靶配體的篩選方法

專利名稱：靶配體的篩選方法
相關申請的交叉引用本申請要求2003年3月21日申請的美國臨時申請序號60/456,816的優先權，和2003年3月21日申請的美國臨時申請序號60/456,901的優先權，所述每件申請記載的內容通過引用全部結合到本文中。
背景隨著人類基因組的闡明使得發現治療多種疾病的小分子藥物的努力發生了徹底變革。基因組學和生物學篩選兩方面的高通量技術與組合化學和計算機技術一起使得大量篩選新藥更加容易。
科學家在尋找單一有效的藥物時，必須篩分大量的潛在候選藥物。當組合化學和平行合成提供了大量的化合物作為潛在的篩選庫的同時，現行篩選方法成為發現新機制的先導藥物的瓶頸。目前最流行的篩選方法是基于功能的并且需要提供生物化學的信息或報道分子的信息。就酶而言，報道分子可以是底物的消耗或產物的生成，而對于最佳性能，則需要目標酶的最大活化型來構成基于功能的測定。基于功能的篩選方法偏向只鑒定出那些直接干擾活化型酶的活性的化合物。因此，失活型如未活化型或基礎型以及酶原型的酶都將不適宜采用基于功能的篩選。然而，與失活型相結合并阻止其活化的化合物可能是很新和很有用的先導藥物，而采用許多現有的篩選方法可能被忽略。此外，如果酶的活性需要輔因子，那么基于功能的篩選方法就難以發現那些可以與只在酶為輔因子-游離型時方存在的變構部位相結合的化合物。
如果配體受體的加工包括單體蛋白的多聚化，那么傳統篩選方法的另一種情況是可能忽略潛在的候選藥物。基于功能的篩選方法不能檢測與單體結合的化合物；而與單體結合并阻止其多聚化的化合物可能是非常有用的先導藥物。例如當受體蛋白為G蛋白偶聯受體(GPCR)和核-激素受體(NHR)時，基于功能的篩選拮抗劑至少需要一種已知的激動劑作為受體。因此，基于功能的篩選孤兒(或無配體的)受體時，只能發現刺激受體活性的化合物。即使如此，已與受體結合但不干擾配體與受體結合的化合物，通過與在受體功能中起作用的其它生物分子相互作用，仍然可能影響受體的功能。顯然，孤兒受體不可能構成基于功能的篩選。同樣，功能不明的蛋白質也不能成為基于功能的篩選的靶標。通過基因組學和蛋白質組學的實驗發現了許多新的功能不明的蛋白質。因此，為了發現與靶標所有型相結合的化合物就需要與功能無關的篩選方法，本文所報道的基于親和力的篩選方法可能即是與功能無關的。
概述本發明在某種程度上涉及用一種新方式篩選靶(例如生物分子)的通用系統，所述系統用以發現能與天然存在的低活性或無活性狀態靶結合的化合物并且可作為靶功能抑制劑的化合物，如同在后續生物學測定中所見到的一樣。該系統可適用于所有類型的生物學靶，包括DNA、RNA、蛋白質(例如膜結合蛋白、酶、核激素受體和G蛋白偶聯受體(GPCR))。另外，該系統不需要生物化學測定其輸出值而僅用很少量的純化蛋白質或其它生物分子受體，典型的是每次實驗少于1μg。而且該系統的實施，無需受體結構的知識。此外，本文描述的方法的所需輸出值可以用化合物的混合物就可達到。同樣，可以將多種形式的給定靶一起多路傳輸以提高該方法的效率。
一方面，本發明提供一種親和篩選方法，該方法針對未活化型或失活型靶部分篩選化合物的混合物(例如具有2-25,000、約5-10,000、約5-5,000、約5-1,000、約20-500或約100-300個化合物的混合物)。當未活化型或失活型靶部分在反應中占優勢時進行所述篩選。另一方面，在缺乏或沒有任何一種或多種可以激活靶的組分時進行所述篩選，例如缺乏底物(例如ATP、GTP)、輔因子、金屬離子時。另一方面，對靶進行修飾或突變以使它不能被激活(例如，發生突變的蛋白酶不能切割它自身)。另一方面，靶混合物缺乏任何高活性或生理活性靶。綜合所有的這些方面，所述方法包括下述步驟提供化合物的混合物；將所述混合物與未活化型靶部分一起孵育以形成化合物靶復合物。
使化合物靶復合物與未結合的化合物和靶分離；使化合物靶復合物解離；用質譜儀鑒定曾經與所述靶結合但現在已解離的化合物，其中經鑒定的化合物能與所述靶部分結合。
在一個實施方案中，經鑒定的化合物可以與靶部分結合，其親和力Kd介于1pM(皮摩爾)和50μM(微摩爾)之間。可將所述化合物的混合物進行質量-編碼以確保用質譜法可以檢測至少90％具有獨特離子質量的化合物。所述靶可以是任何生物分子，例如核酸(例如DNA或RNA)或酶(例如激酶、合酶、磷酸酶、甲基化酶)。
另一方面，本發明提供一種親和篩選方法，該方法針對不同型靶部分的混合物篩選化合物的混合物(例如具有2-25,000、約5-10,000、約5-5,000、約5-1,000、約20-500或約100-300個化合物的混合物)。另一方面，未活化型或失活型在靶混合物中占優勢。另一方面，在反應中沒有或缺乏任何激活組分，例如缺乏底物(例如ATP、GTP)、輔因子、金屬離子。綜合這些方面，所述方法包括下述步驟提供化合物的混合物；提供活化型靶部分(例如配體-結合型)和未活化型或失活型靶部分(例如配體-游離型)的混合物；將所述化合物的混合物和所述靶部分的混合物一起孵育以形成化合物靶復合物；使化合物靶復合物與未結合的化合物和靶部分分離；使化合物靶復合物解離；用質譜儀鑒定曾經與靶結合但現在已分解離的化合物，其中經鑒定的化合物能與靶部分結合，其親和力Kd介于1pM和50μM之間。
從化合物靶復合物中存在的化合物鑒定出結合任何型靶部分的新配體，即將化合物靶復合物通過質譜儀以鑒定結合任何型靶部分的配體，其中經鑒定的配體能與靶部分結合，其親和力Kd介于1pM和50μM之間；和所述方法可以任選包括將所鑒定的新配體與配體-結合型靶部分和配體-游離型靶部分一起孵育的步驟，其中重復形成化合物靶復合物和鑒定作為配體的化合物的步驟以描繪出哪些化合物與配體-結合型靶部分結合，哪些化合物與配體-游離型靶部分結合。
在一個實施方案中，將所述化合物的混合物進行質量-編碼以確保至少90％的化合物具有獨特的可用質譜法檢測的離子質量。在另一個實施方案中，所述靶型的混合物包括未活化型(例如未磷酸化型、磷酸化型、無配體型、負調節物結合型)、失活型(例如突變型和截短型)和活化型(例如磷酸化型、未磷酸化型、激動劑結合型、組成活化型)的生物分子。在另一個實施方案中，所述靶型的混合物包括單體型和多聚體型。在另一個實施方案中，所述靶型的混合物包括配體-結合型和配體-游離型。在又一個實施方案中，所述靶型的混合物包括輔因子-結合型和輔因子-游離型。
在另一個實施方案中，所述化合物的混合物是經質量-編碼的而靶型的混合物包括未活化型、失活型、活化型、多聚體型、單體型、配體-結合型、配體-游離型、輔因子-結合型和/或輔因子-游離型。化合物的混合物要進行質量-編碼，這種方法可確保至少90％的化合物具有獨特的可用質譜法檢測的離子質量。
本發明也提供一種發現激酶配體的方法。這些配體對于目標激酶具有選擇性并且可以用來抑制所述激酶。通過篩選激酶(即靶)的基礎型或未活化型(例如未磷酸化型、非二聚型或磷酸化型)，能夠鑒定出選擇性激酶抑制劑。在這些條件下所篩選的激酶優先靶向DFG為DFG-向外位置時所形成的變構部位。在所述變構部位占優勢的條件下，采用親和方法進行篩選。例如，當激酶沒有催化活性(例如激酶是未活化型、基礎低活性狀態或失活型)時，所述變構部位可以占優勢。本發明的另一個優點是通過抑制劑的直接檢測和結構排布還具有能大量篩選化合物的混合物。當激酶為DFG-向外構象時，根據所形成的變構部位建模，本發明也能夠合理設計支架、化合物和文庫。由本發明所獲得的抑制劑優先靶向所述變構部位而且明顯地改進了選擇性。
一方面，本發明提供一種從文庫或化合物的混合物(例如質量-編碼文庫)中鑒定或發現試驗激酶抑制劑的方法。該方法通常包括使文庫成員或化合物的混合物與試驗激酶(例如未活化型激酶)接觸或孵育。然后將結合化合物與未結合化合物分離。在另一個實施方案中，任選將結合化合物與未結合化合物分離。然后可以對結合化合物(即潛在的抑制劑)進行鑒定(例如用質譜法)。該方法還可以包括測定潛在的結合劑是抑制還是降低試驗激酶的活性(例如使用常規測定，例如生物化學測定或基于細胞的測定)，該方法包括下述步驟在條件和時間都充分容許抑制劑與試驗激酶結合的情況下，使抑制劑與試驗酶接觸；然后確定試驗激酶是否因抑制劑而變得無功能或者功能減弱。在一個實施方案中，在缺乏ATP和/或肽底物時孵育或接觸化合物的混合物(例如質量-編碼文庫)。在另一個實施方案中，在有ATP和/或肽底物時孵育或接觸化合物的混合物(例如質量-編碼文庫)。在一個實施方案中，試驗激酶是全長激酶。在另一個實施方案中，試驗激酶包括全長激酶的截短片段，其含有催化結構域。在另一個實施方案中，試驗激酶是激酶變異體或激酶突變體。在另一個實施方案中，試驗激酶是未活化的。在另一個實施方案中，試驗激酶是活化的。在另一個實施方案中，試驗激酶相對于其生理激活狀態是部分活化的。在另一個實施方案中，試驗激酶為基礎型，表現出低催化活性。在另一個實施方案中，可用質譜法鑒定能結合試驗激酶的化合物，這可以通過比較質量-編碼化合物的數據庫來進行。
本發明提供一種通過確定DFG基序為DFG-向外構象中的位置來鑒定激酶抑制劑的方法，致使如果DFG基序為DFG-向外構象，那么所形成的凹口袋作為抑制劑結合部位。一方面，本發明提供一種設計抑制劑的方法。該方法包括下述步驟a)比較未活化型試驗激酶和已知其三維結構的參照激酶(例如蛋白質數據庫標識符1kv1鏈a、1kv2鏈a、1iep鏈a、1iep鏈b、1fpu鏈a、1fpu鏈b和1irk；在URL網址，rcsb.org/pdb/中可以找到該蛋白質數據庫)；b)鑒定變構結合部位(例如相對于DFG基序和螺旋α-C定位的變構結合部位)；c)根據變構結合部位設計抑制劑。設計該抑制劑可以包括根據變構結合部位的拓撲性質和電子性能設計支架，然后根據支架設計質量-編碼文庫。在另一個實施方案中，步驟c)包括提供質量-編碼文庫或化合物的混合物。在另一個實施方案中，該方法還包括篩選(例如使用試驗激酶進行親和篩選)質量-編碼文庫中與試驗激酶結合的化合物，然后在有或沒有抑制劑時進行激酶測定以確定激酶結合劑是否抑制激酶，從而設計或發現試驗激酶的抑制劑。
在一個實施方案中，已知其三維結構的參照激酶是具有以下蛋白質數據庫標識符的激酶1g3n鏈a、1g3n鏈b、1kv1鏈a、1kv2、鏈a、1iep鏈a、1iep鏈b、1fpu鏈a和1fpu鏈b或1irk。在另一個實施方案中，試驗激酶是具有以下蛋白質數據庫標識符激酶1g3n鏈a、1g3n鏈b、1kv1鏈a、1kv2、鏈a、1iep鏈a、1iep鏈b、1fpu鏈a和1fpu鏈b或1irk。
在另一個實施方案中，通過DFG基序的定位和測定DFG基序為DFG-向外位置來鑒定變構結合部位。相對于DFG-向外構象的DFG基序以及相對于螺旋α-C可以確定變構部位的位置。在另一個實施方案中，DFG-向外位置中的DFG基序與α螺旋C之間的距離大于11而小于20。在另一個實施方案中，α螺旋C與含有Val1050-Met1051的胰島素受體激酶α螺旋C在相對的三維位置中是相似的。α螺旋C在相對的三維位置中與含有Val289-Met290的c-ab1α螺旋C可以是同源的。DFG基序可能有序列DWG或DLG。在另一個實施方案中，試驗激酶是c-ab1、p38MAPK或胰島素受體酪氨酸激酶。在另一個實施方案中，所述變構結合部位在空間上不同于與ATP結合部位和活化環。
另一方面，本發明提供一種從化合物的混合物(例如文庫，例如質量-編碼文庫)中鑒定試驗激酶的抑制劑的方法，所述抑制劑根據激酶(例如未活化型激酶)的DFG為DFG-向外構象時所形成的變構結合部位(例如凹口袋)的拓撲結構和靜電性能進行設計。該方法通常包括制備具有通式A(B)n的質量-編碼的化合物組，其中A為支架，每個B獨立地為外周部分，n為大于1、典型的是2至約6的整數。該方法包括從外周部分前體組選擇外周部分前體亞組，這基于DFG為DFG-向外構象時所形成的激酶(例如未活化型激酶)變構部位的拓撲結構和靜電性能。所述亞組包括足夠數量的外周部分前體，即在亞組中至少有約50、100、250或500種源于外周部分前體的n外周部分的不同組合。選擇外周部分前體的亞組，使得源自外周部分前體亞組的n外周部分所有可能的全部組合的至少90％所具有的分子質量總和不同于n外周部分所有的其它組合的分子質量總和。該方法還包括使外周部分前體亞組與具有n個活性基團的支架前體接觸，其中的每個基團至少能與一個外周部分前體反應形成共價鍵。在每個活性基團與外周部分前體充分反應的條件下，使外周部分前體亞組與支架前體接觸，生成了通式A(B)n化合物的質量-編碼組。
準確地說，通式A(B)n化合物的質量-編碼組的制備方法包括下述步驟(a)從外周部分前體組中選擇每組有兩個不同的外周部分前體，其中選擇的方式是兩個為一組，如果兩個外周部分前體具有相等的分子質量，那么就去掉一個，形成保留組；(b)從保留組中，選擇每組有四個外周部分前體，包括已知的四個的組，如果所確定的有四個外周部分前體的組中前兩個前體的分子質量總和與所確定的有四個外周部分前體的組中后兩個前體的分子質量總和相等，那么就去掉四個外周部分前體中的一個，所述選擇后形成保留組。(c)從保留組中，選擇每組中有六個不同外周部分前體，包括已知的六個的組，如果所確定的六個的組中前三個前體的分子質量總和與所確定的六個的組中后三個前體的分子質量總和相等，那么就去掉六個外周部分前體中的一個，所述選擇后形成外周部分前體的工作選擇組；(d)從外周部分前體的工作選擇組中選擇外周部分前體亞組，因此所述亞組就包括足夠數量的外周部分前體，即至少有約250種源于所述亞組的n外周部分的不同組合，其中源于所述亞組的n外周部分的至少約90％的組合具有的分子質量總和，與源于所述亞組的n外周部分的所有的其它組合的分子質量總和不同。e)將所述外周部分前體亞組與支架前體接觸，所述支架前體有n活性基團，其中每個活性基團能夠和至少一個外周部分前體反應形成共價鍵，在每個活性基團與外周部分前體充分反應的條件下，由此產生通式A(B)n化合物的質量-編碼組。
另一方面，可以通過篩選產生于各不相同的試驗激酶抑制劑組中的質量-編碼文庫(例如現有的質量-編碼文庫)鑒定試驗激酶抑制劑，即通過用逆向合成確定含于各不相同的化合物的組內的支架和構件并如上述使用算法(Corey and Cheng，1995，The Logic of ChemicalSynthesis，John Wiley & Sons，Inc.)。
另一方面，可以通過篩選化合物文庫鑒定試驗激酶抑制劑。可以計算文庫中每個成員的分子量以及以質量-編碼格式所組合的文庫成員，即可以制備化合物的文庫，致使每個成員(或幾乎全部成員，例如至少90％的成員，或至少在90-100％之間的整數百分比，90％和100％也包括在內)相對于文庫的其它成員都具有與單一質量。該方法通常包括使質量-編碼文庫的成員與試驗激酶(例如未激活狀態的激酶)接觸。然后使結合化合物與未結合化合物分離。在另一個實施方案中，任選使結合化合物與未結合化合物分離。然后可以鑒定(例如用質譜法)結合的化合物(即潛在的抑制劑)。該方法還可包括確定潛在的結合劑是否抑制(例如使其無功能或功能減弱)試驗激酶(例如使用常規測定，例如生化測定或基于細胞的測定)，其中包括在條件和時間足以容許抑制劑與試驗激酶結合的情況下，使抑制劑與試驗激酶接觸的步驟。
另一方面，本發明提供一種設計試驗激酶的抑制劑的方法，該方法包括下述步驟a)使用試驗激酶的三維結構確定DFG基序的位置；b)鑒定在DFG基序為DFG-向外構象時形成的變構結合部位，其中變構結合部位在空間上可區別于或不同于ATP結合部位和活化環；c)根據變構結合部位設計抑制劑。試驗激酶可以是已知其三維結構的激酶，例如p38MAP激酶、c-ab1或胰島素受體激酶且其為未活化型。該方法還可包括確定潛在的結合劑是否抑制試驗激酶，其中包括下述步驟d)在條件和時間足以容許抑制劑與激酶結合的情況下，使抑制劑與激酶接觸；e)確定激酶是否因為抑制劑作用而變得無功能或功能減弱。在另一個實施方案中，試驗激酶不是c-ab1、p38MAPK或胰島素受體酪氨酸激酶。
另一方面，本發明提供一種鑒定試驗激酶的抑制劑的方法，該方法包括下述步驟a)提供試驗化合物，該化合物能與試驗激酶結合但物理上不與試驗激酶上的ATP結合部位結合(例如僅部分結合或者完全不結合)，其中當試驗激酶的DFG基序為DFG-向外位置時，試驗化合物與變構部位結合；b)確定ATP是否可以與試驗激酶上的ATP結合部位結合，其中由于試驗化合物與試驗激酶的變構部位的結合證明了試驗化合物是作為激酶抑制劑，因此間接地干擾了ATP與試驗激酶的結合；c)在有或沒有結合試驗激酶的抑制劑時任選進行激酶測定，其中如果有試驗化合物時的激酶活性低于無試驗化合物時的激酶活性，就進一步證明試驗化合物是試驗激酶的抑制劑。在一個實施方案中，試驗激酶不是c-ab1、p38MAPK或胰島素受體酪氨酸激酶。
另一方面，本發明提供一種鑒定試驗激酶的抑制劑的方法，該方法包括下述步驟a)提供試驗化合物，該化合物能與試驗激酶結合但物理上不與試驗激酶上的ATP結合部位結合(例如僅部分結合ATP結合部位或者不結合ATP結合部位)；b)確定ATP是否可以與試驗激酶上的ATP結合部位結合，其中由于試驗化合物與試驗激酶的結合干擾了ATP與試驗激酶的結合，就證明了激酶的抑制劑，其中試驗化合物限定(例如鎖定或固定)試驗激酶的DFG基序為DFG-向外位置。在另一個實施方案中，還有一個步驟包括在有或沒有試驗化合物時進行激酶測定，證明試驗化合物是激酶的抑制劑，其中有試驗化合物時的激酶活性低于無試驗化合物時的激酶活性從而證明了激酶抑制劑的鑒定。在另一個實施方案中，試驗激酶不是c-ab1，、p38MAPK或胰島素受體酪氨酸激酶。
另一方面，本發明提供一種鑒定在空間上可區別于或不同于ATP結合部位或活化環的變構結合部位的方法，該方法包括a)比較試驗激酶與已知其三維結構的參照激酶；b)定位試驗激酶中的DFG基序根據其在參照激酶中的位置(例如由計算覆蓋的試驗激酶和參照激酶和/或由多重序列比對(Peitsch等，1995，ProModautomated knowledge-based protein modelling tool.PDB Quarterly Newsletter 724；Marti-Renom等，2000，Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.29，291-325，2000))；c)測算α螺旋C中的α碳殘基與試驗激酶的DFG基序的苯丙氨酸、亮氨酸或色氨酸的非主鏈重原子之間的最短距離，其中大于11而小于20的距離是試驗激酶的DFG基序為DFG-向外構象的特征，其中DFG基序為DFG-向外構象時鑒定變構結合部位。當DFG基序為DFG-向外位置時，它可以誘導凹口袋的形成，其中凹口袋的表面部分由一連串連續氨基酸(設定為X至Y)如c-ab1中的氨基酸104-111(就c-ab1來說，X為氨基酸104，Y為氨基酸111)形成。在一個實施方案中，試驗激酶的氨基酸X至Y與參照激酶的氨基酸X至Y可以是同源的。在另一個實施方案中，氨基酸X至Y可由蛋白質的Leu104至Ala111所組成的連續氨基酸序列組成，該蛋白質的PDB檢索代碼通過序列比對分析定為1kv1(鏈A)。在另一個實施方案中，氨基酸X至Y可由蛋白質的Leu104至Ala111所組成連續氨基酸序列組成，該蛋白質的PDB檢索代碼通過序列比對分析定為1kv2(鏈A)，試驗激酶的氨基酸X至Y由蛋白質的Leu104至Ala111所組成的連續氨基酸序列同源的氨基酸組成，該蛋白質的PDB檢索代碼通過序列比對分析定為1kv1(鏈A)或1kv2(鏈A)。在另一個實施方案中，試驗激酶的氨基酸X至Y由連續氨基酸序列組成，該序列由與1iep(鏈A)、1iep(鏈B)、1fpu(鏈A)或1fpu(鏈B)的Ile313至Asn322同源的氨基酸組成。在另一個實施方案中，試驗激酶的氨基酸X至Y由連續氨基酸序列組成，該序列由與1irk的Leu1073至1080同源的氨基酸組成。
另一方面，本發明提供一種鑒定在空間上可區別于或不同于ATP結合部位和活化環的變構結合部位的方法，對于試驗激酶抑制劑該方法包括下述步驟a)定位(例如通過多重序列比對)試驗激酶中的DFG基序，通過將試驗激酶的三級結構與已知其三維結構的激酶的三級結構進行比較；b)當DFG基序為DFG-向外位置時，使試驗化合物與變構部位結合；c)確定試驗化合物是否抑制試驗激酶的活性(例如通過激酶測定或與激酶結合的試驗化合物X-射線晶體的生成和分析)；d)確定在DFG基序為DFG-向外構象時所形成的變構部位上，試驗化合物是否結合試驗激酶(例如通過標記試驗化合物)，其中試驗化合物的結合使得DFG基序被限定在DFG-向外位置上，證明了試驗激酶的變構結合部位。在另一個實施方案中，試驗激酶不是c-ab1、p38MAPK或胰島素受體酪氨酸激酶。
另一方面，本發明提供一種鑒定抑制劑的方法，該方法包括a)將試驗激酶(例如表2的那些激酶)與已知其三維結構的激酶進行比較；b)鑒定激酶上的變構結合部位；c)設計靶向變構結合部位的支架；d)提供基于支架的化合物的混合物；e)通過對激酶的親和篩選鑒定變構部位的配體。該方法還可包括步驟f)證明抑制劑的激酶抑制劑活性。在另一個實施方案中，試驗激酶不是c-ab1、p38MAPK或胰島素受體酪氨酸激酶。在另一個實施方案中，已知其三維結構的激酶選自具有以下蛋白質數據庫標識符的激酶1iep鏈a、1iep鏈b、1fpu鏈a、1fpu鏈b、1kv1鏈a、1kv2鏈、1irk、1gn3n鏈a和1g3n鏈b。在另一個實施方案中，變構結合部位在空間上可區別于ATP結合部位和活化環。在又一個實施方案中，通過定位DFG基序(例如DFG、DLG或DWG)以及在DFG基序為DFG向構象時鑒定變構結合部位。
另一方面，本發明提供一種鑒定在空間上可區別于ATP結合部位和活化環的變構結合部位的方法，對于試驗激酶抑制劑該方法包括a)使試驗化合物與其DFG基序為向外位置的激酶結合；b)確定試驗化合物是否抑制試驗激酶的活性；c)確定已知的試驗激酶抑制劑即已知的抑制劑是否與DFG基序為DFG-向外位置時形成的變構部位結合。已知的抑制劑可以和試驗化合物競爭結合試驗激酶，其中對于試驗激酶抑制劑，已知抑制劑的競爭性結合鑒定了在空間上可區別于或不同于ATP結合部位和活化環的變構結合部位。在另一個實施方案中，試驗激酶不是c-ab1、p38MAPK或胰島素受體酪氨酸激酶。
另一方面，本發明提供一種合成激酶抑制劑的方法，該方法包括a)將試驗激酶與已知其三維結構的激酶進行比較；b)鑒定變構結合部位；c)根據變構結合部位設計抑制劑；d)合成抑制劑。在一個實施方案中，試驗激酶不是c-ab1、p38MAPK或胰島素受體酪氨酸激酶。
另一方面，本發明提供采用下述方法設計的抑制劑a)比較試驗激酶與已知其三維結構的激酶(例如蛋白質數據庫標識符1kv1鏈a、1kv2鏈a、1iep鏈a、1iep鏈b、1fpu鏈a、1fpu鏈b和1irk)；b)鑒定變構結合部位；c)根據變構結合部位設計抑制劑。在另一個實施方案中，試驗激酶不是c-ab1、p38MAPK和胰島素受體酪氨酸激酶。
另一方面，本發明提供一種包含采用下述方法設計的抑制劑的藥用組合物a)比較試驗激酶與已知其三維結構的激酶(例如參照激酶)(例如蛋白質數據庫標識符1kv1(鏈A)、1kv2(鏈A)、1iep(鏈A)、1iep(鏈B)、1fpu(鏈A)、1fpu(鏈B)和1irk)；b)鑒定變構結合部位(例如由于試驗激酶氨基酸與參照激酶(見表1)的氨基酸X至Y類似而鑒定的凹口袋；c)根據變構結合部位(例如凹口袋)設計抑制劑。在另一個實施方案中，所述藥用組合物可以包含采用下述方法設計的抑制劑a)利用參照激酶的三維結構確定試驗基酶中的DFG基序的位置；b)鑒定DFG基序為DFG-向外構象時形成的變構結合部位，其中變構結合部位在空間上可區別于與ATP結合部位和活化環；c)根據變構結合部位設計抑制劑。在另一個實施方案中，試驗激酶不是c-ab1、p38MAPK或胰島素受體酪氨酸激酶。
另一方面，本發明提供包含采用本文所述方法設計、發現或鑒定的抑制劑的試劑盒。例如，所述方法包括a)比較試驗激酶與已知其三維結構的激酶(例如蛋白質數據庫標識符1kv1(鏈A)、1kv2(鏈A)、1iep(鏈A)、1iep(鏈B)、1fpu(鏈A)、1fpu(鏈B)和1irk)；b)鑒定變構結合部位；c)根據變構結合部位設計抑制劑。在另一個實施方案中，所述試劑盒可以包含采用下述方法設計的抑制劑a)利用試驗激酶的三維結構定位DFG基序；b)鑒定DFG基序為DFG-向外構象時所形成的變構結合部位，其中變構結合部位(例如DFG為DFG-向外位置時誘導的凹口袋)在空間上可區別于ATP結合部位和活化環；c)根據變構結合部位(例如DFG為DFG-向外位置時誘導的凹口袋)設計抑制劑(例如計算的)。
另一方面，本發明提供抑制激酶活性或治療患者(例如哺乳動物，例如人)的激酶介導的疾病或疾病癥狀的方法，所述方法包括給予患者包含采用下述方法設計的抑制劑的化合物的步驟a)比較試驗激酶與已知其三維結構的激酶(例如蛋白質數據庫標識符1kv1(鏈A)、1kv2(鏈A)、1iep(鏈A)、1iep(鏈B)、1fpu(鏈A)、1fpu(鏈B)和1irk)；b)鑒定變構結合部位(例如DFG為DFG-向外位置時誘導的凹口袋)；c)根據變構結合部位(例如DFG為DFG-向外位置時誘導的凹口袋)設計抑制劑。在另一個實施方案中，抑制患者(例如哺乳動物，例如人)的激酶活性的方法可以包括采用下述方法設計的抑制劑a)利用試驗激酶的三維結構定位DFG基序；b)鑒定DFG為DFG-向外構象時所形成的變構結合部位(例如DFG為DFG-向外位置時誘導的凹口袋)，其中變構結合部位(例如DFG為DFG-向外位置時誘導的凹口袋)在空間上可區別于ATP結合部位和活化環；c)根據變構結合部位設計抑制劑(例如計算的)。
另一方面，本發明提供一種制備藥用組合物的方法，該方法包括將抑制劑(例如采用任一本文所述方法鑒定的抑制劑)與一種或多種藥物可接受的載體混合并且任選還包括聯合應用其它治療藥。該藥用組合物可以含有不止一種激酶抑制劑和/或不止一種其它治療藥。在一個實施方案中，經鑒定的抑制劑可以用于制備用來治療疾病(例如癌癥(例如乳腺癌、前列腺癌、肺癌)、炎癥(例如關節炎、類風濕性關節炎)、神經科疾病(例如阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease))和肥胖癥等各種疾病)的藥物。
定義生物分子例如酶(即靶部分，例如激酶)的“未活化型”或“基礎型”是靶部分處于不能或幾乎不能執行其生理功能的構象的狀態。通常，需要進一步轉化生物分子的未活化型或基礎型以獲得完全生物活性。進一步的步驟包括，例如在激酶或其它生物分子中適當地進行磷酸化、去磷酸化、其它修飾、結合另外的單體、多聚化、定位、移位、結合輔因子或結合底物，以及能激活未活化生物分子的其它事件。因此，未活化生物分子能被這些事件中的任一事件或其它事件完全激活。如果靶部分是酶，則未活化型或基礎型通常為不能作用于其底物的酶狀態(例如激酶為不能或幾乎不能將其底物磷酸化的狀態；甲基化酶為不能或幾乎不能將其底物甲基化的狀態；磷酸酶為不能或幾乎不能將其底物去磷酸化的狀態；蛋白酶為不能或幾乎不能執行其蛋白酶解功能的狀態；多肽為不與另外的多肽或分子締合的狀態；多肽不會選擇性突變或誘導成特定構象(例如由于溫度變化或其它因素誘導的構象)。在某些情況下，未活化型或基礎型不與ATP結合。在其它情況下，未活化型或基礎型是單體狀態而非多聚體狀態，或者反之亦然。仍然在其它情況下，未活化型或基礎型與或不與執行其功能所必需的輔因子或其它分子結合，或者說在誘導的構象中沒有未活化型或基礎型。未激活狀態或基礎狀態的靶部分仍然可以具有活性或功能，但是相對于其激活狀態的活性或功能有所減少或降低，無論是其活性或功能的大小和/或持續時間。本文所用的“未活化型”是指不是靶部分的未活化型就是靶部分的基礎型。盡管這兩項術語的含意不同，但是在描述方法和組合物的上下文中都可以等同地使用它們。即所述方法可以使用未活化型的靶部分或者可以使用基礎型的靶部分，并且無論發生兩種情況中的哪一種情況皆可達到同樣的結果；即，鑒定在特定狀態下與靶部分結合的化合物。
另一方面，生物分子可以是“失活的”，這是指生物分子缺乏被激活的能力。可能引起生物分子失活的事件包括突變、截短或其它修飾，它們使得生物分子在任何情況下或有任何活化劑時都不被激活。
“未活化型激酶”是與ATP結合的能力和/或執行其功能活性(包括其體內功能活性)都較弱的激酶。因此，相對于當執行其體內功能時，未活化型激酶很少或無激酶活性。為了變成完全活化的，未活化型激酶可以是需要任一或若干下述事件的激酶修飾(例如磷酸化、去磷酸化、其它修飾)、與調節部分(例如輔因子、蛋白質/脂質調節劑)接觸或結合或其它事件(例如多聚化、定位、移位)。因此，一旦完成上述一個或多個事件，未活化的激酶完全可以變得功能完全或完全活化。然而，失活激酶不可能被活化，無論是通過突變、截短、錯折疊、不能適當地定位或者不能結合所需的輔因子或其它活性所需的分子。總之，可以應用本文描述的方法，例如鑒定結合激酶上的新變構部位的激酶抑制劑，所述新變構部位可能存在于激酶的未活化型或失活型。
術語“校準”是指通過測量或與標準比較所確定的計量器或其它測量儀器上每一刻度讀數的正確數值。例如分析或測量儀器(例如質譜儀)可以通過測量或確定已知真實值的分析物(例如配體濃度)的多個數值來校準。
術語“質譜儀“是指一種利用電離原子或電離分子不同的質荷比(m/e)將它們彼此分開的分析裝置。因此質譜法可用于測定原子或分子的數量而且也可用于確定分子的化學和結構信息。分子具有特征性碎裂方式，從而為鑒定結構組分提供結構信息。質譜儀的常規操作是a)產生氣-相離子；b)這些離子按其質荷比在空間或時間上進行分離；c)測量每一質荷比的離子數量。通過對其解析描述質譜儀的離子分離能力。
本領域有很多已知的電離源，例如電噴霧電離(ESI)、電子電離(EI)、快速原子轟擊電離(FAB)、基質輔助激光解吸電離(MALDI)、電子-捕獲(有時稱為負離子化學電離或NICI)以及大氣壓化學電離(ApCI)。使上述任一電離方法產生的離子通過質量分離器，典型的是磁場、四極電磁或飛行時間質量分離器，以便于區分離子質量以及每一質量水平的離子數量。
質譜法(MS)是一種有機化學和無機化學領域中廣泛使用的用于分子表征和分子鑒定的技術。MS提供有關分子的分子量信息。分子的分子量是鑒定分子混合物中的具體分子的關鍵信息。MS分析可以用于例如藥物開發和制備、污染控制分析和化學質量控制。
術語“配體“是指與受體締合或結合(例如以共價或非共價方式相互作用)的分子。在一些情況下，配體與受體的結合可能有生物效應(例如激動作用或拮抗作用)。例如，配體可以是與生物分子(例如DNA分子)結合的多肽(例如蛋白質)，其中蛋白質與DNA的結合啟動mRNA的合成。配體也可以是與酶(例如HIV蛋白酶)結合的有機分子(例如藥物化合物)，其中有機分子和酶的結合能抑制酶的活性。
當配體是“結合劑”或者“結合”靶或是靶的配體時，締合可以通過共價相互作用、非共價相互作用或其它相互作用，包括各種形式的相互作用(例如空間相互作用、范德瓦爾斯(van der Waals)相互作用、靜電相互作用、溶劑化相互作用、電荷相互作用、共價鍵相互作用、非共價鍵相互作用(例如氫鍵相互作用)、熵或焓有利的相互作用)。
“抑制劑”是一種分子(例如一種小分子，例如約小于5kDa的分子)，當它與靶(例如激酶)結合時可以降低靶的生理活性(例如使激酶功能減弱)或阻斷其活性(例如使激酶無功能)。抑制劑可以是小于1000道爾頓的小分子、小于750道爾頓、600道爾頓或500道爾頓的小分子、天然存在或非天然存在氨基酸的多肽、天然存在或非天然存在氨基酸的肽、擬肽、肽模擬物、合成的化合物、合成的有機化合物等等。例如，由于抑制劑而使“功能減弱”的靶(例如酶，例如激酶)，是指具有可檢測活性的靶(例如酶，例如激酶)，所述可檢測活性小于其生理條件下的活性。如果通過生物測定(例如酶抑制測定，例如激酶抑制測定)不能察覺靶的活性，那么該靶(例如酶，例如激酶)由于抑制劑而成為“無功能”的。
靶上的“變構部位”，以激酶為例，如本文所述，就是在空間上不同于靶(例如激酶)的ATP結合部位的部位，當該部位被配體(變構配體)占據時，調節(例如抑制)或阻止ATP結合也就影響激酶功能。靶(例如激酶)上的在空間上不同的“變構部位”也可以調節或阻止底物的結合，而對靶(例如激酶)的功能有著同樣的影響。“在空間上不同于ATP結合部位”所指的結合部位是與ATP結合部位分離并限于激酶內的氨基酸殘基，總體上是不同于限定ATP結合部位的氨基酸序列。在空間上不同于ATP結合部位的部位可以在氨基酸長度上與ATP結合部位有區別，可以在單個氨基酸上有區別，還可以在包含該部位的氨基酸序列的順序上有區別。因此變構部位在空間上不同于或可區別于ATP結合部位(例如ATP結合部位和變構結合部位不是同一個)。本發明的變構部位與ATP部位部分地重疊也是可行的，但是不能把變構部位和ATP結合部位認作是同一個。本文描述的方法可以用于鑒定在變構部位上與靶(例如激酶)結合的配體(例如抑制劑)，而且由于結合變構部位，這些配體(例如抑制劑)鎖定、限制或保持DFG基序為DFG-向外位置。DFG為DFG-向外位置在物理上阻止ATP與靶(例如激酶)結合，因而有可能以這種新方式抑制靶(例如激酶)。
本文描述的方法可以用于鑒定酶(例如激酶)的抑制劑。“根據變構結合部位設計抑制劑”是指根據變構結合部位(例如DFG為DFG-向外位置時誘導的凹口袋)使用計算機建模確定潛在酶(例如激酶)結合劑的最佳特征，并用這些信息合成潛在酶(例如激酶)結合劑。將潛在酶(例如激酶)結合劑設計為與存在于DFG基序為DFG-向外構象時的變構結合部位(例如由DFG-向外位置中的DFG誘導的凹口袋)結合。設計抑制劑也意指設計具有正確的拓撲性質(形狀)和靜電性能，適合變構結合部位的支架。一旦支架設計完成，就可以提供或合成質量-編碼文庫(例如基于支架的文庫)，并且在變構部位(即存在于DFG為DFG-向外位置時的)起主要作用(即沒有ATP和底物時未活化的激酶)的條件下，通過用激酶的親和篩選鑒定源于此文庫的變構結合劑(例如抑制劑)。這是個驚人的結果，也是本發明的關鍵方面，在激酶為未活化型條件下，親和篩選方法提供了優先靶向DFG-向外構象的激酶的抑制劑。
術語“有機分子”是指化合物，其中所述分子包括碳和氫，并且也可以包括另外的元素，例如氮、氧、磷、鹵素或硫(例如藥物化合物)。藥物可接受的鹽(例如馬來酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、醋酸鹽、富馬酸鹽、水楊酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、扁桃酸鹽、酒石酸鹽和甲磺酸鹽)也包括在術語“有機分子”含義之內。
術語“受體”是指在細胞內配體可以結合且發揮信號功能的生物分子。配體可以刺激或激活正常的生理功能。或者說，配體可以調節或抑制生理功能。受體一旦與第二個分子締合，就能夠或引發一種效應(例如生物學活性或可檢測信號)。例如，受體可以是蛋白質，該蛋白質結合特異性胞外信號分子(例如配體)并且在細胞里誘導反應。細胞表面受體的實例包括乙酰膽堿受體和胰島素受體。胞內受體的實例包括激素，其可以結合配體穿過質膜擴散到細胞里。受體的其它實例包括多肽、蛋白質、酶、核酶、RNA、DNA和生物分子模擬物。
術語“生物分子”是指影響生物活性(例如代謝、拮抗作用、激動作用、信號傳導或轉錄)的分子。當可能在體內發現生物分子時，那么術語生物分子就不僅限于天然存在的生物分子，而是還包括合成的天然存在的生物分子及其片段和修飾。生物分子的實例包括多肽、蛋白質、酶、核酶、RNA和DNA。
術語“多肽”是指由多個氨基酸組成的聚合物。蛋白質可以是多肽的一個實例。
術語“酶”是指大分子，通常是蛋白質，其功能是作為(生物)催化劑以增加反應速率。通常，一種酶只催化一個反應(即反應選擇性)并且只作用于一種底物(即底物選擇性)。底物分子通常是在同一的部位轉化(區域選擇性)；而且通常只轉化一種外消旋底物對的手性底物(對映選擇性，特殊形式的立體選擇性)。
術語“核酸”是指由核苷酸亞單位組成的聚合物。該核苷酸亞單位可以通過磷酸二酯鍵結合在一起。
術語“受體-配體對”是指由受體和配體組成的復合物，一般通過非共價作用(例如氫鍵，離子相互作用或疏水相互作用)以可逆方式保持在一起。
術語“平衡”是指可逆的化學反應和/或生化反應和/或相互作用的狀態，在此狀態反應物轉向產物的速率與產物回轉成反應物的速率相同，以致每種反應物和產物的數量基本恒定。在一段時間內采集混合物樣品并確定初始原料與產物的比率不會改變，這樣可以精確地證明反應達到了平衡。
術語“大小排阻層析”(SEC)是指使用多孔顆粒分離大小不同的分子。通常用于分離生物分子，以及確定聚合物的分子量和分子量分布。通常，比孔徑小的分子可以進入顆粒內，因此，與不能進入顆粒的較大分子相比，就有著更長的通徑和更長的過渡時間。比孔徑大的分子不能進入孔內而一起洗脫成為層析圖里的第一個峰。這種狀況稱為總排阻。可以進入孔內的分子在顆粒中會有取決于分子大小和形狀的平均停留時間。因此，不同的分子具有不同的通過柱子的總過渡時間。小于孔徑的分子可以進入所有的孔，且在柱上具有最長的停留時間而一起一起洗脫成為層析圖里的最后一個峰。
術語“液相層析”是指一種用于分離溶解于溶劑中的離子和/或分子的分析型層析技術。如果將樣本溶液與第二固相或液相接觸，那么由于吸附、離子交換、分配或大小的差異，不同的溶質會不同程度地與其它相互相作用。這些差異使得混合物的組成成分彼此分開，用這些差異確定溶質過柱的過渡時間。高效液相層析(HPLC)是分離溶液內化合物的液相層析的一種。HPLC儀器由流動相容器、泵、注射器、分離柱和檢測器組成。將樣本混合物注入柱子來分開化合物。因為它們在流動液相和固定相間的分配行為的差異，所以混合物里的不同成分以不同的速率通過柱子。
術語“競爭性結合劑”是指在特定部位(例如酶的催化部位)與受體結合的配體，其中該競爭性結合劑在動態的、平衡樣過程中與其它配體競爭結合。
術語“靶部分”是指可以應用篩選方法發現結合的配體的生物分子或其片段。
術語“靶型”是指生物分子(例如激酶)的區別生化狀態或生物物理狀態，例如不同的構象、聚集狀態、化學修飾、與其它生物分子或輔因子締合以及與一個或多個配體締合。
本文所述的靶可以指激酶。“DFG基序”是指激酶中的保守基序，它由三個連續氨基酸組成，前面是天冬氨酸后跟苯丙氨酸、色氨酸或亮氨酸，其后跟甘氨酸(即Asp-Phe/Leu/Trp-Gly)。因而DFG基序可以有氨基酸序列DFG、DWG或DLG。例如，Asp1150-Phe1151-Gly1152是胰島素受體激酶中的DFG基序；Asp381-Phe382-Gly383是c-ab1中的DFG基序；Asp168-Phe169-Gly170是p38MAPK中的DFG基序。將已知其DFG基序位置的蛋白質與待測DFG基序的蛋白質進行多重序列比對，可以鑒定這個基序。
特異性靶中的獨特結構，激酶是“螺旋alpha-C”(也稱為螺旋α-C)。“螺旋α-C”是指激酶中的保守螺旋。例如在胰島素受體激酶中，該螺旋由氨基酸序列LRERIEFLNEASVM(氨基酸1038-1051)組成，在1050-1051處有Val-Met基序。另一個例子，在c-ab1中，該螺旋由氨基酸序列VEEFLKEAAVM(氨基酸280-290)組成，在氨基酸289-290處有Val-Met基序。試驗激酶的螺旋α-C與胰島素受體激酶中的螺旋α-C是“同源的”，其含有位于1050的纈氨酸后跟位于1051的甲硫氨酸，并且與c-ab1中的螺旋α-C也是“同源的”，其含有位于289的纈氨酸和位于290的甲硫氨酸。1irk是胰島素受體激酶在蛋白質數據庫(PDB)中的檢索代碼，可以在萬維網上找到，網址為rcsb.org/pdb/，在此網址也可以找到1iep，而且是與STI-571(即甲磺酸伊馬替尼(Gleevec))結合的c-ab1的PDB的檢索代碼。
具有相似側鏈的氨基酸殘基家族已經在本領域限定。這些相似性可允許氨基酸在激酶的三維結構內起“類似”作用。這些家族成員包括帶堿性側鏈的氨基酸(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、帶酸性側鏈的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷的極性側鏈氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、帶非極性側鏈的氨基酸(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、帶β-分枝側鏈的氨基酸(蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和帶芳香族側鏈的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此，舉例說明，與賴氨酸類似的氨基酸必定是精氨酸或組氨酸。如另一個實例，天冬氨酸如本文所述與谷氨酸類似。
下面給出了本發明的一個或多個實施方案的細節。根據說明書和所附權利要求，本發明的其它特征、目的和優勢將會是顯而易見的。
詳述本文描述的方法是根據以下發現除活化型以外的靶(例如生物分子)型，對于鑒定靶(例如生物分子)功能的新抑制劑是非常有用的。所述方法提供用新的方式篩選靶以發現結合靶的低活性或無活性狀態的化合物，并且在后續生物測定中作為靶功能的抑制劑。該方法適用于生物靶的所有類型，包括核酸(例如DNA或RNA)或蛋白質(例如膜結合蛋白、酶、核激素受體(NHR)和G蛋白偶聯受體(GPCR))。所描述的方法不需要生化測定其輸出值而只用很少量提純的靶。本文描述的方法具有幾個優點，包括無需預先了解靶的結構；可以使用化合物的混合物；已知靶的許多型可一起進行(例如在一個普通的結合反應可以將兩個或更多個不同形式的蛋白質混合在一起并對其進行篩選)以提高該方法的效率。本文描述的方法可以利用質量-編碼組合文庫和配體自動鑒定系統(ALIS)，如下所述。
美國專利第6,207,861號涉及制備質量-編碼組合文庫的方法和鑒定(即篩選)在那些質量-編碼組合文庫中的與一個或多個生物分子締合的化合物的方法。可以設計并合成質量-編碼文庫，致使至少約90％的單一化合物具有的分子質量總和不同于質量文庫中其它單一化合物的分子質量總和，在這種情況下允許豐余(例如對于質量單一支架+外周部分組合的質量-編碼類別，及因此產生的計算的位置異構體間的質量豐余)。在其它情況下，可以將質量-編碼文庫設計為至少90％的單一化合物具有的分子質量總和不同于質量-編碼文庫的其它單一化合物的分子質量總和，其中不允許豐余(例如對于質量單一支架+外周部分組合的質量-編碼類別，及因此產生的不計算的位置異構體間的質量豐余)。
在美國專利第6,207,861號中的篩選方法描述了一個稱為配體自動鑒定系統(ALIS)的系統。ALIS系統通常功能如下(1)在有配體(有機小分子或其文庫)時，按規定的時間孵育目標生物分子(例如蛋白質)的稀釋液，使生物分子-配體復合物形成反應達到平衡；(2)將生物分子、未結合的配體的和生物分子-配體復合物的溶液通過大小排阻層析，將生物分子加上生物分子-配體復合物與未結合的配體按分子大小進行分離，其中生物分子加上生物分子-配體復合物在洗脫流的前部共同洗脫；(3)將含有生物分子加上生物分子-配體復合物但卻不含有任何未結合的配體的洗脫流部分進行反相層析脫鹽及洗脫進入質譜儀，在那里對小分子可根據其分子量或質譜法-質譜法碎裂方式進行鑒定并按所測得的信號反應進行定量。
如前所述，當鑒定靶配體(例如激酶抑制劑)時，將化合物的混合物、支架或文庫與試驗靶一起孵育，然后在用質譜法鑒定前，將結合靶的化合物與未結合的化合物分離。在一個實施方案中，為了鑒定結合組分，將結合靶的化合物進行分離。可以用多種方法例如使用層析(例如高溫下的高分辨率反相層析)改變壓力、pH、鹽濃度、溫度或有機溶劑濃度破壞靶-化合物結合對；或者用已知的靶結合劑競爭，或者這些技術的任何組合來破壞靶-化合物的結合對。
一旦結合靶的化合物與靶分離，那么就可以用質譜法鑒定化合物。美國專利第6,147,344號描述了分析質譜儀數據的方法，進行對照樣本的測量提供了本底噪聲校驗。每一m/z比的峰高值和峰寬值作為時間的函數保存在存儲器中。將質譜儀用于待分析的材料并且將每一m/z比的峰高值和峰寬值對時間保存在第二存儲器位置。以固定時間重復操作質譜儀對材料進行分析，并且將每一時間增量、每一m/z比的所存儲的對照樣本值，從測試的每一相應值里扣除，從而獲得每一時間增量、多次測試中每次的質量比的差值。如果MS值減去本底噪聲未超過預置值，那么m/z比數據點不予記錄，因此將本底噪聲、化學噪聲和假正峰從質譜儀數據中排除。然后將多次測試中每次的存儲的數據與每一m/z比的預置和所得的一系列峰相比較，此時可確定高于背景的峰，并將數據存儲在峰是顯著性的那些m/z點。
具體地說，美國專利第6,147,344號描述了一種自動分析質譜儀數據的技術，這些數據來自由系列篩選而組成的化合物的混合物，這些篩選是設計用來消除或減少由于本底噪聲、系統分辨、系統污染、多電荷離子和同位素取代引起的錯誤峰鑒定。該方法可以在有機化合物的復雜混合物中鑒定出有機化合物并且這對于本文描述的一些方法是有用的。使用該技術對對照樣本進行質譜操作，產生第一組輸出值。然后，對待分析樣本進行質譜操作，產生第二組輸出值。為預期存在已計算的質譜儀輸出光譜的預置文庫中的混合物里的材料選擇第一個m/z比，從所分析的樣本數值中減去在預期輸出數值上的對照樣本值，并比較與預期數值的差異。如果所述值大于預定值，就表明信號大于本底噪聲，因此產生所期望材料m/z值的記錄。進行相同的質量光譜操作數次消除隨機噪聲和背景污染。其次，對一些不具預期峰寬或沒有分離方法所需要的適當時間的峰值作了鑒定。通過檢驗峰分離鑒定多電荷離子。檢驗所期望材料的m/z定位并且將所期望的m/z定位的強度與下一個低一些的m/z記錄峰的強度進行比較，鑒定與原子同位素取代有關的一些峰。由于該項技術，對于鑒定可能的假信號質譜儀數據分析可能會簡單得多，而且分析將變得更簡單和更加準確。
計算機建模一旦確定了參考靶-配體復合物或參考靶的晶體的三維結構，就可以通過幾種方法的單獨使用或是結合使用來測定潛在的抑制劑。根據本文描述的結構坐標，可以利用目測檢查計算機屏幕上的相關位點的三維結構表現度。使用本領域普通技術人員通曉的計算機建模技術、硬件和軟件完成所述評價或建模。同時這又涉及模型建立、模型對接或靶-配體相互作用的其它分析，所用軟件包括例如QSC、FlexX(Lengauer，Rarey，1996)或Autodock(Morris等，1998)，GLIDE，Modeler或Sybyl，還有能量最低化和具備包括有例如CHARMM和AMBER標準分子力學場的分子動力學。還可以利用靶-配體復合物的三維結構信息和計算機建模一起建立其它靶蛋白質結構的計算機模型，尤其是那些與已測定三維結構信息的靶同源的。可以用本領域普通技術人員已知的標準方法和技術(包括本文描述的軟件包)建立靶蛋白質結構的計算機模型。
一旦確定包含靶和靶的標準配體的晶體間所形成的蛋白質-配體復合物的晶體的三維結構，通過使用對接程序例如QSC、FlexX或Autodock的計算機建模的應用鑒定潛在的變構結合部位的配體和/或抑制劑，用以確定潛在的配體形狀和化學結構與結合部位相互作用的程度。計算機程序也可用來評價兩個結合配偶體(即變構結合部位和潛在配體)的引力、斥力和立體位阻。一般來說，潛在的配體和變構結合部位間的互補擬合、較低立體位阻、較高吸引力是與兩者牢固結合一致的。此外，所設計的潛在藥物特異性越高，則藥物越難以完成與其它蛋白質相互作用。這將使與其它蛋白質不想要的相互作用所致的潛在的副作用降至最小。
本領域技術人員可利用多種方法評價和實際上篩選適合與蛋白質締合的分子或化學片段，尤其是例如激酶、磷酸酶、轉移酶、GPCR、NHR等等。所述締合可以是多種形式的締合，包括例如空間相互作用、范德瓦爾斯相互作用、靜電相互作用、溶劑化相互作用、電荷相互作用、共價鍵相互作用、非共價鍵相互作用(例如氫鍵相互作用)、焓或熵有利的相互作用等等。
許多計算機程序可以利用并適用于合理藥物設計和計算機建模、模型建立以及用本文描述的方法計算鑒定、選擇和評價潛在的抑制劑的過程。這些包括例如QSC(WO 01/98457)、FlexX、Autodock、Glide、Accelrys′Discovery Studio或Sybyl。也可以運用這些軟件包，例如QSC(WO01/98457)、Accelrys′Discovery Studio、Sybyl、ISIS、ChemDraw或Daylight，“從頭”計算設計潛在的抑制劑。可以運用例如GAUSSIAN 92、AMBER、QUANTA/CHARMM和INSIGHTII/DISCOVER等程序評價化合物形變能和靜電排斥。
這些計算機的評價和建模技術可在任何合適的硬件上進行，例如包括Silicon Graphics、Sun Microsystems等提供的工作站。這些技術、方法、硬件和軟件包都是極具代表性的就不一一列舉。根據本發明也采用本領域已知的其它建模技術。參見QSC(WO 01/98457)、FlexX、Autodock、Glide、Accelrys′Discovery Studio或Sybyl和各個因特網站經標識的軟件例如netsci.org/Resources/Software/Modeling/CADD/ch.cam.ac.uk/SGTL/software.htmlcmm.info.nih.gov/modeling/universal_software.htmldasher.wustl.edu/tinker/zeus.polsl.gliwice.pl/～nikodem//linux4chemistry.htmlnyu.edu/pages/mathmol/software.htmlmsi.umn.edu/user_support/software/MolecularModeling.htmlus.expasy.org/
sisweb.com/software/model.htm由于結合使用或單獨使用計算機建模和上述方法測定了本文描述靶的變構部位的三維結構，就可以進行合理藥物設計，從而選出潛在的抑制劑。然后就可以從商業渠道獲得潛在的抑制劑，或者用本領域普通技術人員已知的標準合成技術和方法用易得的原料合成獲得潛在的抑制劑。然后，如上所述測定潛在的抑制劑，以確定其抑制靶酶(例如激酶)和/或酶途徑(例如激酶途徑)的能力。
也可如上述，通過篩選化合物的文庫(例如組合文庫，例如質量-編碼組合文庫)選擇潛在的抑制劑。可以用親和篩選方法篩選化合物的文庫，從中選擇出對于新變構部位上的特異蛋白質具有最慢解離速率和最大親和力的成員。如上所述，ALIS也可以用于篩選化合物的文庫。由于當靶為未激活狀態時，很多靶中都存在變構部位，因此ALIS是特別有用的。可以將ALIS和化合物的混合物一起使用并且當靶為未激活狀態時尤其可以允許使用它們鑒定結合的配體。常規靶篩選常常依賴于為激活狀態的目標靶。
藥用組合物本發明的藥用組合物包括采用本文描述的一種或多種方法所鑒定的化合物或其藥物可接受的鹽；任選的其它藥物，該藥物選自靶抑制劑(小分子、多肽、抗體等)、免疫抑制藥、抗癌藥、抗炎藥或抗血管過度增生化合物、治療神經障礙的化合物、抗肥胖癥化合物；以及任何藥物可接受的載體、輔料或賦形劑。或者，本發明的組合物包括采用本文描述的一種或多種方法所鑒定的化合物或其藥物可接受的鹽；以及藥物可接受的載體、輔料或賦形劑。
術語“藥物可接受的載體或輔料”是指能與本發明的化合物一起給予患者的載體或輔料，而且當給予足夠遞送化合物的治療量時，它們既不破壞其藥理活性而且無毒。
可能用于本發明的藥用組合物的藥物可接受的載體、輔料和賦形劑包括但不限于離子交換劑、氧化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、自乳化遞藥系統(SEDDS)例如琥珀酸d-α-生育酚聚乙二醇1000，以藥學劑形使用的表面活性劑例如吐溫或其它類似的高分子遞藥基質，血清蛋白質，例如人血清白蛋白、緩沖物質例如磷酸鹽、甘氨酸、山梨酸、山梨酸鉀、及飽和植物脂肪酸的部分甘油酯的混合物、水、鹽或電介質，例如硫酸魚精蛋白、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽、膠態二氧化硅、三硅酸鎂、聚乙烯吡咯烷酮，基于纖維素的物質、聚乙二醇、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸酯、臘、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。環糊精例如α-環糊精、β-環糊精和γ-環糊精或化學改性衍生物例如羥基烷基環糊精，包括2-羥丙基-β-環糊精和3-羥丙基-β-環糊精或其它的增溶衍生物，它們可能用來提高采用本文描述的一種或多種方法所鑒定的化合物的遞送。
本發明的藥用組合物可以通過口服給藥、胃腸外給藥、吸入噴霧給藥、局部給藥、直腸給藥、鼻腔給藥、口腔含化給藥、陰道給藥或經植入的貯庫給藥，優選口服給藥或注射給藥。本發明的藥用組合物可含有任何常用的無毒藥物可接受的載體、輔料或賦形劑。本文所用的術語胃腸外包括皮下、皮內、靜脈內、肌內、關節內、動脈內、滑膜內、胸骨內、鞘內、損害內和顱內注射或輸注技術。
本發明的藥用組合物可以用可接受的任一口服劑型口服給藥，所述口服劑型包括但不限于膠囊劑、片劑、乳劑、水性混懸劑、分散劑和溶液劑。如果是口服片劑，常用載體包括乳糖和玉米淀粉。通常也可以加入潤滑劑例如硬脂酸鎂。對于口服膠囊劑，有效的稀釋劑包括乳糖和干的玉米淀粉。當口服給予水性混懸劑和/或乳劑時，將懸浮或溶于油相的活性成分與乳化劑和/或懸浮劑混合在一起。如果需要，可以加入甜味劑和/或矯味劑和/或著色劑。
本發明的藥用組合物可以包括使用脂質體或微膠囊化技術的制劑。這些技術是本領域已知的。
本發明的藥用組合物也可以是直腸給藥用栓劑。將本發明的組合物與適當的無刺激性賦形劑混合可以制備這類栓劑，所述賦形劑室溫時為固體，但在直腸溫度時為液體，因而會在直腸內熔化釋放活性化合物。這些物質包括但不限于可可脂、蜂蠟和聚乙二醇。
如果所需治療的部分或器官可接受局部用藥時，那么本發明藥用組合物的局部給藥就會特別有用。對于皮膚的局部施用，就應該用含有懸浮于或溶于載體的活性組分的適當的軟膏劑配制藥用組合物。適于本發明化合物局部給藥的載體包括但不限于礦物油、液體石油、白石油、聚乙二醇、聚氧乙烯-聚氧丙烯化合物、乳化臘和水。另一個辦法是，藥用組合物可用合適的活性化合物的洗劑或乳膏配制，該化合物懸浮于或溶解于含適合乳化劑的載體內。合適的載體包括但不限于礦物油、單硬脂山梨坦、聚山梨酯60、十六烷基酯蠟、西替烷基醇(cetearyl alcohol)、辛基十二烷醇、苯甲醇和水。本發明的藥用組合物也可以直腸栓劑或合適的灌腸劑局部用于腸道下部。
本發明也包括局部透皮貼劑。
可以通過鼻氣霧劑或吸入方式給予本發明的藥用組合物。這些組合物按藥物制劑領域通曉的技術制備，也可以使用苯甲醇或其它合適的防腐劑、提高生物利用度的吸收促進劑、碳氟化合物和/或其它本領域通曉的增溶劑或分散劑制備成鹽溶液。
在用單一療法和/聯合療法預防和治療靶介導的疾病時，本文描述的靶抑制化合物的有效日劑量水平介于約0.01mg/kg體重和約100mg/kg體重之間，或者介于約0.5mg/kg體重和約75mg/kg體重之間。通常，本發明的藥用組合物日給藥次數是約1次至約6次，或者是連續輸注。這種給藥可用作慢性或急性治療。與載體物質混合在一起以生產單劑型的活性成分的用量將隨待治療患者和具體給藥方式而變化。典型的制劑含有約5％至約95％的活性化合物(w/w)。或者，這些制劑含有約20％至約80％的活性化合物。
正如技術人員將會認識到的，可能需要低于或高于上述記載的劑量。任一具體患者的準確劑量和治療方案將取決于諸多因素，包括所用具體化合物的活性、年齡、體重、一般健康狀態、性別、飲食、給藥時間、排泄率、藥物組合、疾病嚴重程度和病程、病癥或癥狀、對患者疾病的處置、病癥或癥狀以及治療醫師的判斷。
實施例實施例1篩選單體型靶酶以鑒定抑制多聚體酶活性的配體已知人誘導型一氧化氮合酶(iNOS)在炎癥中起重要作用，因此iNOS活性的抑制劑是發現抗炎藥物的候選藥物。iNOS酶必須是荷載輔因子的同型二聚體，以便每個多聚體能提供兩個功能活性部位，當缺乏一個所需輔因子四氫生物蝶呤(THB)時，已知該酶以低活性態存在，在無活性單體和活性二聚體之間找到平衡點(Ghosh等，Biochemistry，351444-9(1996))。因此，采用基于功能的篩選發現結合THB的高活性二聚體的抑制劑。然而對未結合THB的低活性態的iNOS的基于親和力的篩選獲得新的配體，該配體能與單體型iNOS結合并減弱二聚化。在生化和細胞兩種測定中，這些配體均作為iNOS的功能抑制劑，用放射性配體置換測定(用已知的單體特異性配體)，其IC50范圍介于30nM至30μM之間，用LPS-刺激RAW細胞測定，其EC50范圍介于100nM至50μM之間。
實施例2缺乏所需輔因子時篩選靶酶以鑒定抑制不依賴輔因子的酶活性的配體已知人肌苷一磷酸脫氫酶(IMPDH)在炎癥中起重要作用，因此IMPDH活性的抑制劑是發現抗炎藥物的侯選藥物。全活性時，IMPDH酶利用輔因子NAD+氧化底物IMP，得到產物黃苷一磷酸(XMP)和NADH。已知的IMPDH抑制劑如麥考酚酸(MPA)以依賴IMP和NAD的方式與IMPDH結合(Fleming等，Biochemistry，356990-7(1996))，因而當有IMP和NAD時，必須對IMPDH進行基于功能的篩選。然而。當有IMP但沒有NAD+時，對IMPDH的基于親和力的篩選獲得新的配體，該配體以依賴IMP而不依賴NAD的方式結合IMPDH。在生化測定中，這些配體用作IMPDH的功能抑制劑，隨后生成熒光NADH，其IC50范圍介于50nM至10μM之間，而在細胞測定例如PHA刺激抑制PBMC細胞增殖時，其EC50范圍介于500nM至50μM之間。
實施例3篩選基礎非活化型靶激酶以鑒定抑制酶活性的配體已知人激酶p38在炎癥中起重要作用，因此p38活性的抑制劑是發現抗炎藥物的侯選藥物(REF)。全活性時，基礎型p38激酶必須在氨基酸殘基Thr180和Tyr182被MKK6/MEK6磷酸化才被激活，Wilson等(J.Biol.Chem.，27127696-27700(1996))。p38的磷酸化將DFG環的優選平衡構象從低活性“DFG-向外”構象移向高活性“DFG-向內”構象(Knighton等，Science 253407-414(1997)，Yamaguchi等，Nature 384484-489(1996))。當有底物和ATP時，p38的基于功能的篩選就典型地利用了活化型p38以確保增強而且可靠的功能信息。然而，當沒有ATP和底物肽時，對基礎未磷酸化p38激酶的基于親和力的篩選獲得新的配體，該配體結合并穩定p38激酶的DFG-向外無活性構象。在生化測定中，這些配體用作p38高選擇性功能抑制劑，據報道，能將放射性標記ATP轉移到MAPKAPK-2底物肽，其IC50范圍介于50nM至10μM之間，而在THR.1全細胞測定中，據報道，抑制LPS-介導的THFα的釋放，其EC50范圍介于500nM至50μM之間。通過阻止活化(磷酸化)、阻止底物的結合和/或阻止ATP的結合，這些配體能夠機械地抑制活性。
實施例4缺乏所需蛋白伙伴時篩選靶酶以鑒定抑制酶活性的配體已知人細胞周期蛋白依賴性激酶2(CDK2)在癌細胞增殖中起重要作用，因此CDK2活性的抑制劑是發現抗癌藥物的候選藥物(Knockaert等，TIPS，23417-425(2002))。全活性時，基礎型CKD2激酶必定以1∶1化學計量與蛋白細胞周期蛋白伙伴結合(Knockaert等，TIPS，23417-425(2002))。兩種已知的與CDK2結合并形成活性CDK2-細胞周期蛋白復合物的細胞周期蛋白是細胞周期蛋白A和細胞周期蛋白E。細胞周期蛋白與CDK2的結合需要激酶活性，因此，當有底物肽和ATP時，對CDK2的基于功能的篩選必定利用細胞周期蛋白-CDK2復合物來獲取功能信息。然而，當沒有細胞周期蛋白也沒有ATP和底物肽時，對基礎未磷酸化CDK2的基于親和力的篩選獲得新的配體，該配體選擇性地與無細胞周期蛋白失活型CDK2結合。在使用癌細胞系的常規細胞增殖測定中，這些配體用作CDK2的功能抑制劑，其EC50范圍介于500nM至50μM之間。通過阻止細胞周期蛋白與CDK2的結合、阻止活化(磷酸化)、阻止底物的結合和/或阻止ATP的結合，這些配體能夠機械地抑制活性。
實施例5篩選無配體型靶NHR以鑒定抑制受體活性的配體已知人核激素受體(NHR)肝X受體β(LXRβ)在脂質體內平衡中起重要作用，因此LXRβ活性的調節劑是發現血脂異常和心血管藥物的候選藥物。全活性時作為轉錄激活因子，基礎型LXRβ必定以1∶1化學計量與小分子激動劑結合才被激活。24-羥基膽固醇是一種天然存在的LXRβ的小分子激動劑。(REFLehmann等，J.Biol.Chem，2723137-40(1997))。為了鑒定LXRβ的拮抗劑或反激動劑(inverseagonist)，當有激動劑時必須進行基于功能的篩選以獲得增強的功能信息。然而，當沒有24-羥基膽固醇時，對基礎無配體LXRβ的基于親和力的篩選獲得新的配體，該配體與無激動劑基礎型LXRβ結合。在全細胞報道細胞測定(其中LXRβ活性驅動標準蛋白報道分子例如螢光素酶的表達)和測量天然存在的LXRβ依賴性轉錄物的轉錄作用的全細胞測定中，這些配體用作LXRβ的反激動劑和拮抗劑，其EC50范圍介于50nM至50μM之間。通過穩定LXRβ的無活性構象(反激動作用)和通過阻止天然存在的激動劑與LXRβ結合(拮抗作用)，這些配體能夠機械地抑制活性。
實施例6篩選無配體型靶GPCR以鑒定抑制受體活性的配體已知人G蛋白偶聯受體(GPCR)m2毒蕈堿性乙酰膽堿受體(m2R)在心血管病程和精神分裂癥中起重要作用，因此m2R活性的調節劑是發現心血管和CNS疾病藥物的候選藥物(Brown，J.H. & P.Taylor(1996) Muscarinic Receptor Agonists and Agtagonists.ThePharmacological Basis of Therapeutics(Hardman，J.G.等編著)，第九版，New York，NYMcGraw-Hill)。全活性時，基礎型m2R必定因小分子激動劑的結合才被激活，而乙酰膽堿是一種天然存在的m2R的小分子激動劑(Ashkenazi，A. & E.G.Peralta(1994)Muscarinic AcetylcholineReceptors.Handbook of Receptors and Channels(S.J.Peroutka編著)，第1卷，Boca Raton，FLCRC Press)。為了鑒定m2R的拮抗劑或反激動劑，當有激動劑時必須進行基于功能的篩選以獲得增強的功能信息。然而，當沒有乙酰膽堿時，對基礎無配體型m2R的基于親和力的篩選獲得新的配體，該配體與無激動劑基礎型m2R結合。在測量細胞對添加的乙酰膽堿反應的全細胞測定中，這些配體用作m2R的反激動劑和拮抗劑，其EC50范圍介于100nM至50μM之間。通過穩定m2R的無活性構象(即反激動作用)和阻止天然存在的激動劑與m2R結合(即拮抗作用)，這些配體能夠機械地抑制活性。
實施例7篩選酶原型靶蛋白酶以鑒定抑制蛋白酶活性的配體在血液凝固過程中，蛋白酶活性的級聯啟動催化凝塊的形成。這些蛋白酶的抑制劑可以是抗凝藥。在該級聯中，一種蛋白酶通過酶促切割激活其“下游”蛋白酶，導致低活性酶原型下游蛋白酶轉變成完全活化型(Davie等，Biochemistry，3010363-10370(1991))。酶促切割通常會導致內部剪接或者從酶原釋放肽片段。采用基于功能的篩選蛋白酶解的高活性型凝固蛋白酶以發現抑制劑。然而，對低活性酶原型凝固蛋白酶的基于親和力的篩選可獲得新的配體，該配體與失活型蛋白酶結合。在凝血測定中，通過阻止蛋白水解的活化作用(例如經上游蛋白酶加工)或在酰胺水解顯色測定中阻止底物肽的結合(通過直接競爭或變構抑制)，這些配體能夠作為該蛋白酶的功能抑制劑。
實施例8篩選失活突變型靶蛋白酶以鑒定抑制蛋白酶活性的配體人蛋白酶因子VIIa(fVIIa)是血液凝固級聯的關鍵組分，因此fVIIa蛋白酶的抑制劑可以是抗凝藥。采用基于功能的篩選在含有可溶性組織因子(sTF)的復合物中發現了野生型高活性型fVIIa的抑制劑。然而，可以使用失活突變型fVIIa蛋白酶對fVIIa/sTF進行基于親和力的篩選。失活突變體阻止親和篩選過程的結合反應時的自動蛋白水解，但它仍然能夠呈現幾乎所有關鍵活性部位殘基與配體結合。對失活突變型fVIIa/sTF復合物的親和篩選獲得新的配體，該配體與失活型蛋白酶結合。在酰胺水解顯色測定中，這些配體用作野生型高活性蛋白酶的功能抑制劑，其IC50范圍介于1-50μM之間。
實施例9鑒定作為激酶抑制劑的配體本發明可適用于篩選未活化激酶的抑制劑。令人驚奇的是，與依賴于需要使用活化激酶的功能性生化信息的常規篩選方法不同，篩選未活化激酶提供了更多的選擇性抑制劑。活化型激酶主要以稱為DFG-向內構象存在，而未活化型激酶主要以DFG-向外構象存在。本發明也部分基于以下發現當DFG以DFG-向外構象存在時，在未活化型激酶中形成不同于ATP結合部位的變構結合口袋(例如凹口袋)，并且當這種變構結合口袋被結合(例如被配體結合，例如被抑制劑結合)時，間接阻止了ATP與激酶上ATP部位的結合。當沒有ATP和底物時，激酶未被活化，因而不能用基于活性的常規測定進行篩選，令人驚奇的發現是，激酶優先呈DFG-向外構象。由于變構結合部位的結構特征在結構上顯著不同于大多數ATP結合部位，因此通常發現該新的變構結合口袋(例如凹口袋)的結合劑是更具選擇性的激酶抑制劑。
本發明可適用于鑒定新的抑制劑結合部位、設計激酶抑制劑和包含這些抑制劑的組合物的方法。試驗激酶抑制劑的鑒定方法包括分別利用未活化參照激酶的三維結構，例如絲氨酸/蘇氨酸激酶或酪氨酸激酶，例如p38MAPK或與其抑制劑例如BIRB 796或STI-571或其變異體(即Gleevec或其變異體)結合的c-ab1。根據參照激酶DFG(例如Asp-Phe/Leu/W-Gly，例如DFG、DLG或DWG)的位置，可以對未活化試驗激酶的DFG基序進行定位(例如通過多重序列比對和/或將試驗激酶重疊在參照激酶的結構上)。參照激酶的一個實例是未活化胰島素激酶(1irk)。在1irk中，DFG基序對應于Asp1150-Phe1151-Gly1152。參照激酶的另一個實例是c-ab1。1fpu(與STI-571變異體結合的c-ab1的PDB檢索代碼)或1iep(與STI-571結合的c-ab1的PDB檢索代碼)的DFG基序包括Asp381-Phe382-Gly383。中間殘基苯丙氨酸有時可以是色氨酸(Trp，W)或亮氨酸(Leu，L)。因此，DFG基序的氨基酸序列可以是DFG、DWG或DLG。可以將試驗激酶(例如未活化試驗激酶)與參照激酶(例如未活化參照激酶)進行比對，因為在序列多重比對中，DFG的位置是已知的(例如與相應抑制劑BIRB796和STI-571變異體結合的p38MARK或c-ab1)，所以可以確定DFG基序在試驗激酶中的位置。例如采用CLUSTALW、FASTA或HMMER可以完成多重序列比對。
參照激酶(例如未活化參照激酶)的α-C螺旋可以用于給試驗激酶(例如未活化試驗激酶)的α-C螺旋定位。例如在1IRK中，包含Val1050-Met1051的α螺旋對應于α-C螺旋。在另一個實例中，1IEP的α-C螺旋包含Val289-Met290。由于α-C螺旋的位置是已知的(例如已經通過實驗確定了其三維結構)，因此序列的多重序列比對可以用來確定其它序列在其三維結構尚未經實驗確定的情況下α-C螺旋的位置。
一旦將DFG基序定位，就能確定DFG基序是否為向外構象(DFG-向外)。如果激酶為全活性狀態，則活化環通常發現呈外展式或開放式構象而DFG基序通常發現呈DFG-向內構象(Knighton等，Science253407-414(1997)，Yamaguchi等，Nature 384484-489(1996))。本文描述的新方法用于鑒定呈DFG-向外構象的DFG基序。為了確定試驗激酶的DFG基序是否為DFG-向外構象，就要測量試驗激酶的DFG基序和α-C螺旋間的距離。準確地說，要測量下述兩組原子間的最短距離1)DFG基序的Phe/Leu/Trp殘基(中央殘基)的非主鏈重原子和2)α-C螺旋的任何殘基中的α碳。距離大于或等于11而小于或等于20(例如11.0、11.2、11.4、11.6、11.8、11.9、12、13、14、15、16、17、18、19或20)限定DFG基序為DFG-向外構象。例如1iep代表與其抑制劑STI-571變異體結合的c-ab1。在1iep中，Phe的非主鏈重原子與其α-C螺旋α碳之間的最短距離測量值為11.9，因此1iep的DFG基序認定為DFG-向外。少有的情況是，參照激酶可發現呈DFG-向外構象但為活化狀態。由于DFG-向外構象仍然可以構成抑制劑能夠結合的變構口袋，因此使用DFG-向外構象的活化參照激酶仍然可以用于鑒定激酶抑制劑。
當DFG基序為DFG-向外位置時，它可誘導凹口袋(例如變構結合部位)的形成，其中凹口袋的表面部分由本文稱為X至Y的氨基酸構成。凹口袋(例如變構結合部位)，可以設計抑制劑與之結合，可以用比對法進行定位。在一個實施方案中，對激酶抑制劑結合(例如試驗激酶抑制劑結合)的凹口袋的定位可包括將試驗激酶氨基酸序列X至Y與一個或多個參照激酶(其中的一些見表1)序列X至Y進行比對。在另一個實施方案中，依據序列比對分析測定，X至Y可由蛋白質Leu104至Ala111組成，其PDB檢索代碼是1kv1(鏈A)(見下表1)。在另一個實施方案中，依據序列比對分析測定，參照激酶氨基酸X至Y可由蛋白質Leu104至Ala111組成，其PDB檢索代碼是1kv2(鏈A)。依據序列比對分析測定(例如用蛋白質序列比對的Smith-Waterman算法(例如參見Smith等，1981，J Mol Biol 147195-197和Pearson，1991，Genomics 11635-650)，試驗激酶氨基酸X至Y由與蛋白質Leu104至Ala111類似的氨基酸，其PDB檢索代碼是1kv1(鏈A)或1kv2(鏈A)；1iep(鏈A)、1iep(chain B)、1fpu(鏈A)或1fpu(鏈B)的Ile313至Asn322和/或1irk的Leu1073至Ala1080所組成。
“與……類似的氨基酸”，是指氨基酸殘基相似但不相同。因此，具有相似側鏈的氨基酸殘基可以說是類似的，本領域也這樣定義。這些相似性使氨基酸能在激酶的三維結構內“類似地”起作用(例如在近似的三維中與其它氨基酸的相互作用也相似)。這些家族包括帶堿性側鏈的氨基酸(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、帶酸性側鏈的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷的極性側鏈氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、帶非極性側鏈的氨基酸(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、帶β-分枝側鏈的氨基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和帶芳族側鏈的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此，例如，與賴氨酸類似的氨基酸是精氨酸或組氨酸。作為另一個例子，如本文所述天冬氨酸與谷氨酸類似。因此試驗激酶與參照激酶氨基酸序列X至Y(例如參見表1)進行比對(例如用蛋白質序列比對的Smith-Waterman算法)的區(包括空位(gap))，是部分構成DFG-向外構象的DFG所誘導的凹結合口袋的同源區。通過鑒定同源的試驗激酶氨基酸并因而鑒定DFG-向外誘導的試驗激酶凹口袋，可以鑒定出變構結合部位，進而可以設計與試驗激酶在該部位結合的抑制劑。在該同源位點內，一定存在某些在試驗激酶和參照激酶間類似的氨基酸。
一旦確定了未活化試驗激酶的“同源”氨基酸，它們就可用來設計具有正確拓撲結構(形狀)和電子性能來擬合變構結合部位(例如凹口袋)的支架。然后可以根據支架提供并合成文庫(例如質量-編碼文庫，參見美國專利第6,207861號和第6,147,344號)。當變構部位(例如當DFG基序為DFG-向外構象時存在的)占優勢(例如在沒有ATP和底物時試驗激酶為未活化狀態)的條件下，用未活化試驗激酶對文庫(例如所提供的質量-編碼文庫或所設計的質量編碼-文庫)進行親和篩選，因而能鑒定出變構配體(例如抑制劑)。
另一方面，在需要ATP位點結合劑的情況下，可以根據活化型試驗激酶對文庫(例如質量-編碼文庫)進行篩選。這樣，在試驗激酶為活化狀態而且有能力結合ATP和/或底物的條件下，進行文庫篩選。任選在有ATP和/或底物時進行篩選。一種情形是，可以提供文庫。另一種情形是，可以根據DFG-向外構象的試驗激酶所形成的變構部位的拓撲結構或電子性能設計文庫。無論何種情形，文庫成員都可以在合成后進行質量-編碼。
表1
*PDB檢索代碼因為常規篩選方法通常采用需要主要為DFG-向內構象的活化激酶的功能測定，這樣篩選所鑒定的抑制劑大體上都靶向ATP結合部位，因而是ATP競爭性的。以這種方式與抑制劑結合的激酶呈DFG-向內構象，這類抑制劑的缺點通常是選擇性降低，而副作用和毒性增加。設計激酶抑制劑或激酶結合劑的常用方法一直依賴于激酶呈激活狀態并具有DFG-向內構象。相反，本文描述的方法的優點在于能設計DFG-向外構象的未活化激酶的抑制劑，從而提供了具有更高選擇性的抑制劑。本文的方法能夠鑒定激酶抑制劑而不依賴呈激活狀態的激酶，如果需要，該方法也適用于呈激活狀態的激酶。
在DFG-向內構象中，中心殘基(Phe、Leu或Trp)全都埋在兩葉激酶之間的溝內的疏水口袋里(Frantz，2002，Nature Reviews 1253)。然而，當DFG基序為DFG-向外構象時，中心殘基(Phe、Leu或Trp)側鏈的一面有助于屏蔽抑制劑，而另一面向溶劑暴露。該中心殘基在結合二價離子時也同樣重要，大多數情況下，二價離子為激酶活性所需要。中心殘基協調天冬氨酸即DFG基序的第一個殘基的位置，該天冬氨酸是鎂(或錳)離子協調范圍的配體之一。該二價離子(鎂或錳)進而協調ATP的β和γ磷酸酯，因而支持ATP結合。值得注意的是，二價離子并不絕對需要DFG與ATP磷酸酯相互作用。這種構象露出激酶內的大疏水口袋，該疏水口袋空間上不同于結合ATP的口袋。當與這個大疏水口袋或變構點結合時，抑制劑鎖緊DFG-向外構象的DFG基序。這種構象中DFG的物理定位(例如DFG-向外)阻止ATP結合，隨之抑制激酶功能。
可以從化合物的混合物(例如小分子化合物文庫，例如質量-編碼組合文庫)中篩選(例如用計算建模或親和篩選)那些能結合試驗激酶(例如未活化試驗激酶，例如沒有ATP和/或底物時)的化合物。在一個實施方案中，當激酶的DFG為DFG-向外構象時，激酶內所形成的新變構結合部位(例如凹口袋)，可以根據其拓撲結構和靜電性能所決定的支架設計質量-編碼文庫。在另一個實施方案中，可以提供質量-編碼文庫并篩選抑制或調節激酶活性的激酶結合劑。在又一個實施方案中，可以用本發明的方法篩選各不相同的化合物，本發明的方法包括首先通過計算各化合物的分子量，然后將合適的化合物混合在一起，從而創建化合物的質量-編碼混合物。根據本文所述方法鑒定的變構部位(例如凹結合口袋)進行計算機建模，也可設計結合變構部位(例如凹口袋)的化合物，然后根據該信息合成潛在的結合劑。
美國專利第6,207,861號和第6,147,344號(參見上文)描述了篩選化合物文庫(例如根據擬合新變構結合部位的支架而設計的質量-編碼文庫)的有效方法，該方法也適用于本文描述的方法。這些方法可適用于根據變構部位或者根據靶向變構部位的支架設計化合物的混合物。
靶抑制劑的合成靶(例如激酶)抑制劑可用有機合成文獻中很好建立的方法(Gazit等，1989，J.Med.Chem.322344-2352；McKenna等，2002，J.Med.Chem.452173-2184；Levitzki，2002，Eur.J.Cancer 38，增刊5S11-8)進行合成。此外，化合物的混合物(包括質量-編碼文庫)的合成方法也有描述(Shipps等，1997，Proc.Natl.Acad.Sci USA 9411833-11838；Shipps等，1996，Bioorg.Med.Chem.4655-657；Makara等，2002，Org.Lett.41751-1754；Makara，2001，J.Org.Chem.665783-5789)。用于合成本文描述的抑制劑化合物的合成化學轉化和保護基方法(保護和脫保護)已為本領域所周知，包括例如在以下文獻中有描述R.Larock，Comprehensive Organic Transformations，VCH Publishers(1989)；T.W.Greene and P.G.M.Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，第二版，John Wiley and Sons(1991)；L. Fieser和M. Fieser，Fieser and Fieser′sReagents for Organic Synthesis，John Wiley and Sons(1994)；和L.Paquette編著.，Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis，JohnWiley and Sons(1995)，及其后續版本。
本文所述的抑制劑可含一個或多個不對稱中心，并因此呈外消旋體或外消旋混合物、單一對映體、單一非對映體和非對映體混合物。這些化合物的所有這些異構體明確地包括在本發明范圍之內。本文描述的抑制劑可用多重互變異構體代表，其全部均包含在本發明范圍之內。所述抑制劑也可呈順式或反式或E-或Z-雙鍵異構體。這些抑制劑的所有這些異構體都明確地包括在本發明范圍之內。
用ALIS(參見上文)等方法篩選化合物的混合物(例如化合物文庫，例如組合文庫，例如質量-編碼組合文庫)，可以鑒定并選出抑制劑，所述方法是一種親和篩選方法，能鑒定未活化狀態激酶的變構配體，例如，采用本領域已知的常規文庫篩選方法篩選化合物的混合物，也可以鑒定并選出抑制劑。
靶抑制測定可以對用上述方法選擇、鑒定或設計的潛在抑制劑進行測定，以確定其抑制試驗靶和/或取決于靶的信號轉導途徑的能力。所述測定可以是體外或是體內的。可用不同方法測定抑制作用，所述方法包括例如磷酸化測定法、閃爍親近測定法(Amersham)、DELFIA測定法(Perkin Elmer)或連續分光光度測定法以及細胞功能和腫瘤細胞測定法(Spencer-Fry，J.等，1997，Journal of Biomolecular Screening 2(1)25-32；Braunwalder等，1996，Anal.Biochem.238；159-64；Barker等，1995，Biochemistry 3414843-51)。
本領域已知的傳統方法也可用來確定激酶的抑制作用。這些方法包括將放射性標記ATP和底物加入到反應混合物中，該反應混合物由待抑制激酶、潛在抑制劑和提供類似于生理條件的組分組成。相對于對照，測量摻入到底物中的放射性標記磷酸，則能夠提供鑒定潛在抑制劑為確認的激酶抑制劑的信息。
對于所有潛在抑制劑和用本文描述的測定確認的抑制劑，對所述潛在抑制劑的結構進一步精修以改進親和力、抑制活性和/或體內特性總的來講是必需的。這可用藥物化學中所用的標準技術完成這一步，并且可以通過本文描述的抑制劑篩選測定所提供的任一和/或所有步驟的連續重復來進行。
靶抑制劑的用途通過本文描述的方法所發現的配體可用于抑制能活化的靶。例如，所述配體可以是G蛋白偶聯受體、磷酸酶、轉移酶、合酶、激酶、蛋白酶、核激素受體、二聚化受體、轉運蛋白、異構酶、聚合酶、蛋白-蛋白結構域、轉錄因子、水解酶和膜結合蛋白和酶的抑制劑。若靶在一定程度上與疾病相關，可以將用本文描述的方法發現的配體配制成藥用組合物，用于診斷和/治療哺乳動物例如人的疾病。這類疾病可包括癌癥、炎癥、神經障礙、肥胖癥、衰老、病毒感染、細菌感染以及與生物戰攻擊有關的疾病。
用本文描述的方法所發現的配體也可用于抑制任何包含其序列與靶序列有大于90％、或大于85％、或大于70％同源性的靶的生物活性。本文所述的抑制劑也可用于抑制其序列與激酶亞序列(包括本文提及的激酶的亞序列)有大于90％、或大于85％、或大于70％同源性的任何靶(例如酶，例如激酶)、包括任何靶(例如酶，例如激酶)的亞序列或其變異體的生物活性。這些亞序列優選包含其序列與酶(例如激酶)的活性部位或亞結構域有大于90％、或大于85％、或大于70％同源性的序列。這些亞序列或其變異體至少包含約250個氨基酸或至少包含約120個氨基酸。
激酶抑制劑的用途用本文描述的方法鑒定的抑制劑可用于抑制一種或多種酶的激酶活性。準確地說，本文所述的化合物可用作酪氨酸、絲氨酸/蘇氨酸、脂質或組氨酸激酶的抑制劑。本文所述的化合物和組合物所抑制的同時也適用本文所述的方法的激酶(例如試驗激酶)的實例包括但不限于絲氨酸激酶、蘇氨酸激酶、酪氨酸激酶和/或脂質激酶。能夠設計抑制劑的潛在試驗激酶的具體實例見表2。可以篩選這些激酶的基礎和活化兩種狀態。用本文所述的方法鑒定的抑制劑適用于治療包括一種或多種上述蛋白激酶在內的疾病或疾病癥狀。在一個實施方案中，用本文所述的方法鑒定的抑制劑特別適合抑制或治療由激酶介導的疾病或疾病癥狀。
本文所述的抑制劑也用于抑制任何包含其序列與激酶(包括本文所述的激酶)序列有大于90％、或大于85％、或大于70％同源性的酶(例如激酶)的生物活性。本文所述的抑制劑也用于抑制任何包含其序列與激酶亞序列(包含本文提及的激酶的亞序列)有大于90％，或大于85％，或大于70％同源性的酶(例如激酶)、包括所述激酶的亞序列或其變異體的生物活性。這些亞序列優選與酶(例如激酶)的活性部位或亞結構域有大于90％、或大于85％、或大于70％序列同源性的亞序列。這些亞序列或其變異體至少包含約250個氨基酸或至少包含約120個氨基酸。
本文所述的抑制劑可用于抑制激酶活性。因此，本發明的化合物、組合物和方法可用于治療哺乳動物(特別是人)的激酶介導的疾病或疾病癥狀。激酶介導的疾病是指蛋白激酶參與疾病過程中的信號轉導、介導、調節或調控的那些疾病。激酶介導的疾病的實例包括但不限于癌癥、炎癥、神經障礙和肥胖癥。
表2
本文所引用的全部文獻，無論是印刷版的、電子版的、計算機可讀的儲存媒介或其它形式，全都通過引用結合到本文中，其中包括但不限于文摘、論文、雜志、刊物、教科書、條約、因特網站、數據庫、軟件包、專利和專利刊物。業已描述了本發明的許多實施方案。不用說，在不偏離本發明的精神和范圍的情況下，可以對本發明進行各種修改。因此，其它實施方案都是在所附權利要求書和上文的發明概述的范圍之內。
權利要求
1.一種篩選針對未活化型靶部分的化合物的混合物的方法，所述方法包括a.提供化合物的混合物；b.將所述混合物與所述未活化型靶部分一起孵育以形成化合物靶復合物；c.使化合物靶復合物與未結合的化合物和靶分離；d.使化合物靶復合物解離；e.用質譜儀鑒定曾經與所述靶結合但現在已解離的化合物，其中經鑒定的化合物能與所述靶部分結合，其親和力Kd介于1pM和50μM之間。
2.一種篩選由針對不同型的靶部分的混合物的化合物組成的混合物的方法，所述方法包括a.提供化合物的混合物；b.提供配體-結合型靶部分和配體-游離型靶部分的混合物；c.將所述化合物的混合物與所述靶部分的混合物一起孵育以形成化合物靶復合物；d.使化合物靶復合物與未結合的化合物和靶部分分離；e.使化合物靶復合物解離；其中與所述靶分離的解離化合物稱為新配體；f從化合物靶復合物中存在的化合物中鑒定出結合任何型靶部分的新配體，即將化合物靶復合物通過質譜儀以鑒定結合任何型靶部分的配體，其中經鑒定的配體能與所述靶部分結合，其親和力Kd介于1pM和50μM之間；g.將步驟f中所鑒定的新配體與配體-結合型靶部分和配體-游離型靶部分一起孵育，其中重復步驟e至f以描繪出哪些化合物與配體-結合型靶部分結合，哪些化合物與配體-游離型靶部分結合。
3.權利要求1的方法，其中對所述化合物的混合物進行質量-編碼以確保至少90％的所述化合物具有獨特的可用質譜儀檢測的離子質量。
4.權利要求2的方法，其中對所述化合物的混合物進行質量-編碼以確保至少90％的所述化合物具有獨特的可用質譜儀檢測的離子質量。
5.權利要求2的方法，其中所述靶型的混合物包括未活化型、失活型和活化型。
6.權利要求2的方法，其中所述靶型的混合物包括單體型和多聚體型。
7.權利要求2的方法，其中所述靶型的混合物包括配體-結合型和配體-游離型。
8.權利要求2的方法，其中所述靶型的混合物包括輔因子-結合型和輔因子-游離型。
9.權利要求3或4的方法，其中所述靶型的混合物包括未活化型和活化型。
10.權利要求3或4的方法，其中所述靶型的混合物包括單體型和多聚體型。
11.權利要求3或4的方法，其中所述靶型的混合物包括配體-結合型和配體-游離型。
12.權利要求3或4的方法，其中所述靶型的混合物包括輔因子-結合型和輔因子-游離型。
13.一種發現試驗激酶抑制劑的方法，所述方法包括a)在沒有ATP和/或肽底物時，將所述試驗激酶與化合物的質量-編碼文庫一起孵育；b)使結合化合物與未結合化合物分離；c)用質譜儀鑒定所述結合化合物；d)用激酶抑制測定證明所述結合化合物的試驗激酶抑制活性。
14.權利要求13的方法，其中所述試驗激酶是全長激酶。
15.權利要求13的方法，其中所述試驗激酶包括含催化結構域的全長激酶的截短片段。
16.權利要求13的方法，其中所述激酶是激酶變異體或激酶突變體。
17.權利要求13的方法，其中采用大小排阻層析法使結合化合物與未結合化合物分離。
18.權利要求13的方法，其中通過與質量-編碼化合物的數據庫相比較來進行質譜法。
19.權利要求13的方法，其中所述試驗激酶是未活化的。
20.權利要求13的方法，其中所述試驗激酶呈表現出低催化活性的基礎型。
21.權利要求13的方法，其中所述試驗激酶是活化的。
22.權利要求14的方法，其中所述試驗激酶相對于其生理激活狀態是部分活化的。
23.一種設計抑制劑的方法，所述方法包括a)將未活化試驗激酶與已知其三維結構的未活化參照激酶進行比較；b)鑒定變構結合部位；c)根據所述變構結合部位設計抑制劑。
24.權利要求23的方法，其中步驟c)包括下述步驟c1)根據所述變構結合部位的拓撲性質和電子性能設計支架；c2)根據所述支架設計質量-編碼文庫。
25.權利要求23的方法，其中步驟c)包括提供質量-編碼文庫。
26.權利要求24的方法，所述方法還包括下述步驟d)從質量-編碼文庫中篩選結合所述試驗激酶的化合物；和e)確定激酶結合劑是否抑制所述試驗激酶，從而設計試驗激酶抑制劑。
27.權利要求25的方法，其中篩選包括用試驗激酶進行親和篩選。
28.權利要求23的方法，其中所述參照激酶選自具有以下蛋白質數據庫標識符的激酶1kv1鏈a和1kv2鏈a。
29.權利要求23的方法，其中所述參照選自具有以下蛋白質數據庫標識符的激酶1iep鏈a、1iep鏈b、1fpu鏈a和1fpu鏈b。
30.權利要求23的方法，其中所述參照激酶具有蛋白質數據庫標識符1irk。
31.權利要求23的方法，其中所述參照選自具有以下蛋白質數據庫標識符的激酶1g3n鏈a和1g3n鏈b。
32.權利要求23的方法，其中所述變構結合部位在空間上不同于ATP結合部位和活化環。
33.權利要求23的方法，其中所述變構結合部位通過定位DFG基序進行鑒定。
34.權利要求33的方法，其中所述DFG基序包括DWG序列或DLG序列。
35.權利要求33的方法，其中所述DFG基序與α-C螺旋的距離大于11而小于20，并且所述DFG基序是DFG-向外構象。
36.權利要求35的方法，其中所述α-C螺旋在相對的三維位置與含有Val1050-Met1051的胰島素受體激酶α-C螺旋同源。
37.權利要求35的方法，其中所述α-C螺旋在相對的三維位置與含Val289-Met290的c-ab1α-C螺旋同源。
38.權利要求23的方法，所述方法還包括確定潛在的結合劑是否抑制試驗激酶。
39.一種設計試驗激酶抑制劑的方法，所述方法包括a)將試驗激酶與已知其三維結構的參照激酶進行比較；b)鑒定變構結合部位；c)設計靶向變構結合部位的支架；d)根據支架提供化合物的混合物；e)通過對所述激酶進行親和篩選來鑒定變構部位的配體；f)在激酶測定中證明所述配體的激酶抑制活性。
40.權利權利39的方法，其中所述試驗激酶和參照激酶是未活化的。
41.權利要求39的方法，其中所述試驗激酶是全長激酶。
42.權利要求39的方法，其中所述試驗激酶包括含催化結構域的全長激酶的截短片段。
43.權利要求39的方法，其中所述試驗激酶呈表現出低催化活性的基礎型。
44.權利要求39的方法，其中所述試驗激酶是活化的。
45.權利要求39的方法，其中所述試驗激酶相對于其生理激活狀態是部分活化的。
46.權利要求39的方法，其中步驟c)包括根據變構結合部位的拓撲性質和電子性能設計支架。
47.權利要求39的方法，其中所述基于支架的化合物的混合物由潛在激酶配體的質量-編碼文庫組成。
48.權利要求39的方法，其中步驟e)包括下述步驟e1)將試驗激酶與質量-編碼文庫一起孵育以使所述文庫的配體與試驗激酶結合；e2)使結合激酶的配體與未結合配體分離；e3)使激酶與結合配體分離；e4)用質譜法鑒定所結合的化合物。
49.一種設計抑制劑的方法，所述方法包括a)將試驗激酶與已知其三維結構的參照激酶進行比較；b)鑒定變構結合部位；c)設計靶向變構結合部位的支架；d)根據支架提供化合物的混合物。
50.權利要求49的方法，所述方法還包括e)通過對所述激酶進行親和篩選來鑒定變構部位的配體。
51.權利要求50的方法，所述方法還包括f)證明激酶的抑制活性。
52.一種設計試驗激酶抑制劑的方法，所述方法包括a)用參照激酶的三維結構確定DFG基序在試驗激酶中的位置；b)通過DFG基序為DFG-向外構象來鑒定試驗激酶中所形成的變構結合部位，其中所述變構部位在空間上不同于ATP結合部位和活化環；c)根據變構結合部位設計支架；d)根據支架提供化合物的混合物；e)從化合物的混合物中篩選激酶結合劑；f)使激酶結合劑與非結合劑分離；g)用質譜法鑒定激酶結合劑；h)任選在條件和時間都充分容許結合劑與激酶結合的情況下，使所述結合劑與所述激酶接觸；e)證明所述結合劑使所述激酶變得無功能或者功能減弱；從而鑒定出試驗激酶的抑制劑。
53.一種設計試驗激酶抑制劑的方法，所述方法包括a)用參照激酶的三維結構確定DFG基序在試驗激酶中的位置；b)鑒定由DFG基序為DFG-向外構象所形成的變構結合部位，其中所述變構結合部位在空間上不同于ATP結合部位和活化環；c)根據變構結合部位設計支架；d)根據支架合成化合物的混合物；e)通過針對激酶親和篩選化合物的混合物來鑒定變構部位的配體；g)證明激酶的抑制活性。
54.權利要求41、42、49、52或53中任一項的方法，其中所述試驗激酶是未活化的。
55.權利要求39、49、52或53中任一項的方法，其中所述參照激酶選自具有以下蛋白質數據庫標識符的激酶1kv1鏈a和1kv2鏈a。
56.權利要求39、49、52或53中任一項的方法，其中所述參照激酶選自具有以下蛋白質數據庫標識符的激酶1iep鏈a、1iep鏈b、1fpu鏈a和1fpu鏈b。
57.權利要求39、49、52或53中任一項的方法，其中所述參照激酶具有蛋白質數據庫標識符1irk。
58.權利要求39、49、52或53中任一項的方法，其中所述參照激酶選自具有以下蛋白質數據庫標識符的激酶1g3n鏈a和1g3n鏈b。
59.權利要求39、49或52中任一項的方法，其中所述變構結合部位在空間上不同于ATP結合部位和活化環。
60.權利要求13、23、39、49、52或53中任一項的方法，其中所述試驗激酶是p38MAP激酶。
61.權利要求13、23、39、49、52或53中任一項的方法，其中所述試驗激酶是c-ab1。
62.一種鑒定試驗激酶抑制劑的方法，所述方法包括a)提供與試驗激酶結合而不與試驗激酶上的ATP結合部位物理結合的試驗化合物，其中當所述試驗激酶的DFG基序為DFG-向外位置時，所述試驗化合物與所存在的變構部位結合；b)確定ATP是否能與所述試驗激酶上的ATP結合部位結合，其中由于試驗化合物與試驗激酶的變構部位的結合而間接干擾了ATP與試驗激酶的結合，鑒定出試驗化合物為激酶抑制劑；c)任選在有或沒有結合試驗激酶的抑制劑時進行激酶測定，其中相對于沒有試驗化合物時的激酶活性，有試驗化合物時激酶活性降低，進一步證明試驗化合物就是試驗激酶的抑制劑。
63.一種鑒定試驗激酶抑制劑的方法，所述方法包括a)提供與試驗激酶結合而不與試驗激酶上的ATP結合部位物理結合的化合物；b)確定ATP是否能與試驗激酶上的ATP結合部位結合，其中由于試驗化合物與試驗激酶的結合而干擾了ATP與試驗激酶的結合，鑒定出試驗激酶的抑制劑，其中所述試驗化合物限定了試驗激酶的DFG基序為DFG-向外位置。
64.一種鑒定在空間上不同于ATP結合部位和活化環的變構結合部位的方法，所述方法包括a)將試驗激酶與已知其三維結構的參照激酶進行比較；b)根據DFG基序在參照激酶中的位置確定試驗激酶中DFG基序的位置；c)測量α-C螺旋中α碳殘基與試驗激酶DFG基序的苯丙氨酸、亮氨酸或色氨酸的非主鏈重原子間的最短距離，其中大于11而小于20的距離就是試驗激酶DFG基序為DFG-向外構象的特征；d)通過確定試驗激酶的氨基酸位置類似于參照激酶的氨基酸X至Y，鑒定部分構成由于DFG基序為DFG-向外構象所形成的凹口袋的氨基酸，其中通過對凹口袋的定位來鑒定變構結合部位。
65.一種根據試驗激酶抑制劑鑒定在空間上不同于ATP結合部位和活化環的變構結合部位的方法，所述方法包括a)通過將試驗激酶的三級結構與已知其三維結構的激酶的三級結構進行比較來確定DFG基序在試驗激酶中的位置；b)當DFG基序為DFG-向外位置時允許試驗化合物與變構部位結合；c)確定試驗化合物是否抑制試驗激酶的活性；d)確定試驗化合物是否在DFG基序為DFG-向外構象時所形成的變構部位結合試驗激酶，其中試驗化合物的結合致使DFG基序被限定為DFG-向外位置，從而鑒定出試驗激酶的變構結合部位。
66.權利要求33、52、53、64或65中任一項的方法，其中對DFG基序的定位包括多重序列比對。
67.權利要求65的方法，其中確定試驗化合物是否抑制試驗激酶的活性，包括激酶測定。
68.權利要求65的方法，其中確定試驗化合物是否在DFG基序為DFG-向外構象時所形成的變構部位結合試驗激酶，包括標記試驗化合物。
69.權利要求65的方法，其中確定試驗化合物是否在DFG基序為DFG-向外構象時所形成的變構部位結合試驗激酶，包括制備并分析與激酶結合的試驗化合物的X-射線晶體。
70.一種抑制劑，所述抑制劑為權利要求13、23、39、49、52、53、62或63中任一項的方法中的抑制劑。
71.權利要求70的抑制劑，其中所述抑制劑不是p38MAPK抑制劑、c-ab1抑制劑或胰島素受體激酶抑制劑。
72.權利要求70的抑制劑，其中所述抑制劑抑制p38MAPK。
73.權利要求70的抑制劑，其中所述抑制劑抑制c-ab1。
74.權利要求70的抑制劑，其中所述抑制劑抑制胰島素受體激酶。
75.一種藥用組合物，所述組合物包含權利要求63或64的抑制劑。
76.一種試劑盒，所述試劑盒包含權利要求70的任一抑制劑。
77.一種抑制患者體內激酶活性的方法，所述方法包括給予所述患者包含權利要求70的抑制劑的化合物的步驟。
78.權利要求77的方法，其中所述患者是哺乳動物。
79.權利要求78的方法，其中所述哺乳動物是人。
80.一種治療患者的激酶介導的疾病或疾病癥狀的方法，所述方法包括給予所述患者包含權利要求70的抑制劑的化合物。
81.權利要求80的方法，其中所述患者是哺乳動物。
82.權利要求81的方法，其中所述哺乳動物是人。
83.一種治療患者的疾病或疾病癥狀的方法，所述方法包括給予所述患者包含權利要求70的抑制劑的化合物的步驟。
84.權利要求83的方法，其中所述患者是哺乳動物。
85.權利要求84的方法，其中所述哺乳動物是人。
86.一種制備藥用組合物的方法，所述方法包括將權利要求70的抑制劑與一種或多種藥物可接受的載體混合。
87.權利要求70的抑制劑，其中還包括聯合應用其它治療藥。
88.權利要求13、23、39、42、44、49、52或53中任一項的方法，其中DFG基序為DFG-向外位置時誘導形成凹口袋，其中所述凹口袋的表面部分由氨基酸X至Y所構成，其中X是部分構成凹口袋的連續氨基酸序列中的第一個氨基酸，Y是部分構成凹口袋的連續氨基酸序列中的最后一個氨基酸。
89.權利要求88的方法，其中氨基酸X至Y由PDB檢索代碼為1kv2的蛋白質的Leu104至Ala111所組成。
90.權利要求88的方法，其中氨基酸X至Y由與PDB檢索代碼為1kv2的蛋白質的Leu104至Ala111同源的氨基酸所組成，該同源性依據序列比對分析確定。
全文摘要
描述了靶(例如生物分子)的通用篩選系統。這種篩選可用來發現許多化合物，這些化合物能與天然存在的低活性或無活性狀態靶結合并且可作為靶功能抑制劑，如同在后續生物測定中所見到的一樣。
文檔編號C12N15/09GK1791671SQ200480013273
公開日2006年6月21日 申請日期2004年3月22日 優先權日2003年3月21日
發明者H·M·納什, K·馬森, C·莫亞萊米, E·溫特納, D·弗林, M·凱利, S·亞當斯, Z·鄭, G·馬卡拉 申請人:先靈公司