專利名稱：抗蟲融合基因、融合蛋白及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于植物基因工程領域。涉及一種獲得高殺蟲能力的抗蟲融合基因的方法和一種高殺蟲能力的抗蟲融合基因和融合蛋白、以及用該融合蛋白構建抗蟲農作物的具體應用。
背景技術：
害蟲給全球農業生產帶來每年約80億美元的損失。目前，防治害蟲主要依靠使用化學農藥，但是農藥殘留會對人體健康帶來危害。因此，人們成功的選擇了利用殺蟲毒素轉基因作物進行抗蟲。目前，轉基因抗蟲玉米和棉花已經大量種植。轉基因作物抗蟲的關鍵技術是獲得性能優良的殺蟲蛋白質。殺蟲蛋白質有多種，比較常用的是蘇云金芽孢桿菌(簡稱Bt)晶體蛋白質，例如CrylA，CrylC等，它們已被大量運用于轉基因抗蟲作物[I]。但是，單個殺蟲毒素往往殺蟲譜比較窄，殺蟲活性比較低。同時，長期大量使用單一的殺蟲蛋白質還可能引起害蟲抗性的發展[2，3]。因此，獲得高殺蟲活性的新型蛋白質殺蟲毒素，對提高殺蟲能力和減緩害蟲抗性的發生具有重要應用價值
[4]。參考文獻如下:[I]、Crickmore, N., Zeigler, D.R., Feitelson, J., Schnepf, E., Van Rie,J., Lereclus, D., Baum, J.& Dean, D.H.(1998) Microbiol.Mol.Biol.Rev.62,807-813 (蘇云金芽孢桿菌及殺蟲晶體蛋白)；[2] >Ferre, J.& Van Rie, J.(2002) Annu.Rev.Entomo1.47, 501-533 (抗蘇云金芽孢桿菌昆蟲的生物化學和遺傳學)；[3]、Gassmann, A.J., Carriere, Y.& Tabashnik, B.E.(2009) Annu.Rev.Entomol.54，147-163 (抗蘇云金芽孢桿菌昆蟲的適合度代價)；[4]、Chen, Μ., Shelton, A.& Ye, G.(2011) Annu.Rev.Entomo1.56,81-101 (中國轉基因抗蟲水稻:從研究到商業化)。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種具有高殺蟲能力的融合抗蟲基因，以及相應的融合蛋白及其用途。為了解決上述技術問題，本發明提供一種抗蟲融合基因，基因包括從5’ 一 3’依次含有編碼蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis,簡稱Bt)晶體毒素CrylAc的核苷酸序列和編碼CrylIe毒素的核苷酸序列；CrylAc和CrylIe核苷酸之間以XmaI酶切位點連接；上述2個核苷酸序列位于同一個開放閱讀框內。作為本發明的抗蟲融合基因的改進:抗蟲融合基因包括CrylAc的修飾基因和CrylIe的修飾基因，為如SEQ ID NO:2中的下劃線所對應的序列。作為本發明的抗蟲融合基因的進一步改進:抗蟲融合基因的核苷酸序列為SEQ IDNO:2。本發明還同時提供了上述抗蟲融合基因所編碼的抗蟲融合蛋白，抗蟲融合蛋白從N端至C端依次為CrylAc晶體毒素和CrylIe毒素，CrylAc和CrylIe之間以一個脯氨酸(Pro)和一個甘氨酸(Gly)相連接。作為本發明的抗蟲融合蛋白的改進:其氨基酸序列為SEQ ID N0:1。本發明還同時提供了上述抗蟲融合蛋白在轉基因抗蟲農作物中的應用。作為本發明的抗蟲融合蛋白在轉基因抗蟲農作物中的應用的改進:所述農作物為水稻或玉米、棉花、小麥、高粱、大豆、油菜、蘿卜、甘藍等；蟲為鱗翅目害蟲。本發明還提供了上述抗蟲融合基因在轉基因抗蟲農作物中的應用。作為本發明的 抗蟲融合基因在轉基因抗蟲農作物中的應用的改進:農作物為水稻或玉米、棉花、小麥、高粱、大豆、油菜、蘿卜、甘藍等；蟲為鱗翅目害蟲。本發明還提供了上述融合蛋白在轉基因抗蟲作物和轉基因殺蟲微生物方面的應用。本行業的技術人員均知道以下理論:1、二個Cry殺蟲基因的融合并不是都能夠增強殺蟲能力的。例如CrylAb和CrylCa的融合蛋白質的殺蟲能力比相同重量的單獨CrylAb和CrylCa的混合物的殺蟲能力還要低。2、即使兩個單獨蛋白質組合使用具有增效作用，但也并不能得出它們的融合蛋白具有高效殺蟲能力；這是因為:在蛋白質生物化學上，兩個單獨蛋白質的物理混和與融合是不同的，不能根據物理混和所具有的增效作用來肯定融合后所獲得的增效作用；且在不同位置融合所得的融合蛋白的活性是大相徑庭的。本發明所設計的以一個脯氨酸(Pro)和一個甘氨酸(Gly)作為連接肽，將CrylAc晶體毒素與CrylIe毒素融合成人工蛋白質分子。與原先的CrylAc和CrylIe晶體毒素物理混合相比，具有如下優點:殺蟲活性提高，殺蟲譜更廣。本發明的殺蟲蛋白質可以殺滅二化螟、稻縱卷葉螟、棉鈴蟲和玉米螟等水稻、玉米和棉花的主要鱗翅目害蟲。此外，本發明的融合蛋白質還可以有效的減緩害蟲抗性的發生。本發明的殺蟲融合基因使用玉米ubiquitin-Ι啟動子和玉米的pepc終止子構建轉基因植物載體。包含本發明的殺蟲融合基因的轉基因植物載體被使用農桿菌介導的方法轉入水稻和玉米中。本發明所述融合蛋白也可以在其他轉基因抗蟲農作物中應用，比如棉花、小麥、高粱、大豆、油菜、蘿卜和甘藍等。
具體實施例方式本發明的以下實施例所使用的分子生物學和生物化學方法均為已知的技術。在Ausubel 編寫的 John Wiley and Sons 公司出版的 Current Protocols in MolecularBiology,和 J.Sambrook 等編寫 Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)出版的Molecular Cloning: A Labortory Manual, 3rd ED.等文獻均有詳細的說明。實施例1、crylAc-crylle融合基因的構建:編碼CrylAc和CrylIe殺蟲蛋白的基因均委托上海生工合成，其DNA序列分別為SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6。crylAc基因被克隆到載體pET28a表達載體中限制性內切酶BamHI和SacI的位點之間，得到的載體命名為pET_lAc，其編碼一個氨基酸序列為SEQID NO:3的蛋白質；crylle基因被克隆到載體pET28a表達載體中限制性內切酶BamHI和SacI的位點之間，得到的載體命名為pET-lIe，其編碼一個氨基酸序列為SEQ ID NO:5的蛋白質。
pET-lAc-lIe 構建過程:crylAc 片段由 BamHI 和 XmaI 酶切 pET-lAc 獲得，crylle片段由XmaI和SacI酶切pET_lIe獲得。載體pET28a經過BamHI和SacI酶切以后和CrylAc以及Cry 11連接,得到載體pET-1 Ac-11 e。這個載體包含一個融合基因，cry lAc-cry lie, DNA序列為SEQ ID NO:2，其編碼一個氨基酸序列為SEQ ID NO:1的融合蛋白質。
實施例2、殺蟲蛋白質的制備:
包含殺蟲基因的載體pET-lAc、pET_lIe和pET-lAc-lIe分別導入BL21 Star(E.coli)細胞系，在包含50mg/L卡那霉素的LB固體培養基上選取單克隆。單個菌落接種到100毫升LB細菌培養液，在37°C下震動培養至OD6qq=0.6，然后加IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactoside)至濃度為0.5mM,并繼續在同樣的條件下培養4小時。培養液經過5000g離心10分鐘沉淀大腸桿菌細胞，然后棄上清收集沉淀。沉淀中加30毫升20mMTris-HCl緩沖液，超聲粉碎。這樣獲得的重組蛋白質用來進行殺蟲活性的測定。
實施例3、在大腸桿菌中表達的殺蟲蛋白的殺蟲活性測定:
實施例2所獲得的殺蟲蛋白各100微升單獨或者混合涂在0.5平方厘米昆蟲人工飼料的表面，飼養新生一齡幼蟲用來進行殺蟲活性測定。陰性對照的準備方法與實施例2類同，但質粒為不含任何插入DNA的pET28a載體本身。飼養7天以后統計殺蟲率，結果如表I和2所不:
表1、CrylAc-CrylI 殺蟲率
權利要求
1.抗蟲融合基因，其特征是:所述基因包括從5’一 3’依次含有編碼蘇云金芽孢桿菌晶體毒素CrylAc的核苷酸序列和編碼CrylIe毒素的核苷酸序列；CrylAc和CrylIe核苷酸之間以XmaI酶切位點連接；上述2個核苷酸序列位于同一個開放閱讀框內。
2.根據權利要求1所述的抗蟲融合基因，其特征是:所述抗蟲融合基因包括CrylAc的修飾基因和CrylIe的修飾基因。
3.根據權利要求1或2的抗蟲融合基因，其特征是:所述抗蟲融合基因的核苷酸序列為 SEQ ID NO:2o
4.如權利要求Γ3所述的抗蟲融合基因所編碼的抗蟲融合蛋白，其特征是:所述抗蟲融合蛋白從N端至C端依次為CrylAc晶體毒素和CrylIe毒素，CrylAc和CrylIe之間以一個脯氨酸(Pro)和一個甘氨酸(Gly)相連接。
5.根據權利要求4所述的抗蟲融合蛋白，其特征是:所述抗蟲融合蛋白的氨基酸序列為 SEQ ID NO:lo
6.如權利要求4或5所述的抗蟲融合蛋白在轉基因抗蟲農作物中的應用。
7.根據權利要 求6所述的抗蟲融合蛋白在轉基因抗蟲農作物中的應用，其特征是:所述農作物為水稻或玉米；所述蟲為鱗翅目害蟲。
8.如權利要求廣3所述的抗蟲融合基因在轉基因抗蟲農作物中的應用。
9.根據權利要求7所述的抗蟲融合基因在轉基因抗蟲農作物中的應用，其特征是:所述農作物為水稻或玉米；所述蟲為鱗翅目害蟲。
全文摘要
本發明屬于植物基因工程領域；涉及一種獲得高殺蟲能力的抗蟲融合基因的方法和一種高殺蟲能力的抗蟲融合基因和融合蛋白、以及用該融合蛋白構建抗蟲農作物的具體應用。具體而言，本發明公開了一種抗蟲融合基因，其包括從5’－3’ 依次含有編碼蘇云金芽孢桿菌晶體毒素Cry1Ac的核苷酸序列和編碼Cry1Ie毒素的核苷酸序列；Cry1Ac和Cry1Ie核苷酸之間以XmaI酶切位點連接；上述2個核苷酸序列位于同一個開放閱讀框內。本發明還公開了上述抗蟲融合基因所編碼的融合蛋白。本發明還公開了上述抗蟲融合蛋白、抗蟲融合基因在轉基因抗蟲農作物中的應用。
文檔編號C12N15/82GK103215290SQ20131011236
公開日2013年7月24日 申請日期2013年4月1日 優先權日2013年4月1日
發明者方軍, 沈志成, 張薇, 秦毅 申請人:浙江大學