專利名稱：多級式細胞破碎、質粒粗提反應器的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因治療、DNA疫苗、DNA鑒別、DNA防偽及DNA芯片技術中質粒的大規模提取設備，尤其是提供了公開一種適用于工業化生產的多級式細胞破碎、質粒粗提反應器，屬于生物醫藥制備用裝置領域，
背景技術：
20世紀90年代開始，質粒DNA作為基因治療的載體和基因免疫主體得到越來越廣泛的關注。質粒DNA的大規模提取工藝的建立是基因治療和基因免疫研究工作的保證。
目前，細胞破碎和質粒的粗提通常是將菌體按一定比例溶入緩沖溶液中，緩慢加入堿裂解溶液，搖勻、靜置，再加入中和溶液，混勻、放置，高速離心，取上清得到復性的質粒DNA。
作為細胞破碎和質粒粗提的常規方法，雖然在實驗室被廣泛使用，但由于該方法是手動操作，偶然誤差較大，重復性不好，而且不能線性放大。如大于1公斤的菌體破碎時，加入堿裂解溶液，會出現粘團現象，阻礙溶液進一步反應，造成反應不均一，破碎率、回收率較低，重復性差的問題，無法適用于工業化生產。
發明內容
本發明的目的提供一種多級式細胞破碎、質粒粗提反應器，可用于工業化生產，能夠替代目前質粒DNA大規模制備過程中，細胞破碎、質粒粗提步驟的設備。
本發明的技術解決方案如下反應器由供液機構、輸液機構、分液機構、蛇形管反應器、中和分液器組成，供液機構為若干組平行并聯的貯液瓶構成，每個貯液瓶的導管上設置有蠕動泵，通過控制電路控制工作，其中，第一級供液機構由兩個儲液瓶通過三通分液器并聯構成，實現兩種物質的混合反應；第一級供液機構的輸出端再與儲液瓶通過三通分液器并聯后構成次級供液機構，依此類推，下一級的貯液瓶與上一級的供液機構并聯后再與下一級的貯液瓶并聯，可根據反應需要設置多級供液反應機構，最終級供液機構的輸出端與儲液瓶并聯與中和分液器連接，中和分液器的出料口與收集管連接；在供液機構的三通分液器與下級供液機構之間還可加裝蛇形管反應器，延長反應時間，以滿足兩種物料的反應時間要求。
蛇形管反應器內含2米-20米(依據處理量)的蛇形內管，保證兩個貯液瓶A、B中的液體在溫和的條件下混合，同時延長反應時間至符合要求。
為證明本發明的使用效果，以處理100L菌液為例對本發明細胞破碎、質粒粗提反應器與目前常規方法進行比較實驗例1樣品100L菌液，OD值為45，菌濃度為70％，菌體實重7000g。
常規方法
100L菌液10000rpm/min離心1小時→收獲7000g菌體→按18比例加入56L TE溶液充分混勻→將56L混勻液平均分到25個10L瓶中，每瓶2.24L菌體混勻液→每瓶中加入2.24L裂解液(1％SDS0.2％NaOH)輕輕搖勻，靜止5分鐘→每瓶中再加入2.24L中和液(3M醋酸鉀、PH5.5)，充分混勻，靜止10分鐘→每瓶加入2.24L 2MCaCl，靜止10分鐘→10000rpm/min離心20分鐘取上清共得224L，質粒DNA含量為45ug/ml。
本發明的細胞破碎、質粒粗提反應器100L菌液10000rpm/min離心1小時→收獲7000g菌體→按1∶8比例加入56L TE溶液充分混勻→將56L菌體混勻液放入貯液瓶A中，56L裂解液(1％SDS 0.2％NaOH)放入貯液瓶B中，56L中和液(3M醋酸鉀、PH5.5)放入貯液瓶C中，56L 2MCaCl放入貯液瓶D中→同時啟動輸液泵1、2，調節泵流速，使貯液瓶A、B中的液體等速通過三通分液器5，同時使其在蛇形反應器7中進出液相隔時間為5分鐘→蛇形反應器7流出液體時，啟動輸液泵3，使裂解后的菌體在三通分液器6中混合，流入中和分液器中(同時低速攪拌)→當貯液瓶A、B、C中的液體全部流空后，停止攪拌，靜止20分鐘→啟動輸液泵4，快速將貯液瓶D中的液體泵入中和分液器8中(同時低速攪拌)→停止攪拌，靜止10分鐘→打開中和分液器8下部的出料口，由收液罐9收集，共得224L，質粒DNA含量為80ug/ml。
結論上述實驗表明，以處理100L菌液為例，常規方法需分25瓶，重復25個操作循環，或25人同時操作才能完成，重復操作和不同人員的操作會造成中間產品的不均一。采用細胞破碎、質粒粗提反應器使工作者在連續、封閉、穩定的條件下制造出均一的中間產品，同時大大減輕操作者的工作量。以1ml菌液使用質粒提取試劑盒提取的質粒DNA量為100％回收率，比較兩種方法的質粒DNA回收效果，常規方法回收率在30％-50％，細胞破碎、質粒粗提反應器回收率＞70％。
本發明的積極效果在于利用該套設備將重組質粒的大規模提取工藝由手工、間斷的操作變成自動、連續化的過程，克服了目前實驗室常規方法不能線性放大的問題。將重組質粒的宿主-菌體常規堿裂解、質粒粗提和粗提物高速離心等過程由手動操作改變為可控的自動過程；由開放、階段性工作改變為封閉、連續性工作；由實驗室規模改變為易于線性放大的符合GMP要求的工業化規模的反應系統。
圖1為本發明結構示意圖。
具體實施例方式
通過以下實施例進一步舉例描述本發明，并不以任何方式限制本發明，在不背離本發明的技術解決方案的前提下，對本發明所作的本領域普通技術人員容易實現的任何改動或改變都將落入本發明的權利要求范圍之內。
實施例1根據圖1，由貯液瓶A和貯液瓶B經導管并聯與三通分液器5構成第一級供液機構，第一級供液機構的輸出端接蛇形管反應器7后與貯液瓶C并聯后與三通分液器6連接，再與貯液瓶D并聯接密封的攪拌反應罐8，攪拌反應罐8出料口與收集罐9連接；上述的貯液瓶A～D的導管上分別設有蠕動泵1～4和進料管10～14，由控制器控制其工作狀態；在攪拌反應罐8的底部還可設有濾膜15中。
實施例2將100L菌液10000rpm/min離心1小時后收獲7000g菌體，按1∶8比例加入56L TE溶液充分混勻，取56L菌體混勻液放入貯液瓶A中，56L裂解液(1％SDS 0.2％NaOH)放入貯液瓶B中，56L中和液(3M醋酸鉀、PH5.5)放入貯液瓶C中，56L 2MCaCl放入貯液瓶D中，同時啟動輸液泵1、2，調節泵流速，使貯液瓶A、B中的液體等速通過三通分液器5，同時使其在蛇形反應器7中進出液相隔時間為5分鐘，蛇形反應器7流出液體時，啟動輸液泵3，使裂解后的菌體在三通分液器6中混合，流入中和分液器中(同時低速攪拌)；當貯液瓶A、B、C中的液體全部流空后，停止攪拌，靜止20分鐘，啟動輸液泵4，快速將貯液瓶D中的液體泵入攪拌反應罐8中(同時低速攪拌)，停止攪拌，靜止10分鐘，打開攪拌反應罐8下部的出料口，由收液罐9收集，共得224L，質粒DNA含量為80ug/ml。
權利要求
1.一種多級式細胞破碎、質粒粗提反應器，其特征在于反應器由供液機構、輸液機構、分液機構、蛇形管反應器、中和分液器組成，供液機構為若干組平行并聯的貯液瓶構成，每個貯液瓶的導管上設置有蠕動泵，通過控制電路控制工作，其中，第一級供液機構由兩個儲液瓶通過三通分液器并聯構成，實現兩種物質的混合反應；第一級供液機構的輸出端再與儲液瓶通過三通分液器并聯后構成次級供液機構，依此類推，下一級的貯液瓶與上一級的供液機構并聯后再與下一級的貯液瓶并聯，可根據反應需要設置多級供液反應機構，最終級供液機構的輸出端與儲液瓶并聯與密封攪拌反應罐連接，攪拌反應罐出料口與收集管連接。
2.根據權利要求1所述的反應器，其特征在于在供液機構的三通分液器與下級供液機構之間還可加裝蛇形管反應器，延長反應時間，以滿足兩種物料的反應時間要求。
全文摘要
本發明提供一種多級式細胞破碎、質粒粗提反應器，其供液機構為若干組平行并聯的貯液瓶構成，每個貯液瓶的導管上設置有蠕動泵，通過控制電路控制工作，其中，第一級供液機構由兩個儲液瓶通過三通分液器并聯構成，第一級供液機構的輸出端與另一儲液瓶通過三通分液器并聯后構成次級供液機構，依此類推，下一級的貯液瓶與上一級的供液機構并聯后再與下一級的貯液瓶并聯，最終級供液機構的輸出端與儲液瓶并聯與密封攪拌反應罐連接，攪拌反應罐出料口與收集管連接；供液機構與下級供液機構之間還可加裝蛇形管反應器，延長反應時間，以滿足兩種物料的反應時間要求。本發明可替代了細胞破碎、質粒粗提的手工制備操作，適用于工業化生產。
文檔編號C12M1/00GK1710057SQ20051001690
公開日2005年12月21日 申請日期2005年6月22日 優先權日2005年6月22日
發明者殷玉和, 石晶, 孫博 申請人:殷玉和