專利名稱：二、四倍體菘藍轉雙價抗蟲基因的方法
技術領域：
本發明涉及生物工程技術領域，是一種轉基因植物的生產工藝，具體涉及二倍體和四倍體菘藍(Isatis indigotica Fort)同時轉蘇云晶芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白基因(Bt)和豇豆胰蛋白酶抑制劑基因(CpTI)兩抗蟲基因的方法。
背景技術：
通過植物轉基因技術把外源單個或兩個不同來源的抗蟲基因同時轉入到受體植物中，經過轉化細胞的組織培養和植株再生，培育出具有外源基因特性和抗蟲能力的新品種，其中外源基因轉入植物細胞并整合到染色體組上是轉基因技術的重要環節。
菘藍是一種十字花科植物，其根和葉均可制成中藥，其根經過處理干燥后成為的中藥就是“板藍根”，其葉處理干燥后成為的中藥就是“大青葉”，“板藍根”和“大青葉”的藥性基本相同，具有泄火、解毒和涼血的功效，其主要分布在華東各省以及河南、江西等地。菘藍具有較高的藥用價值，但菘藍在栽培過程中易受到病蟲害特別是菜青蟲的侵害，目前市售的菘藍因大量使用農藥而導致農藥殘留超標。因此急需對菘藍這種藥用植物的品種進行改良，提高其抗病蟲害的能力，從源頭上提高中藥材的質量。
國內外文獻尚未見菘藍轉雙價抗蟲基因的方法報道。
發明內容
本發明的目的是利用植物轉基因技術，將雙價抗蟲基因蘇云晶芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白基因(Bt)和豇豆胰蛋白酶抑制劑基因(CpTI)轉入藥用植物二倍體和四倍體菘藍。
本發明提供一種二、四倍體菘藍轉雙價抗蟲基因的方法，它是將含有蘇云晶芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白基因(Bt)和豇豆胰蛋白酶抑制劑基因(CpTI)的載體質粒pGBI121S4ABC，通過農桿菌LBA4404介導，轉入二倍體菘藍和四倍體菘藍。
本發明的具體包括如下步驟1.菘藍種子用70％乙醇浸泡1分鐘，自來水清洗3-4次，加入0.1％HgCl2滅菌20分鐘，在超凈臺上無菌操作，無菌水清洗3-4次，置于滅菌的MS(Murashige and Skoog)固體培養基上萌發；2.將含有蘇云晶芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白基因(Bt)和豇豆胰蛋白酶抑制劑基因(CpTI)的農桿菌LBA4404接種于YEB+100mg/LStr+100mg/Lkan(細菌培養基YEB附加每升100毫克鏈霉素和100毫克卡那霉素)的固體平板上活化，28℃，避光；3.將上述平板上的單菌落接種于YEB+100mg/LStr+100mg/LKan的液體培養基中，28℃，2000rpm震蕩培養24-26小時；4.上述菌液室溫下，4000g離心10分鐘，棄上清，菌體用1/2MS液體培養基懸浮，稀釋到原體積的5-20倍，使菌液生長到OD600＝0.5左右；5.取生長10天左右的菘藍子葉和下胚軸，在其上切3-4個傷口，放入制備好的菌液中，浸泡20分鐘，取出子葉在無菌濾紙上吸干菌液；6.經感染的子葉和下胚軸放于MS固體培養基上，28℃暗培養48小時；7.將子葉轉移到MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+20mg/LKan+500mg/Lcef(培養基MS附加每升6-芐基氨基腺嘌呤2毫克，萘乙酸0.5毫克，頭孢霉素500毫克)培養基上，25℃光照下培養；8.20天左右將傷口上生長出的小芽切下，置于MS+0.02mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+500mg/Lcef(培養基MS附加每升6-芐基氨基腺嘌呤0.02毫克，萘乙酸0.5毫克，頭孢霉素500毫克)培養基上生根，長成完整植株。
發明效果將轉化小苗進行PCR檢測檢測方法Bt殺蟲基因PCR檢測的引物序列如下FP5’-GGT TAC ACT CCC ATC GAC ATC TCC-3’ 24 mer
RP5’-CCA TAG GCG AAC TCT GTT CCG TC-3’ 23 mer這對引物可擴增Bt GFM Cry1A基因序列(從73bp～1151bp，1050bp左右)。
PCR擴增程序如下PCR反應體系組分 體系10×PCR Buffer(內含15mM Mg2+) 2.0μldNTP(4種dNTP混合物10mM each) 1.6μlPrimer(10μmol/L) 各0.5μlTaq(5Unit/μl)0.5μl反應體系終體積為20μl，不足部分用超純水補足。各反應管中最后加入20μL石蠟油反應程序使用TD-PCR預變性94℃ 7min；變性 94℃ 45sec；退火 65-53℃ 45sec；從65℃開始每2個循環下降2℃到53℃，然后在50℃反應18個循環。
延伸72℃ 1min；保溫72℃ 7min.
PCR產物經1.0％瓊脂糖凝膠(內加EB染色)電泳，結果經凝膠成像系統觀察。
檢測結果檢測在抗Kan(卡那霉素)上產生的抗性小苗菘藍，結果二倍體的轉化效率為14.75％，四倍體的轉化效率為16.67％。
與現有的植物轉基因技術相比，本發明使用材料不同，方法也不同，特別是本發明轉入的雙價抗蟲基因蘇云晶芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白基因(Bt)和豇豆胰蛋白酶抑制劑基因(CpTI)對菘藍這種藥用植物的品種進行改良，提高其抗病蟲害的能力，從源頭上提高中藥材的質量，而且本發明的轉化效率較高。
圖1雙價抗蟲基因蘇云晶芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白基因(Bt)和豇豆胰蛋白酶抑制劑基因(CpTI)載體質粒pGBI121S4ABC的質粒圖
具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發明作進一步描述實施例11.二倍體菘藍Isatis indigotica Fort，材料來源為發明者采于上海地區。
2.雙價抗蟲基因蘇云晶芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白基因(Bt)和豇豆胰蛋白酶抑制劑基因(CpTI)載體質粒pGBI121S4ABC和農桿菌LBA4404由中國農業科學院生物技術研究中心郭三堆提供。質粒圖見圖1。
3.菘藍種子用70％乙醇浸泡1分鐘，自來水清洗3次，加入0.1％HgCl2滅菌20分鐘。無菌水清洗3次，置于滅菌的MS固體培養基上萌發。
4.將含有蘇云晶芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白基因(Bt)和豇豆胰蛋白酶抑制劑基因(CpTI)的農桿菌LBA4404接種于YEB+100mg/LStr+100mg/LKan的固體平板上活化，28℃，避光。
5.將上述平板上的單菌落接種于YEB+100mg/LStr+100mg/LKan的液體培養基中，28℃，2000rpm震蕩培養24小時。
6.上述菌液室溫下，4000g離心10分鐘，棄上清，菌體用1/2MS液體培養基懸浮，稀釋到原體積的5倍，使菌液生長到OD600＝0.5左右。
7.取生長10天左右的菘藍子葉和下胚軸，在其上切3個傷口，放入制備好的菌液中，浸泡20分鐘，取出子葉在無菌濾紙上吸干菌液。
8.經感染的子葉和下胚軸放于MS固體培養基上，28℃暗培養48小時。
9.將子葉轉移到MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+20mg/LKan+500mg/Lcef培養基上，25℃光照下培養。
10.20天左右將傷口上生長出的小芽切下，置于MS+0.02mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+500mg/LCef培養基上生根，長成完整植株。
11.將轉化小苗進行PCR檢測，轉化效率為14.75％。
實施例21.四倍體菘藍Isatis indigotica Fort，材料來源為喬傳卓教授育種獲得的新品系，見《菘藍多倍體育種的研究》，植物學報，1989，31卷第9期，第678頁。
2.雙價抗蟲基因蘇云晶芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白基因(Bt)和豇豆胰蛋白酶抑制劑基因(CpTI)載體質粒pGBI121S4ABC和農桿菌LBA4404由中國農業科學院生物技術研究中心郭三堆提供。質粒圖見圖1。
3.菘藍種子用70％乙醇浸泡1分鐘，自來水清洗4次，加入0.1％HgCl2滅菌20分鐘。無菌水清洗4次，置于滅菌的MS固體培養基上萌發。
4.將含有蘇云晶芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白基因(Bt)和豇豆胰蛋白酶抑制劑基因(CpTI)的農桿菌LBA4404接種于YEB+100mg/LStr+100mg/LKan的固體平板上活化，28℃，避光。
5.將上述平板上的單菌落接種于YEB+100mg/LStr+100mg/LKan的液體培養基中，28℃，2000rpm震蕩培養26小時。
6.上述菌液室溫下，4000g離心10分鐘，棄上清，菌體用1/2MS液體培養基懸浮，稀釋到原體積的20倍，使菌液生長到OD600＝0.5左右。
7.取生長10天左右的菘藍子葉和下胚軸，在其上切4個傷口，放入制備好的菌液中，浸泡20分鐘，取出子葉在無菌濾紙上吸干菌液。
8.經感染的子葉和下胚軸放于MS固體培養基上，28℃暗培養48小時。
9.將子葉轉移到MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+20mg/LKan+500mg/LCef培養基上，25℃光照下培養。
10.20天左右將傷口上生長出的小芽切下，置于MS+0.02mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+500mg/LCef培養基上生根，長成完整植株。
11.將轉化小苗進行PCR檢測，轉化效率為16.67％。
權利要求
1.一種二、四倍體菘藍轉雙價抗蟲基因的方法，其特征在于它是將含有蘇云晶芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白基因Bt和豇豆胰蛋白酶抑制劑基因CpTI的載體質粒pGBI121S4ABC，通過農桿菌LBA4404介導，轉入二倍體菘藍和四倍體菘藍。
2.根據權利要求1所述的一種二、四倍體菘藍轉雙價抗蟲基因的方法，其特征在于它包括以下步驟I、菘藍種子用70％乙醇浸泡1分鐘，自來水清洗3-4次，加入0.1％HgCl2滅菌20分鐘，在超凈臺上無菌操作，無菌水清洗3-4次，置于滅菌的MS固體培養基上萌發；II、將含有蘇云晶芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白基因Bt和豇豆胰蛋白酶抑制劑基因CpTI的農桿菌LBA4404接種于YEB+100mg/LStr+100mg/Lkan的固體平板上活化，28℃，避光；III、將上述平板上的單菌落接種于YEB+100mg/LStr+100mg/LKan的液體培養基中，28℃，2000rpm震蕩培養24-26小時；IV、上述菌液室溫下，4000g離心10分鐘，棄上清，菌體用1/2MS液體培養基懸浮，稀釋到原體積的5-20倍，使菌液生長到OD600＝0.5左右；V、取生長10天左右的菘藍子葉和下胚軸，在其上切3-4個傷口，放入制備好的菌液中，浸泡20分鐘，取出子葉在無菌濾紙上吸干菌液；VI、經感染的子葉和下胚軸放于MS固體培養基上，28℃暗培養48小時；VII、將子葉轉移到MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+20mg/LKan+500mg/Lcef培養基上，25C光照下培養；VIII、20天左右將傷口上生長出的小芽切下，置于MS+0.02mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+500mg/Lcef培養基上生根，長成完整植株。
全文摘要
本發明涉及生物工程技術領域，是一種轉基因植物的生產工藝。藥用植物菘藍在栽培過程中易受到病蟲害特別是菜青蟲的侵害，目前市售的菘藍因大量使用農藥而導致農藥殘留超標。本發明提供一種二、四倍體菘藍轉雙價抗蟲基因的方法，它是將含有蘇云晶芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白基因(Bt)和豇豆胰蛋白酶抑制劑基因(CpTI)的載體質粒pGBI121S4ABC，通過農桿菌LBA4404介導，轉入二倍體菘藍和四倍體菘藍。本發明對菘藍品種進行了改良，提高其抗病蟲害的能力，從源頭上提高中藥材的質量，而且本發明的轉化效率較高。
文檔編號C12N15/32GK1724676SQ20051002650
公開日2006年1月25日 申請日期2005年6月6日 優先權日2005年6月6日
發明者丁如賢, 張漢明, 陳萬生, 喬傳卓, 易博 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學