專利名稱：中國林蛙輸卵管分泌細胞體外培養方法
技術領域：
本發明屬于一種經濟動物的輸卵管分泌細胞培養方法，尤其是針對該種細胞的體外培養。
背景技術：
中國林蛙(Rana chensinensis David)俗稱“哈士蟆”，是一種重要的藥用兩棲類經濟動物，廣泛分布于東北長白山脈及小興安嶺等地區，雌蛙的輸卵管干制品即是聞名遐邇的“哈什螞油”，是名貴的食療性中藥，內含多種飽和脂肪酸、氨基酸、維生素和微量元素，具有養陰潤肺，補腎益精，健腦抗疲勞等功效。近些年來，由于大量捕捉，中國林蛙的資源遭到嚴重破壞，并且以其作為藥用原料的需要也供不應求，不能滿足及國內外市場的要求。
發明內容
本發明提供一種中國林蛙輸卵管分泌細胞體外培養方法，以解決目前為了取得雌蛙的輸卵管干制品，而使中國林蛙的資源遭到嚴重破壞的問題。本發明采取的技術方案是一、輸卵管分泌細胞的培養基的制備通過試驗篩選到適合中國林蛙輸卵管分泌細胞的基礎培養基有DMEM/Ham’sF12、F10/DMEM、RPMI1640，將上述培養基每份溶于1000ml四餾水中，再補加抗生素其中青霉素10萬單位/L、鏈霉素100mg/L，培養基用0.22μm濾膜濾過除菌，調整pH為7.4-7.6備用；條件培養基，包括作為營養物質的血清和添加的促生長類激素，其中新生牛血清為每100mL基礎培養基中加入5～15ml，胰島素為5～10mg/L基礎培養基；10-6mol/L的雌二醇為5～10μl/ml基礎培養基；二、輸卵管分泌原代細胞的獲取無菌采取輸卵管，采用直接剪切法解離細胞，從而減小對細胞的損傷程度且為體外存活提供更好的前提條件；本發明采用直接剪切法的一重要實施方式案是用解剖針破壞腦脊髓處死林蛙，在無菌環境中，剪下中國林蛙雌性的排卵前期輸卵管壺腹部至于滅菌的小平皿中，用含青鏈霉素的D-Hank’s液漂輸卵管2～3次，洗去血污后分離、剪去周圍粘連組織，于平皿中將輸卵管縱向剪開，把剪開的輸卵管進一步剪碎，經紗網濾過后800r/min離心10分鐘，棄上清，沉淀部分再用基礎培養液漂洗、離心細胞2次，棄上清液獲得林蛙輸卵管分泌原代細胞；三、輸卵管分泌原代細胞的培養將獲取得原代細胞加入含15％血清培養液制成細胞懸液，經臺盼藍染色行細胞計數，調整細胞濃度為2×105～5×105個/ml接種于6孔培養皿中，每孔加入細胞懸液3ml，放入37℃、5％CO2的培養箱中培養。每3～4天換一次培養液。
四、輸卵管分泌細胞的傳代培養待原代細胞長滿單層后，即可進行傳代，吸去培養皿中原培養液，用基礎培養液洗滌細胞1-2次，洗去殘留的血清成分。加0.125％-0.25％胰蛋白酶2ml，放入37℃溫箱中消化5-10分鐘，倒置顯微鏡下觀察貼壁細胞收縮變圓即可吸去消化酶液，加入含15％血清終止液終止消化，棄終止液，加入基礎培養液，吹打制成細胞懸液，調節細胞數為105～2×105個/ml接種于新培養皿中。根據細胞生長情況每2-3天換液，換液時注意留下1/4原培養液，完成一次傳代。
通過試驗確定林蛙輸卵管分泌細胞的的傳代培養宜在3-4代。
本發明的有益效果是針對中國林蛙輸卵管的特殊藥用價值和廣泛的應用前景，本發明對中國林蛙的輸卵管分泌細胞，進行原代與傳代培養，并對其形態及生長增殖能力等生物學特性研究，成功地摸索出輸卵管分泌細胞體外培養技術，為今后進一步研究林蛙輸卵管分泌細胞的生長、分化代謝，各種激素、細胞因子對其作用提供理想的實驗模型，為今后利用細胞工程技術生產林蛙輸卵管分泌物質奠定基礎。通過本發明尋找出適合林蛙輸卵管分泌細胞的分離方法，將細胞從組織中分離出來；選擇了適合林蛙輸卵管分泌細胞的培養基用于培養，并摸索出一些營養物質的添加條件，確定了林蛙輸卵管分泌細胞體外培養的條件培養基；實現了林蛙輸卵管分泌細胞的體外的原代培養和傳代培養，并采用免疫組化等方法對所得的細胞進行鑒定。
本發明的有益效果還包括，利用細胞工程等生物技術方法，在體外培養具有獨特生物功能林蛙輸卵管分泌細胞，為將來大量并獲得“人工哈什螞油”奠定技術基礎，是為了更好地開發、應用及保護中國林蛙的天然資源，為保護生態平衡起促進作用
圖1是林蛙輸卵管分泌細胞的原代細胞照片，剛解離狀態10×10。
圖2是林蛙輸卵管分泌細胞的原代細胞照片，培養24小時后狀態10×10。
圖3是林蛙輸卵管分泌細胞的原代細胞照片，剛解離狀態25×10。
圖4是林蛙輸卵管分泌細胞的原代細胞照片，培養24小時后狀態25×10。
圖5是林蛙輸卵管分泌細胞的傳代細胞照片，培養24小時后狀態10×10。
圖6是林蛙輸卵管分泌細胞的免疫組化照片，胞漿著棕黃色、胞核著深藍色10×10。
具體實施例方式
實施例1材料與儀器實驗動物選用體重為0.1-0.15kg，產卵前的雌性中國林蛙，作為輸卵管分泌細胞供體。
試劑胰蛋白酶(1∶250)、D-Hank’s、RPMI1640培養基購自美國Gibco公司；新生牛血清(NBS)、臺盼藍為Sigma公司產品，青、鏈霉素等為國產常規試劑。
儀器MCO-17AI型CO2培養箱(日本，SANYO公司)；CQIC型倒置顯微鏡(重慶光學儀器廠)；SW-CJ-IF型超凈工作臺；細胞培養板(丹麥NUCO公司)。
一.林蛙輸卵管分泌細胞培養基的配制將一份標準包裝的RPMI1640培養基定溶于1000ml四餾水中，再補加抗生素，其中青霉素10萬單位/L、鏈霉素100mg/L。充分混勻后培養基調整pH為7.4，用0.22μm濾膜濾過除菌后備用，林蛙輸卵管分泌細胞條件培養液的配制在以RPMI-1640為基礎培養液，添加該體積5％小牛血清、胰島素5mg/L、濃度為10-6mol/L的雌二醇10μl/ml組成條件培養液。
二.林蛙輸卵管分泌原代細胞的獲取用解剖針破壞腦脊髓處死林蛙，蛙體用75％酒精浸泡在無菌環境中，剖腹取出輸卵管，切取中間粗大盤曲較多的壺腹部，切除后立刻投入盛有100IU/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的低溫D-hanks液中，漂洗輸卵管2～3次，洗去血污后于平皿中將輸卵管縱向剪開，把剪開的輸卵管進一步剪碎，加入基礎培養基反復吹洗組織碎塊，吸取洗滌后的基礎培養基，經紗網濾過后，1000r/min離心10分鐘，棄上清，沉淀部分再用基礎培養基漂洗、離心細胞2次，獲得林蛙輸卵管分泌原代細胞。(見圖1)三.林蛙輸卵管分泌原代細胞的培養將獲取得原代細胞加入含15％血清培養液制成細胞懸液。經臺盼藍染色行細胞計數，調整細胞濃度為2×105個/ml接種于6孔培養皿(丹麥產Nunc)中，每孔加入細胞懸液3ml，放入37℃、5％CO2的培養箱中培養。每3～4天換一次培養液(見圖2)。一直培養不進行傳代，原代細胞能夠存活20天左右。
四.林蛙輸卵管分泌細胞的傳代培養待原代細胞長成單層后，即進行傳代。吸去培養皿中原培養液，用基礎培養基洗滌細胞1次，洗去殘留的血清成分，每孔加0.125％胰蛋白酶2ml，放入37℃溫箱中消化10分鐘，倒置顯微鏡下觀察貼壁細胞收縮變圓即吸去消化酶液，加入含15％血清基礎培養液2分鐘終止消化，棄培養液，加入基礎培養液，吹打制成細胞懸液，調節細胞數為2×105個/ml接種于新培養皿中，完成一次傳代過程，傳代培養共進行3代。
實施例2材料與儀器實驗動物選用體重為0.1-0.15kg，產卵前的雌性中國林蛙，作為輸卵管分泌細胞供體。
試劑乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、D-Hank’s、DMEM/Ham’sF12培養基購自美國Gibco公司；新生牛血清(NBS)、臺盼藍為Sigma公司產品，青、鏈霉素等為國產常規試劑。
儀器MCO-17AI型CO2培養箱(日本，SANYO公司)；CQIC型倒置顯微鏡(重慶光學儀器廠)；SW-CJ-IF型超凈工作臺；細胞培養板(丹麥NUCO公司)。
一.林蛙輸卵管分泌細胞培養基的配制將一份標準包裝的DMEM/Ham’sF12培養基定溶于1000ml四餾水中，再補加抗生素，其中青霉素10萬單位/L、鏈霉素100mg/L。充分混勻后培養基調整pH為7.5，用0.22μm濾膜濾過除菌后備用。
林蛙輸卵管分泌細胞條件培養液的配制在以DMEM/Ham’sF12為基礎培養液，添加其體積10％小牛血清、胰島素8mg/L、濃度為10-6mol/L的雌二醇7μl/ml組成條件培養液。
二.林蛙輸卵管分泌原代細胞的獲取用解剖針破壞腦脊髓處死林蛙，蛙體用75％酒精浸泡在無菌環境中，剖腹取出輸卵管，切取中間粗大盤曲較多的壺腹部，立刻投入盛有100IU/ml青霉素100μg/ml鏈霉素的低溫D-hanks液中，漂洗輸卵管2～3次，洗去血污后于平皿中將輸卵管縱向剪開，把剪開的輸卵管進一步剪碎，加入基礎培養基反復吹洗組織碎塊，吸取洗滌后的基礎培養基，經紗網濾過后，1100r/min離心10分鐘，棄上清，沉淀部分再用基礎培養基漂洗、離心細胞2次，獲得林蛙輸卵管分泌原代細胞。
三.林蛙輸卵管分泌原代細胞的培養將獲取得原代細胞加入含15％血清培養液制成細胞懸液。經臺盼藍染色行細胞計數，調整細胞濃度為3×105個/ml接種于6孔培養皿(丹麥產Nunc)中，每孔加入細胞懸液3ml，放入37℃、5％CO2的培養箱中培養。每3～4天換一次培養液，一直培養不進行傳代，原代細胞能夠存活20天左右。
四.林蛙輸卵管分泌細胞的傳代培養待原代細胞長成單層后，即進行傳代。吸去培養皿中原培養液，用基礎培養基洗滌細胞1次，洗去殘留的血清成分。每孔加入細胞解離劑0.02％EDTA-Na 3ml，放入37℃溫箱中消化10分鐘，倒置顯微鏡下觀察貼壁細胞收縮變圓，收取細胞懸液，加入離心管中，1000r/min離心10分鐘。棄上清，加入基礎培養液洗滌2次，棄洗滌用基礎培養液，加入條件培養基重懸細胞，輕輕吹打制成細胞懸液，調節細胞數為105個/ml接種于新培養皿中擴大培養，進行一次傳代，傳代培養共進行4代。
實施例3材料與儀器實驗動物選用體重為0.1-0.15kg，產卵前的雌性中國林蛙，作為輸卵管分泌細胞供體。
試劑胰蛋白酶、D-Hank’s、F10/DMEM培養基購自美國Gibco公司；新生牛血清(NBS)、臺盼藍為Sigma公司產品，青、鏈霉素等為國產常規試劑。
儀器MCO-17AI型CO2培養箱(日本，SANYO公司)；CQIC型倒置顯微鏡(重慶光學儀器廠)；SW-CJ-IF型超凈工作臺；細胞培養板(丹麥NUCO公司)。
一.林蛙輸卵管分泌細胞培養基的配制將一份標準包裝的F10/DMEM培養基定溶于1000ml四餾水中，再補加抗生素，其中青霉素10萬單位/L、鏈霉素100mg/L。充分混勻后培養基調整pH為7.6，用0.22μm濾膜濾過除菌后備用。
林蛙輸卵管分泌細胞條件培養液的配制在以F10/DMEM為基礎培養液，添加其體積15％小牛血清、胰島素l0mg/L、濃度為10-6mol/L的雌二醇5μl/ml組成條件培養液。
二.林蛙輸卵管分泌原代細胞的獲取用解剖針破壞腦脊髓處死林蛙，蛙體用75％酒精浸泡在無菌環境中，剖腹取出輸卵管，切取中間粗大盤曲較多的壺腹部，立刻投入盛有100IU/ml青霉素100μg/ml鏈霉素的低溫D-hanks液中，漂洗輸卵管2～3次，洗去血污后于平皿中將輸卵管縱向剪開，把剪開的輸卵管進一步剪碎，加入基礎培養基反復吹洗組織碎塊，吸取洗滌后的基礎培養基，經紗網濾過后，1200r/min離心10分鐘，棄上清，沉淀部分再用基礎培養基漂洗、離心細胞2次，獲得林蛙輸卵管分泌原代細胞。
三.林蛙輸卵管分泌原代細胞的培養將獲取得原代細胞加入含l5％血清培養液制成細胞懸液。經臺盼藍染色行細胞計數，調整細胞濃度為5×105個/ml接種于6孔培養皿(丹麥產Nunc)中，每孔加入細胞懸液3ml，放入37℃、5％CO2的培養箱中培養。每3～4天換一次培養液。一直培養不進行傳代，原代細胞能夠存活20天左右。
四.林蛙輸卵管分泌細胞的傳代培養待原代細胞長成單層后，即進行傳代。吸去培養皿中原培養液，用基礎培養基洗滌細胞1次，洗去殘留的血清成分。每孔加入0.25％胰蛋白酶2ml，放入37℃溫箱中消化5分鐘，倒置顯微鏡下觀察貼壁細胞收縮變圓，收取細胞懸液，加入離心管中，1000r/min離心10分鐘。棄上清，加入基礎培養液洗滌2次，棄洗滌用基礎培養液，加入條件培養基重懸細胞，輕輕吹打制成細胞懸液，調節細胞數為2×105個/ml接種于新培養皿中擴大培養，進行一次傳代，傳代培養共進行3代。
實驗例1、林蛙輸卵管分泌細胞的觀察倒置顯微鏡下可見，剛剛分離的林蛙輸卵管分泌原代細胞為卵圓形，，胞漿飽滿，核圓大，呈懸浮狀態(見圖3)。細胞接種24小時后大都貼壁，伸展呈橄欖形，類似眼睛狀(見圖4)。傳代細胞貼壁伸展快，約4～5d匯合成單層(見圖5)，隨著傳代次數增加，細胞逐漸變為長梭形細胞。
2、林蛙輸卵管分泌細胞的鑒定CD34是一種內皮細胞粘附分子，其結構屬于免疫球蛋白超家族成員，是一種內皮細胞的表面標記物。抗CD34單克隆抗體對內皮細胞穩定性及敏感性都較強。用抗CD34單克隆抗體免疫組化試劑盒。按免疫組化染色方法按試劑盒內的說明進行，免疫細胞化學染色結果顯示，輸卵管分泌細胞陽性著色，其他細胞組織均未染色。輸卵管分泌細胞對抗CD34單克隆抗體呈陽性反應，細胞漿被染成棕色或棕黃色，細胞核著深藍色(見圖6)，呈上(內)皮源性。
權利要求
1.一種中國林蛙輸卵管分泌細胞體外培養方法，包括下列步驟一、輸卵管分泌細胞的培養基的制備包括基礎培養基、條件培養基；選擇適合中國林蛙輸卵管分泌細胞的基礎培養基有DMEM/Ham’sF12、F10/DMEM或RPMI1640，將上述培養基每份定溶于1000ml四餾水中，再補加抗生素其中青霉素10萬單位/L、鏈霉素100mg/L，培養基用0.22μm濾膜濾過除菌，調整pH為7.4-7.6備用；條件培養基，包括作為營養物質的新生牛血清和添加的促生長類激素，其中新生牛血清為每100mL上述基礎培養基中加入5～15ml，胰島素為5～10mg/L基礎培養基；10-6mol/L的雌二醇為5～10μl/ml基礎培養基；二、輸卵管分泌原代細胞的獲取無菌采取輸卵管，采用直接剪切法解離細胞，從而減小對細胞的損傷程度且為體外存活提供更好的前提條件；三、輸卵管分泌原代細胞的培養將獲取得原代細胞加入含15％新生牛血清培養液制成細胞懸液，經臺盼藍染色行細胞計數，調整細胞濃度為2×105～5×105個/ml接種于6孔培養皿中，每孔加入細胞懸液3ml，放入37℃、5％CO2的培養箱中培養，每3～4天換一次培養液；四、輸卵管分泌細胞的傳代培養待原代細胞長滿單層后，即可進行傳代，吸去培養皿中原培養液，用基礎培養液洗滌細胞1-2次，洗去殘留的血清成分，加0.125％或0.25％胰蛋白酶2ml或0.02％乙二胺四乙酸二鈉3ml，放入37℃溫箱中消化5-10分鐘，倒置顯微鏡下觀察貼壁細胞收縮變圓即可吸去消化酶液，加入含15％血清終止液終止消化，棄終止液，加入基礎培養液，吹打制成細胞懸液，調節細胞數為105～2×105個/ml接種于新培養皿中，完成一次傳代。
2.根據權利要求1所述的中國林蛙輸卵管分泌細胞體外培養方法，其特征在于在步驟二輸卵管分泌原代細胞的獲取中，可采取用解剖針破壞腦脊髓處死林蛙，在無菌環境中，剪下中國林蛙雌性的排卵前期輸卵管壺腹部至于滅菌的小平皿中，用含青鏈霉素的D-Hank’s液漂輸卵管2～3次，洗去血污后分離、剪去周圍粘連組織，于平皿中將輸卵管縱向剪開，把剪開的輸卵管進一步剪碎，經紗網濾過后1000-1200r/min離心10分鐘，棄上清，沉淀部分再用基礎培養液漂洗、離心細胞2次，棄上清液獲得林蛙輸卵管分泌原代細胞。
3.根據權利要求1或2所述的中國林蛙輸卵管分泌細胞體外培養方法，其特征在于在步驟四輸卵管分泌細胞的傳代培養中，傳代培養宜在3-4代。
全文摘要
本發明涉及一種中國林蛙輸卵管分泌細胞體外培養方法，屬于一種經濟動物的輸卵管分泌細胞體外培養方法。包括下列步驟輸卵管分泌細胞的培養基的制備包括基礎培養基、條件培養基；輸卵管分泌原代細胞的獲取輸卵管分泌原代細胞的培養輸卵管分泌細胞的傳代培養。本發明的有益效果是針對中國林蛙輸卵管的特殊藥用價值和廣泛的應用前景，確定了林蛙輸卵管分泌細胞體外培養的條件培養基，實現了林蛙輸卵管分泌細胞的體外的原代培養和傳代培養，利用細胞工程等生物技術方法，在體外培養具有獨特生物功能林蛙輸卵管分泌細胞，能更好地開發、應用及保護中國林蛙的天然資源。
文檔編號C12N5/06GK1670192SQ20051001661
公開日2005年9月21日 申請日期2005年3月9日 優先權日2005年3月9日
發明者劉景圣, 鄭鑫 申請人:劉景圣, 鄭鑫