專利名稱：一種生產普魯蘭的方法
技術領域：
本發明涉及一種生產普魯蘭的方法。
背景技術：
在化學工業、食品工業和醫藥工業中，長期以來渴望得到能被土壤微生物分解、燃燒后不產生高溫或有毒氣體的無公害塑料，對溫度差幾乎無物性變化、不易透過氧氣的可食用薄膜，耐酸堿的高強度粘合劑以及對環境體有益、并可用以生產有價值工業品的天然原料，與這些要求相適應的是多糖普魯蘭。普魯蘭是一種新型的高分子生物材料，具有極好的成膜、成纖維、阻氣、粘接、易加工、無毒性等特性，已廣泛應用于食品、醫藥、輕工、化工和石油等領域。
目前大多數普魯蘭產生菌同時產生暗綠乃至黑色色素，這些色素即使在后提取工藝中采用各種提取脫色的特殊手段都無法祛除，生產的普魯蘭為黑色或色素很深；另外，部分菌株得率低、生產成本高，無法工業化生產。
發明內容
本發明針對現有生產普魯蘭的方法產生的普魯蘭為黑色或色素很深并且得率普遍不高的問題，提出一種生產普魯蘭的方法，通過培育高產率低色素的生產菌株、配制合適的培養基及選擇合適的生產工藝，實現淺色普魯蘭的工業化生產。
本發明所提供的生產普魯蘭的方法包括以下步驟(1)菌種的選育以出芽短梗霉為出發菌株進行紫外線、亞硝基胍(NTG)誘變，從大量的誘變菌株中篩選分泌黑色素較少而且轉化率較高的誘變菌株；(2)培養基的配制種子培養基各組分及其重量百分比為氨水0.018～0.022％，K2HPO40.2～0.45％，MgSO40.015～0.023％，NaCl0.09～0.11％，酵母膏0.13～0.15％，其余為DE值(DE值是指溶液中所含的糖相當葡萄糖的重量百分比，即相當葡萄糖值)48～55的玉米粉液化液、葡萄糖溶液或麥芽糖溶液，PH值為6.0～7.0；發酵培養基各組分及其重量百分比為氨水0.018～0.045％，K2HPO40.2～0.55％，MgSO40.015～0.045％，NaCl 0.09～0.12％，酵母膏0.12～0.16％，其余為DE值48～55的玉米粉液化液、葡萄糖溶液或麥芽糖溶液，PH值為6.0～7.0；(3)種子培養將步驟(1)得到的菌種于30～33℃下進行培養，然后接種于已滅菌冷卻的種子培養基進行培養，得到種子液；(4)發酵將滅菌冷卻后的發酵培養基與步驟(3)得到的種子液一同加入發酵罐中，接種量(接種量是種子液與發酵培養基的重量比)為1.5～5％，進行發酵，得到發酵液；(5)提取從發酵液中將普魯蘭提取出來，可采用傳統的分離技術，比如先將發酵液稀釋，再高速離心除去菌體，然后脫色、濃縮、干燥、粉碎，得到成品普魯蘭。
所述菌株的選育包括以下步驟(1)孢子懸浮液的制備將出發菌株在麥芽汁斜面上30℃培養3～4天，培養后用生理鹽水將孢子洗下，接到營養較豐富的培養基中，振蕩4～5 h使孢子活化萌芽；離心分離，用pH 60 tris緩沖液沖洗一次，再用同樣的緩沖液從離心管中洗出，轉到小三角瓶中，用玻璃珠振蕩打散，然后通過一層宣紙或脫脂棉過濾，制成單孢子懸浮液，用血球計數板計數后，將孢子濃度調整到107/ml；(2)紫外線誘變誘變處理時取5ml孢子懸浮液放于直徑6cm的培養皿中，放入無菌攪拌鐵芯，液層厚度為2mm；處理前先開燈預熱20～30分鐘，穩定后啟動電磁攪拌皿，使菌懸液接受紫外線照射均勻，啟開培養皿蓋，10分鐘后立即蓋上皿蓋，取出處理箱，在紅光下涂布培養皿平板，用黑布包裹平板，進行振蕩培養；(3)亞硝基胍處理將上述紫外線誘變菌株孢子懸浮液與濃度為2mg/ml的亞硝基胍溶液按1∶4混合，在26～28℃下作用2～3h，處理后離心分離，并反復用生理鹽水洗滌離心10次以上，最后用生理鹽水恢復到原有體積之后稀釋104倍，取0.1ml涂平板培養；(4)篩選亞硝基胍處理之后進行平板培養，反復分離篩選，即得所要求的菌株；(5)保藏將分離出的菌株接種在斜面培養基上生長完全后，置于4℃左右冰箱中保藏，保藏環境濕度在50～70％以下，每4～6個月移植一次。
所述tris緩沖液的配置方法是取三羥甲基氨基甲烷(簡稱tris)6.1克，加蘋果酸5.8克，溶于980ml水中，用1mol/l NaOH調節pH至6.0，再定容至1000ml。
所述玉米粉液化液的制備方法是，將玉米粉添加水和淀粉酶進行液化，將其中的糖類物質溶解于液化液中，分離出液化液中的固體成分，即得到玉米粉液化液。
所述發酵培養基的PH值優選為為7.0。
所述種子培養可在30～33℃罐壓0.5kg/cm2下進行，攪拌并通入無菌空氣，攪拌速度400～600r/min，通氣量1.5～3L/min，培養36～42小時。
所述發酵可在溫度29～33℃下進行，攪拌并通入無菌空氣，攪拌速度400～600r/min，通氣量3～6L/min，發酵時間為72～86小時。
本發明以出芽短梗霉為出發菌株進行紫外線、亞硝基胍(NTG)誘變并篩選出的低色素且轉化率較高的誘變菌株，在含有玉米淀粉、葡萄糖或麥芽糖的發酵培養基上進行發酵生產普魯蘭，多糖轉化率達60～70g/L，普魯蘭多糖收率可達60～70％，得到的普魯蘭為白色或淡黃色。
具體實施例方式
實施例1本生產普魯蘭的方法包括以下步驟(1)菌種的選育以出芽短梗霉為出發菌株進行紫外線、亞硝基胍(NTG)誘變，從大量的誘變菌株中篩選分泌黑色素較少而且轉化率較高的誘變菌株并保存(具體的步驟如上文所述)；(2)培養基的配制將玉米粉添加水和淀粉酶進行液化，將其中的糖類物質溶解于液化液中，分離出液化液中的固體成分，得到的玉米粉液化液用于配制種子培養基和發酵培養基；每千克種子培養基中含有氨水0.21克，K2HPO44.0克，MgSO40.19克，NaCl 1.05克，酵母膏1.49克，其余為DE值50的玉米粉液化液，PH值為6.0，采用H2SO4、Ca(OH)2作為酸度調節劑；每千克發酵培養基中含有氨水0.41克，K2HPO45.05克，MgSO40.39克，NaCl 1.09克，酵母膏1.45克，其余為DE值50的玉米粉液化液，PH值為7.0，采用H2SO4、Ca(OH)2作為酸度調節劑；(3)種子培養將步驟(1)得到的菌種于30℃下培養72小時，然后接種于已滅菌冷卻的種子培養基，在30℃罐壓0.5kg/cm2下，攪拌并通入無菌空氣，攪拌速度600r/min，通氣量1.5L/min，培養36小時，得到種子液；(4)發酵將滅菌冷卻后的發酵培養基與步驟(3)得到的種子液一同加入50噸發酵罐中，發酵灌裝液量40噸，接種量為2％，溫度30℃，攪拌并通入無菌空氣，攪拌速度400r/min，通氣量3L/min，發酵時間為86小時，得到發酵液；(5)提取從發酵液中將普魯蘭提取出來，可采用傳統的分離技術，先將發酵液稀釋，再高速離心除去菌體，然后脫色、濃縮、干燥、粉碎，得到成品普魯蘭。
實施例2本生產普魯蘭的方法包括以下步驟(1)菌種的選育以出芽短梗霉為出發菌株進行紫外線、亞硝基胍(NTG)誘變，從大量的誘變菌株中篩選分泌黑色素較少而且轉化率較高的誘變菌株并保存(具體的步驟如上文所述)；(2)培養基的配制將葡萄糖制成溶液，用于配制種子培養基和發酵培養基；每千克種子培養基中含有氨水0.20克，K2HPO44.1克，MgSO40.21克，NaCl 1.01克，酵母膏1.49克，其余為DE值52的葡萄糖溶液，PH值為6.0，采用H2SO4、Ca(OH)2作為酸度調節劑；每千克發酵培養基中含有氨水0.41克，K2HPO44.05克，MgSO40.41克，NaCl 1克，酵母膏1.41克，其余為DE值52的葡萄糖溶液，PH值為7.0，采用H2SO4、Ca(OH)2作為酸度調節劑；(3)種子培養將步驟(1)得到的菌種于31℃下培養72小時，然后接種于已滅菌冷卻的種子培養基，在31℃罐壓0.5kg/cm2下，攪拌并通入無菌空氣，攪拌速度500r/min，通氣量2.5L/min，培養38小時，得到種子液；(4)發酵將滅菌冷卻后的發酵培養基與步驟(3)得到的種子液一同加入50噸發酵罐中，發酵灌裝液量40噸，接種量為3％，溫度30℃，攪拌并通入無菌空氣，攪拌速度400r/min，通氣量3L/min，發酵時間為80小時，得到發酵液；(5)提取從發酵液中將普魯蘭提取出來，可采用傳統的分離技術，先將發酵液稀釋，再高速離心除去菌體，然后脫色、濃縮、干燥、粉碎，得到成品普魯蘭。
實施例3本生產普魯蘭的方法包括以下步驟(1)菌種的選育以出芽短梗霉為出發菌株進行紫外線、亞硝基胍(NTG)誘變，從大量的誘變菌株中篩選分泌黑色素較少而且轉化率較高的誘變菌株并保存(具體的步驟如上文所述)；(2)培養基的配制將玉米粉添加水和淀粉酶進行液化，將其中的糖類物質溶解于液化液中，分離出液化液中的固體成分，得到的玉米粉液化液用于配制種子培養基和發酵培養基；每千克種子培養基中含有氨水0.19克，K2HPO42.5克，MgSO40.16克，NaCl 0.95克，酵母膏1.36克，其余為DE值49的玉米粉液化液，PH值為6.3，采用H2SO4、Ca(OH)2作為酸度調節劑；每千克發酵培養基中含有氨水0.25克，K2HPO43.20克，MgSO40.22克，NaCl 0.95克，酵母膏1.25克，其余為DE值49的玉米粉液化液，PH值為6.8，采用H2SO4、Ca(OH)2作為酸度調節劑；(3)種子培養將步驟(1)得到的菌種于30℃下培養75小時，然后接種于已滅菌冷卻的種子培養基，在30℃罐壓0.5kg/cm2下，攪拌并通入無菌空氣，攪拌速度450r/min，通氣量2L/min，培養40小時，得到種子液；(4)發酵將滅菌冷卻后的發酵培養基與步驟(3)得到的種子液一同加入50噸發酵罐中，發酵灌裝液量40噸，接種量為4％，溫度30℃，攪拌并通入無菌空氣，攪拌速度550r/min，通氣量5L/min，發酵時間為76小時，得到發酵液；(5)提取從發酵液中將普魯蘭提取出來，可采用傳統的分離技術，先將發酵液稀釋，再高速離心除去菌體，然后脫色、濃縮、干燥、粉碎，得到成品普魯蘭。
權利要求
1.一種生產普魯蘭的方法，其特征是包括以下步驟(1)菌種的選育以出芽短梗霉為出發菌株進行紫外線、亞硝基胍誘變，從大量的誘變菌株中篩選分泌黑色素較少而且轉化率較高的誘變菌株；(2)培養基的配制種子培養基各組分及其重量百分比為氨水0.018～0.022％，K2HPO40.2～0.45％，MgSO40.015～0.023％，NaCl 0.09～0.11％，酵母膏0.13～0.15％，其余為DE值48～55的玉米粉液化液、葡萄糖溶液或麥芽糖溶液， PH值為6.0～7.0；發酵培養基各組分及其重量百分比為氨水0.018～0.045％，K2HPO40.2～0.55％，MgSO40.015～0.045％，NaCl 0.09～0.12％，酵母膏0.12～0.16％，其余為DE值48～55的玉米粉液化液、葡萄糖溶液或麥芽糖溶液，PH值為6.0～7.0；(3)種子培養將步驟(1)得到的菌種于30～33℃下進行培養，然后接種于已滅菌冷卻的種子培養基進行培養，得到種子液；(4)發酵將滅菌冷卻后的發酵培養基與步驟(3)得到的種子液一同加入發酵罐中，接種量為1.5～5％，進行發酵，得到發酵液；(5)提取從發酵液中將普魯蘭提取出來。
2.根據權利要求1所述的生產普魯蘭的方法，其特征是所述菌株的選育包括以下步驟(1)孢子懸浮液的制備將出發菌株在麥芽汁斜面上30℃培養3～4天，培養后用生理鹽水將孢子洗下，接到營養較豐富的培養基中，振蕩4～5h使孢子活化萌芽；離心分離，用pH 60 tris緩沖液沖洗一次，再用同樣的緩沖液從離心管中洗出，轉到小三角瓶中，用玻璃珠振蕩打散，然后通過一層宣紙或脫脂棉過濾，制成單孢子懸浮液，用血球計數板計數后，將孢子濃度調整到107/ml；(2)紫外線誘變誘變處理時取5ml孢子懸浮液放于直徑6cm的培養皿中，放入無菌攪拌鐵芯，液層厚度為2mm；處理前先開燈預熱20～30分鐘，穩定后啟動電磁攪拌皿，使菌懸液接受紫外線照射均勻，啟開培養皿蓋，10分鐘后立即蓋上皿蓋，取出處理箱，在紅光下涂布培養皿平板，用黑布包裹平板，進行振蕩培養；(3)亞硝基胍處理將上述紫外線誘變菌株孢子懸浮液與濃度為2mg/ml的亞硝基胍溶液按1∶4混合，在26～28℃下作用2～3h，處理后離心分離，并反復用生理鹽水洗滌離心10次以上，最后用生理鹽水恢復到原有體積之后稀釋104倍，取0.1ml涂平板培養；(4)篩選亞硝基胍處理之后進行平板培養，反復分離篩選，即得所要的菌株；(5)保藏將分離出的菌株接種在斜面培養基上生長完全后，置于4℃左右冰箱中保藏，保藏環境濕度在50～70％以下，每4～6個月移植一次。
3.根據權利要求2所述的生產普魯蘭的方法，其特征是所述tris緩沖液的配置方法是取三羥甲基氨基甲烷6.1克，加蘋果酸5.8克，溶于980ml水中，用1mol/l NaOH調節pH至6.0，再定容至1000ml。
4.根據權利要求1所述的生產普魯蘭的方法，其特征是所述玉米粉液化液的制備方法是，將玉米粉添加水和淀粉酶進行液化，將其中的糖類物質溶解于液化液中，分離出液化液中的固體成分，即得到玉米粉液化液。
5.根據權利要求1所述的生產普魯蘭的方法，其特征是所述發酵培養基的PH值為7.0。
6.根據權利要求1所述的生產普魯蘭的方法，其特征是所述種子培養在30～33℃罐壓0.5kg/cm2下進行，攪拌并通入無菌空氣，攪拌速度400～600r/min，通氣量1.5～3L/min，培養36～42小時。
7.根據權利要求1所述的生產普魯蘭的方法，其特征是所述發酵在溫度29～33℃下進行，攪拌并通入無菌空氣，攪拌速度400～600r/min，通氣量3～6L/min，發酵時間為72～86小時。
全文摘要
一種生產普魯蘭的方法，包括以下步驟(1)菌種的選育以出芽短梗霉為出發菌株進行紫外線、亞硝基胍(NTG)誘變，從大量的誘變菌株中篩選分泌黑色素較少而且轉化率較高的誘變菌株；(2)種子培養基和發酵培養基的配制；(3)種子培養將步驟(1)得到的菌種于30～33℃下進行培養，然后接種于已滅菌冷卻的種子培養基進行培養，得到種子液；(4)發酵將滅菌冷卻后的發酵培養基與步驟(3)得到的種子液一同加入發酵罐中，接種量為1.5～5％，進行發酵，得到發酵液；(5)從發酵液中將普魯蘭提取出來得到成品普魯蘭。本發明多糖轉化率達60～70g/L，普魯蘭多糖收率可達60～70％，得到的普魯蘭為白色或淡黃色。
文檔編號C12P19/00GK1654482SQ200510008439
公開日2005年8月17日 申請日期2005年2月21日 優先權日2005年2月21日
發明者余少華, 喻敏, 林玉惠, 楊漢彬, 劉謀泉, 鄭華豐, 黃鶴, 楊志軍, 周曉娜, 陳遠志, 李慧 申請人:汕頭市富味制果廠有限公司