgG4倍升高，確定為冠狀病毒。采用病毒CPE法測定其效價。
病毒CPE法HELA細胞以每毫升40萬濃度接種96孔培養板，37℃ 5％CO2培養24小時，加入病毒液，病毒稀釋10-1～10-5，5個濃度，每濃度3孔，每孔100μl，設正常細胞對照，37℃ 5％CO2培養5～7天，每24小時在倒置顯微鏡下觀察記錄細胞形態變化(CPE)以25％以下變化為“+”，26％～50％變化為“++”，51％～75％為“+++”，76％～100％變化為“++++”，用Reed-Muench法，計算病毒半數感染濃度TCID50。
正式試驗重組人溶菌酶在HELA細胞培養內對冠狀病毒04號的抑制作用試驗目的觀察不同濃度的重組人溶菌酶在HELA細胞培養內對冠狀病毒04號的抑制作用，試驗采用病毒細胞(CPE)法，計算藥物的半數有效濃度(IC50)和最小有效濃度(MIC)及治療指數TI，判斷藥效。
HELA細胞以40萬/ml濃度接種96孔培養板，37℃5％CO2孵箱培養24小時，細胞培養至單層，棄掉培養液，加入100 TCID50的冠狀病毒液，置37℃5％CO2吸附2小時后，棄掉病毒液，加入不同濃度的重組人溶菌酶藥液，藥物選用對細胞的最大無毒濃度(TD0)2倍稀釋10個濃度即750μg/ml～1.46μg/ml，陽性對照藥物更昔洛韋為2倍稀釋10個濃度即6000μg/ml～1.46μg/ml，將稀釋的藥物分別加入細胞孔內，每濃度3孔，同時設正常細胞對照和病毒對照，置37℃5％CO2培養箱培養5～7天，逐日在倒置顯微鏡下觀察病毒CPE，以病毒對照出現+++-++++時結束試驗，用Reed-Muench法，計算藥物的半數有效濃度(IC50)和最小有效濃度(MIC)及治療指數(TI)判斷藥效，試驗重復三次。
重組人溶菌酶對冠狀病毒04號的預防作用試驗目的觀察不同濃度的重組人溶菌酶在HELA細胞培養內對冠狀病毒04號的預防作用，試驗采用病毒細胞(CPE)法，計算藥物的半數有效濃度(IC50)和最小有效濃度(MIC)及治療指數TI，判斷藥效。
HELA細胞以40萬/ml濃度接種96孔培養板，37℃5％CO2孵箱培養24小時，細胞培養至單層，棄掉培養液，加入不同濃度的重組人溶菌酶藥液，藥物選用對細胞的最大無毒濃度(TD0)2倍稀釋10個濃度即750μg/ml～1.46μg/ml，陽性對照藥物更昔洛韋為2倍稀釋13個濃度即6000μg/ml～1.46μg/ml，將稀釋的藥物分別加入細胞孔內，每濃度3孔，置37℃5％CO2吸附2.5小時后，加入100 TCID50的冠狀病毒液，同時設正常細胞對照和病毒對照，置37℃5％CO2培養箱培養5～7天，逐日在倒置顯微鏡下觀察病毒CPE，以病毒對照出現+++-++++時結束試驗，用Reed-Muench法計算藥物的半數有效濃度(IC50)和最小有效濃度(MIC)及治療指數(TI)判斷藥效，試驗重復三次。
四、試驗結果預備試驗結果重組人溶菌酶對HELA細胞的毒性作用
由長春奇龍生物技術研究所提供的重組人溶菌酶和陽性對照藥物注射用更昔洛韋在HELA細胞培養內，采用細胞形態變化(CPE)法。計算藥物最大無毒濃度(TD0)和半數中毒濃度(TD50)，以下試驗結果為三次試驗結果的均值。
1.重組人溶菌酶對HELA細胞的毒性試驗結果驗證藥物重組人溶菌酶最大無毒濃度(TD0)為750±0μg/ml，半數中毒濃度(TD50)為1500±0μg/ml陽性對照藥物注射用更昔洛韋最大無毒濃度(TD0)為＞6000±0μg/ml，半數中毒濃度(TD50)為＞6000±0μg/ml。
2.在HELA細胞培養內對冠狀病毒04號毒力測定結果(TCID50)冠狀病毒04號半數感染量(TCID50)為10-3(如圖)正式試驗結果(如圖)重組人溶菌酶在HELA細胞培養內對冠狀病毒04號的抑制作用(以下試驗數據為三次試驗結果的均值)驗證藥物重組人溶菌酶CPE法，藥物半數有效濃度(IC50)為23.4±0μg/ml，最小有效濃度(MIC)為46.8±0μg/ml，治療指數(TI)為16。
陽性對照藥物注射用更昔洛韋CPE法，藥物半數有效濃度(IC50)為11.7μg/ml±0，最小有效濃度(MIC)為23.44μg/ml±0，治療指數(TI)為256。
重組人溶菌酶在HELA細胞培養內對冠狀病毒04號的預防作用(以下試驗數據為三次試驗結果的均值)驗證藥物重組人溶菌酶CPE法，藥物半數有效濃度(IC50)為5.9±0μg/ml，最小有效濃度(MIC)為11.7±0μg/ml，治療指數(TI)為64。
陽性對照藥物注射用更昔洛韋CPE法，藥物半數有效濃度(IC50)為11.7μg/ml±0，最小有效濃度(MIC)為23.44μg/ml±0，治療指數(TI)為256。
結論以上試驗由長春奇龍生物技術研究所提供的重組人溶菌酶藥物在HELA細胞培養內，采用病毒CPE法，結果表明重組人溶菌酶藥物有預防和抑制冠狀病毒的作用，預防冠狀病毒的效果優于抑制試驗結果。
以上結果，可以得出本發明的優點在于本發明對重組人溶菌酶霧化溶液及吸入劑發掘了新的醫療用途，開拓了一個新的應用領域，其安全無毒副作用，有很好的藥用前景；制備工藝簡單，使用更方便。
二用法與用量
霧化溶液和吸入劑用超聲波或霧化機霧化直接吸入肺部給藥作用于病灶部位給藥，每日1～6次，每次1500u～30000u，成人與小兒相同。
圖1為人宮頸癌傳代細胞(顯微放大10×，光學放大3.5×)；圖2為冠狀病毒04號(顯微放大10×，光學放大3.5×)；圖3為重組人溶菌酶對冠狀病毒最小有效濃度(顯微放大10×，光學放大3.5×)；
具體實施例方式下面結合實施例對本發明做進一步的描述實施例1將培養基高壓滅菌后，接種人溶菌酶菌株、搖床轉數為每分鐘250轉，培養溫度為20℃，在恒溫床上培養36小時。進行種子罐培養，最后進行生產罐培養。并將發酵表達完成的培養液進行提取純化，對提取純化的蛋白濃縮液進行凍干，測得蛋白活性后保存。取重組人溶菌酶凍干粉1％，制成1500u～30000/ml霧化溶液用超聲波或霧化機以霧化的形式直接吸入肺部給藥，主要用于對病毒、革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌引起的抗耐藥性的上、下呼吸道病癥。如咽炎、氣管炎、肺炎等疾病。
實施例2將培養基高壓滅菌后，接種人溶菌酶菌株、在恒溫床上培養40小時后，再將培養液進行純化制成含人溶菌酶凍干粉配制成15000U/ml、磷酸鹽緩沖液20mM(pH7.0)80％、10％丙三醇、0.01％吐溫80的吸入劑用超聲波或霧化機霧化直接吸入肺部給藥治療作用于病灶部位給藥。
權利要求
1.重組人溶菌酶霧化溶液及吸入劑作為制備治療由病毒、細菌及耐藥菌引起的肺炎或預防肺炎及肺膿腫在藥中的應用。
2.重組人溶菌酶霧化溶液及吸入劑作為制備治療由病毒、細菌及耐藥菌引起的或預防氣管炎在藥中的應用。
3.重組人溶菌酶霧化溶液及吸入劑作為制備治療由病毒、細菌及耐藥菌引起的或預防咽喉炎疾病在藥中的應用。
4.重組人溶菌酶霧化溶液及吸入劑作為制備治療由病毒、細菌及耐藥菌引起的或預防鼻竇炎在藥中的應用
5.重組人溶菌酶霧化溶液及吸入劑作為制備治療由病毒(RNA、DNA病毒)或非典型肺炎(SAES)引起的氣管炎、肺炎及肺膿腫在藥中的應用。
6.重組人溶菌酶霧化溶液和吸入劑用超聲波或霧化機霧化直接吸入肺部給藥治療作用于病灶部位給藥，每日1～6次，每次1500u～30000u，成人與小兒相同。
全文摘要
本發明涉及制藥領域中重組人溶菌酶霧化溶液及吸入劑在對病毒、細菌、耐藥菌的新用途。可作為制備治療由病毒、細菌、耐藥菌引起的上呼吸道如肺炎、氣管炎等疾病的藥中的應用。做成霧化溶液和吸入劑用超聲波或霧化機以霧化的形式直接吸入肺部給藥。具有安全無毒副作用，制備工藝簡單，使用方便，有很好的藥用前景。
文檔編號A61P31/12GK1546170SQ200310115890
公開日2004年11月17日 申請日期2003年12月5日 優先權日2003年12月5日
發明者張華 , 安米, 安獻祿, 張 華 申請人:長春奇龍生物技術研究所