一種檢測轉抗蟲基因玉米對非靶標生物是否安全的方法

專利名稱：一種檢測轉抗蟲基因玉米對非靶標生物是否安全的方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測轉抗蟲基因玉米對非靶標生物是否安全的方法。
背景技術：
傳統化學殺蟲劑的主要問題是對無害的其它昆蟲、動物乃至人類也具有毒性。殺蟲劑在殺滅靶標害蟲的同時，也殺傷了非靶標昆蟲，如次要害蟲、中性昆蟲、重要經濟昆蟲、 害蟲的天敵以及其它非靶標生物，如土壤微生物等，從而破壞生態平衡。抗蟲轉基因作物的應用是替代殺蟲劑的重要途徑。抗蟲轉基因作物也可能存在潛在的負面效應，如害蟲對抗蟲基因產生抗性，及對非靶標生物產生影響等。對轉基因植物潛在的安全性問題進行深入研究，開發新的技術以消除這種安全性隱患，或者對這種風險進行控制和管理，對于轉基因技術的健康發展具有
重要意義。轉基因作物對非目標生物的危害可能不利于生物的多樣性。與世界各國一樣，我國也很重視對轉基因生物對非靶標生物影響技術的研究。上世紀90年代初期，我國就開始了轉基因生物的安全性研究。1997年農業部實施農業轉基因生物安全性管理后，轉基因技術的開發者們也加大了對轉基因生物安全研究的投入。研究范圍包括轉基因生物的環境與食品安全性、GMO檢測與技術，覆蓋了從轉基因生物安全性基本問題到具體GMO產品的安全性，從長期監測到近期急需解決的轉基因生物安全性問題。 研究對象包括轉基因動物、微生物及植物，以轉基因作物為主。研究內容主要包括轉基因性狀的遺傳穩定性、基因漂流、GMC風險管理策略以及種植GMC對食品、飼料及生態環境的影響等。葉蟬不僅僅是許多種作物的害蟲，也是轉基因玉米的非靶標害蟲。葉蟬是植食性害蟲，通過刺吸作物的汁液取食，所以能夠直接接觸轉基因玉米中的殺蟲蛋白質，也是捕食性節肢動物接觸殺蟲蛋白的主要來源之一。對轉基因生物的安全測試，目前只能選擇部分優勢種類或經濟重要性的種類如家蠶等，不可能用實驗來證明轉基因作物對所有非靶標生物的安全性。CrylAc基因是Bt基因的一種。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種檢測轉抗蟲基因植物對具有刺吸式口器的昆蟲是否安全的方法。本發明所提供的檢測轉抗蟲基因植物對具有刺吸式口器的昆蟲是否安全的方法， 包括如下步驟以具有刺吸式口器的昆蟲為待測種群，分別檢測種植轉抗蟲基因植物的田地中和種植非轉基因親本植物的田地中所述待測種群的種群消長動態，再將兩種田地中所述待測種群的種群消長動態進行比較，若兩種田地中所述待測種群的種群消長動態無顯著差異，則確定所述轉抗蟲基因植物為候選的對所述待測種群安全的轉抗蟲基因植物，即確定所述轉抗蟲基因植物為候選的對所述具有刺吸式口器的昆蟲安全的轉抗蟲基因植物；若兩種田地中所述待測種群的種群消長動態有顯著差異，則確定所述轉抗蟲基因植物為候選的對所述待測種群不安全的轉抗蟲基因植物，即確定所述轉抗蟲基因植物為候選的對所述具有刺吸式口器的昆蟲不安全的轉抗蟲基因植物。上述檢測方法中，所述種群消長動態為種群數量消長動態。上述檢測方法中，所述植物為玉米。上述檢測方法中，所述檢測種群消長動態的方法包括如下步驟調查所述田地中的待測種群的個體數量，得出調查數據，根據調查數據，統計分析，得到所述田地中待測種群的種群消長動態；所述調查方法為如下1)和/或2)所示1)包括如下步驟捕獲所述田地中的待測種群，再統計捕獲的待測種群的個體數量；2)包括如下步驟目測觀察所述玉米的葉片、莖桿、玉米穗和花絲上著落過的所述待測種群的個體數量。本發明的另一個目的是提供另一種檢測轉抗蟲基因植物對具有刺吸式口器的昆蟲是否安全的方法。本發明所提供的另一種檢測轉抗蟲基因植物對具有刺吸式口器的昆蟲是否安全的方法，包括如下步驟1)以具有刺吸式口器的昆蟲為待測種群；2)分別檢測種植轉抗蟲基因植物的田地中和種植非轉基因親本植物的田地中所述待測種群的種群消長動態，再將兩種田地中所述待測種群的種群消長動態進行比較；3)分別檢測種植所述轉抗蟲基因植物的田地中和種植非轉基因親本植物的田地中所述待測種群的群落多樣性，再將兩種田地中所述待測種群的群落多樣性進行比較；4)若兩種田地中所述待測種群的種群消長動態無顯著差異，且兩種田地中所述待測種群的群落多樣性無顯著差異，則確定所述轉抗蟲基因植物為候選的對所述待測種群安全的轉抗蟲基因植物，即確定所述轉抗蟲基因植物為候選的對所述具有刺吸式口器的昆蟲安全的轉抗蟲基因植物；若兩種田地中所述待測種群的種群消長動態有顯著差異，且兩種田地中所述待測種群的群落多樣性有顯著差異，則確定所述轉抗蟲基因植物為候選的對所述待測種群不安全的轉抗蟲基因植物，即確定所述轉抗蟲基因植物為候選的對所述具有刺吸式口器的昆蟲不安全的轉抗蟲基因植物。上述另一種檢測方法中，所述種群消長動態為種群數量消長動態；上述另一種檢測方法中，所述待測種群的群落多樣性用所述待測種群的多樣性指數表示；上述另一種檢測方法中，所述植物為玉米。上述另一種檢測方法中，所述檢測種群消長動態的方法包括如下步驟調查所述田地中的待測種群的個體數量，得出調查數據，根據調查數據，統計分析，得到所述田地中待測種群的種群消長動態；上述另一種檢測方法中，所述調查方法為如下1)和/或2、所示1)包括如下步驟捕獲所述田地中的待測種群，再統計捕獲的待測種群的個體數量；2)包括如下步驟目測觀察所述玉米的葉片、莖桿、玉米穗和花絲上著落過的所述待測種群的個體數量；上述另一種檢測方法中，所述檢測群落多樣性的方法包括如下步驟調查所述田地中的待測種群的物種種類及每個物種種類的個體數量，得出調查數據，根據調查數據，統計分析，得到所述田地中待測種群的群落多樣性；上述另一種檢測方法中，所述調查方法為如下1)和/或2、所示1)包括如下步驟捕獲所述田地中的待測種群，再統計捕獲的待測種群的物種種類及每個物種種類的個體數量；2)包括如下步驟目測觀察所述玉米的葉片、莖桿、玉米穗和花絲上著落過的所述待測種群的物種種類及每個物種種類的個體數量。上述任一種檢測方法中，所述捕獲所述田地中的待測種群的方法為如下I和/或 II所示a)包括如下步驟在每塊所述田地的中心位置，放置捕獲裝置I，所述待測種群的昆蟲被粘附到裝置I中的洗滌劑水溶液中，從所述洗滌劑水溶液中分離所述待測種群的昆蟲，得到所述待測種群的昆蟲；所述捕獲裝置I由支撐桿I和設于其頂端的黃色盤子構成， 盤子內裝有濃度為20% -30%的洗滌劑水溶液；b)包括如下步驟在每塊所述田地中放置若干個捕獲裝置II，所述待測種群的昆蟲被粘附到裝置II中的蟲膠上，將粘有所述昆蟲的板冷凍，從中剝離所述昆蟲，即得到所述待測種群的昆蟲；所述捕獲裝置II由支撐桿II和設置于其頂端的黃色板構成，黃色板上涂有蟲膠；上述任一種檢測方法中，所述支撐桿I的高度和支撐桿II的高度均與所述田地中植物的高度滿足如下條件所述支撐桿的高度占所述田地中植物高度的1/3-1/2 ；所述支撐桿的高度具體為1.2米。上述任一種檢測方法中，所述具有刺吸式口器的昆蟲為葉蟬科(Cicadellidae) 昆蟲。上述任一種檢測方法中，所述抗蟲基因為Bt基因；和/或，所述Bt基因為CrylAc基因。本發明的最后一個目的是提供一種輔助檢測轉抗蟲基因植物對非靶標生物是否安全的方法。本發明所提供的輔助檢測轉抗蟲基因植物對非靶標生物是否安全的方法，包括如下步驟以非靶標生物中的具有刺吸式口器的昆蟲作為待測種群，按照上述任一所述檢測方法檢測轉抗蟲基因植物對所述待測種群是否安全，若所述轉抗蟲基因植物對所述待測種群是安全的，則確定所述轉抗蟲基因植物為候選的對所述非靶標生物安全的轉抗蟲基因植物，若所述轉抗蟲基因植物對所述待測種群是不安全的，則確定所述轉抗蟲基因植物為候選的對所述非靶標生物不安全的轉抗蟲基因植物。在轉基因玉米對非靶標生物影響的研究領域中，現有技術大都是以咀嚼式口器昆蟲作為研究對象。但是刺吸式昆蟲直接以植物汁液為食，直接接觸殺蟲蛋白，也可能被直接影響。本發明通過研究發現，種植轉抗蟲基因玉米的田地中，非靶標生物中刺吸式昆蟲(如
6葉蟬科昆蟲)是優勢種群之一，通過檢測種植轉抗蟲基因玉米對刺吸式昆蟲(如葉蟬科昆蟲，)的消長動態和多樣性指數是否產生影響，便能確定種植轉抗蟲基因玉米對生態環境是否產生影響，即優勢種群的消長和多樣性不受影響的話，就說明轉基因玉米對非靶標生物是安全的，證明轉基因玉米對生態環境是安全的。本發明檢測種植轉抗蟲基因玉米對非靶標生物是否安全的方法是可行的，且結果是可靠的，與咀嚼式口器昆蟲相比，以葉蟬作為檢驗對象，可以直接反映轉基因作物對直接接觸殺蟲蛋白的非靶標生物的影響，且葉蟬活動能力較弱，利于調查計數，對于轉基因作物的影響可以做出快速和準確判斷。近幾年的實踐研究證明，此方法是可行的，利用葉蟬作為研究結果是可靠的。只要有葉蟬發生，無論其是否是優勢種群都可以將其作為研究對象來研究轉基因作物對非靶標生物的安全。另外，本發明的捕獲葉蟬科昆蟲的方法操作簡單、針對性強、捕獲的數量多且易于統計，為研究其多樣性提供了方便的條件。本發明彌補了轉基因玉米對非靶標生物影響的研究領域中單獨以咀嚼式口器昆蟲為研究對象的不足，對完善轉基因作物對非靶標生物的影響研究具有重要意義，對轉基因植物的生物安全性的確定具有重要意義。


圖1為轉Bt基因玉米和對照田中葉蟬種群消長動態O009)。圖2為轉Bt基因玉米和對照田中葉蟬種群消長動態O010)。圖3為轉Bt基因玉米田與對照田多樣性指數動態變化O009)。圖4為轉Bt基因玉米田與對照田多樣性指數動態變化O010)。圖5為轉Bt基因玉米和對照田中龜紋瓢蟲種群消長動態O009)。圖6為轉Bt基因玉米和對照田中龜紋瓢蟲種群消長動態O010)。圖7為轉Bt基因玉米和對照田中蜘蛛種群消長動態O009)。圖8為轉Bt基因玉米和對照田中蜘蛛種群消長動態O010)。圖9為轉Bt基因玉米對異色瓢蟲生長發育的影響。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。鄭單58、先玉335、轉CryIAc基因的鄭單58均由國家玉米工程中心(或國家玉米工程技術研究中心)提供。下述實施例中使用的轉基因玉米為將CrylAc基因轉入鄭單58中，得到的轉基因玉米，該轉基因玉米表達抗蟲Bt蛋白，具有抗蟲功能。對該轉基因玉米來講，靶標動物為玉米螟和棉鈴蟲，非靶標動物為靶標生物以外的生物。下述實施例中所使用的上述轉基因玉米均標記為“轉基因”。下述實施例中所使用的親本玉米為鄭單58，均標記為“親本”。一般情況下，選擇轉基因品種的親本作對照比較研究可以監測轉基因品種對非靶標生物的影響。
下述實施例中所使用的常規雜交品種均標記為“先玉”。先玉是目前我國較大面積種植的常規雜交品種，所以選擇其作為比較品種之一。實施例1、轉Bt基因玉米對非靶標生物是否安全的檢測2009年和2010年，在北京中國農業大學轉基因作物試驗基地使用葉蟬開展了轉 CrylAc基因玉米對非靶標生物的影響研究。一、方法1、材料選擇2009年(1)轉基因玉米組(記作轉基因)；(2)親本對照組(記作親本)。2010年(1)轉基因玉米組(記作轉基因)；(2)親本對照組(記作親本)；(3)常規雜交品種(記作先玉)。2、地點選擇試驗地點離其它玉米地500米以上，測試地塊肥力條件基本一致。每塊地大約 25 X 30米，分15個小區，每個品種5個重復。每個小區的面積定為45m2 (5mX 9m)，每個小區內種植15行，每行20株(株距為25cm，行距為60cm)。另夕卜，在營養缽中種植300 (60 X 5) 株，置于大田培養，用于補苗。3、區組設計方法隨機區組設計。為了避免蟲遷飛造成的影響和邊際效應，設置寬5米的保護行或高1.5米的防護網。4、調查方法(1)直接調查法即目測法。為了避免蟲遷飛造成的影響和邊際效應，取樣行為中間3行，每小區隨機取25樣株，五點取樣法。樣株掛牌標記，每次調查時記錄天氣和玉米生育狀態(即生育期)。為了減少溫度的影響，在試驗中要嚴格地控制時間。每次調查時間為 8:00am 10:00am左右，不同調查人員的速度最好也要保持一致。觀察和統計玉米植株上著落過的節肢動物數量和種類。調查植株的部位包括葉片、莖稈、玉米棒(即玉米穗)和穗子(即花絲)。依據葉蟬的行為和棲境來判定葉蟬種類，不管葉蟬的生育期。(2)陷阱調查法a)洗滌劑法在每個小區的中心位置，放置捕獲裝置I，放置3天，葉蟬被黃色塑料盤吸引掉進洗滌劑水溶液中淹死，從洗滌劑水溶液中分離出葉蟬科昆蟲，被分離的葉蟬立即轉移到帶蓋的玻璃管中，貯存到70%的酒精中，直至在解剖鏡下被分類和鑒定和計數。捕獲裝置I由木桿(1. 2米長)和設于其頂端的黃色塑料盤子(34cmX^cm)構成， 盤子內裝有20% -30%洗滌劑水溶液(即將洗滌劑溶于水中，洗滌劑在混合溶液中的體積濃度為20% -30% )。b)蟲膠法在每個小區中每隔5米放置一個捕獲裝置II，放置3天，葉蟬科昆蟲被粘附在蟲膠上，將粘有葉蟬的粘板放入冰柜中冷凍，用針挑出葉蟬，被分離的葉蟬立即轉移到帶蓋的玻璃管中，貯存到70%的酒精中，直至在解剖鏡下被分類和鑒定和計數。所述捕獲裝置II由竹竿(1. 2米長)和設置于其頂端的黃色板(30cmXMcm)構成，黃色板上涂有蟲膠。(3)調查時間
8
2009 年于 7. 18,7. 21,7. 24,7. 27,7. 30,8. 2,8. 5,8. 9,8. 13,8. 21,8. 28,9. 11、
9.沈，調查了 13次。第1-7次(7. 18-8. 5)使用的是直接調查法和洗滌劑法；第8_13次使用的是直接調查法和蟲膠法。2010 年7. 23,7. 29,8. 5,9. 10,9. 25，調查了 5 次。第 1-3 次(7. 23-8. 5)使用的
是直接調查法和洗滌劑法；第4-5次(9. 10-9. 25)使用的是直接調查法和蟲膠法。(4)根據以上調查得到的數據，統計種群內個體數量，進而統計種群數量消長動態；統計種群內物種種類及每個物種種類的個體數量，進而統計種群的群落多樣性。5、數據分析方法及是否安全的判定方法(1)判斷哪種非靶標動物是非靶標動物中的優勢種群的方法一般認為數量較多、危害較重、在生態系統中地位重要的種群為優勢種群。(2)通過比較種群數量消長分析轉基因玉米對非靶標葉蟬種群數量的影響根據調查得到的數據，分別統計轉基因玉米樣區內不同調查時間點上的各種節肢動物的種群數量(即100株植株上同種群的個體數量)，分別統計親本玉米樣區內不同調查時間點上的各種節肢動物的種群數量，分別統計常規雜交種樣區內不同調查時間點上的各種節肢動物的種群數量，從而統計每種植物樣區內每種節肢動物的種群數量消長動態。(3)根據多樣性指數，分析比較轉抗蟲基因玉米對非靶標生物群落穩定性的影響。根據調查得到的數據，分別統計轉基因玉米樣區內不同調查時間點上的各種節肢動物的種類數目(也即物種數，統計范圍為100株植株)及每個種類的個體數目(即物種內的個體數，統計范圍為100株植株)；對于親本玉米樣區、常規雜交種樣區也按照相同的方法進行統計。根據物種數及物種的個體數，分別統計轉基因玉米樣區內各種節肢動物在不同時間點的多樣性指數，對于親本玉米樣區、常規雜交種樣區也按照相同的方法進行多樣性指數統計。根據如下公式計算各個物種的生物多樣性指數。
權利要求
1.一種檢測轉抗蟲基因植物對具有刺吸式口器的昆蟲是否安全的方法，包括如下步驟以具有刺吸式口器的昆蟲為待測種群，分別檢測種植轉抗蟲基因植物的田地中和種植非轉基因親本植物的田地中所述待測種群的種群消長動態，再將兩種田地中所述待測種群的種群消長動態進行比較，若兩種田地中所述待測種群的種群消長動態無顯著差異，則確定所述轉抗蟲基因植物為候選的對所述待測種群安全的轉抗蟲基因植物，即確定所述轉抗蟲基因植物為候選的對所述具有刺吸式口器的昆蟲安全的轉抗蟲基因植物；若兩種田地中所述待測種群的種群消長動態有顯著差異，則確定所述轉抗蟲基因植物為候選的對所述待測種群不安全的轉抗蟲基因植物，即確定所述轉抗蟲基因植物為候選的對所述具有刺吸式口器的昆蟲不安全的轉抗蟲基因植物。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述種群消長動態為種群數量消長動態； 所述植物為玉米。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述檢測種群消長動態的方法包括如下步驟調查所述田地中的待測種群的個體數量，得出調查數據，根據調查數據，統計分析，得到所述田地中待測種群的種群消長動態；所述調查方法為如下1)和/或2、所示1)包括如下步驟捕獲所述田地中的待測種群，再統計捕獲的待測種群的個體數量；2)包括如下步驟目測觀察所述玉米的葉片、莖桿、玉米穗和花絲上著落過的所述待測種群的個體數量。
4.一種檢測轉抗蟲基因植物對具有刺吸式口器的昆蟲是否安全的方法，包括如下步驟1)以具有刺吸式口器的昆蟲為待測種群；2)分別檢測種植轉抗蟲基因植物的田地中和種植非轉基因親本植物的田地中所述待測種群的種群消長動態，再將兩種田地中所述待測種群的種群消長動態進行比較；3)分別檢測種植所述轉抗蟲基因植物的田地中和種植非轉基因親本植物的田地中所述待測種群的群落多樣性，再將兩種田地中所述待測種群的群落多樣性進行比較；4)若兩種田地中所述待測種群的種群消長動態無顯著差異，且兩種田地中所述待測種群的群落多樣性無顯著差異，則確定所述轉抗蟲基因植物為候選的對所述待測種群安全的轉抗蟲基因植物，即確定所述轉抗蟲基因植物為候選的對所述具有刺吸式口器的昆蟲安全的轉抗蟲基因植物。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于所述種群消長動態為種群數量消長動態；所述待測種群的群落多樣性用所述待測種群的多樣性指數表示； 所述植物為玉米。
6.根據權利要求4或5所述的方法，其特征在于所述檢測種群消長動態的方法包括如下步驟調查所述田地中的待測種群的個體數量，得出調查數據，根據調查數據，統計分析，得到所述田地中待測種群的種群消長動態； 所述調查方法為如下1)和/或2、所示1)包括如下步驟捕獲所述田地中的待測種群，再統計捕獲的待測種群的個體數量；2)包括如下步驟目測觀察所述玉米的葉片、莖桿、玉米穗和花絲上著落過的所述待測種群的個體數量；所述檢測群落多樣性的方法包括如下步驟調查所述田地中的待測種群的物種種類及每個物種種類的個體數量，得出調查數據，根據調查數據，統計分析，得到所述田地中待測種群的群落多樣性；所述調查方法為如下1)和/或2)所示1)包括如下步驟捕獲所述田地中的待測種群，再統計捕獲的待測種群的物種種類及每個物種種類的個體數量；2)包括如下步驟目測觀察所述玉米的葉片、莖桿、玉米穗和花絲上著落過的所述待測種群的物種種類及每個物種種類的個體數量。
7.根據權利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述捕獲所述田地中的待測種群的方法為如下I和/或II所示a)包括如下步驟在每塊所述田地的中心位置，放置捕獲裝置I，所述待測種群的昆蟲被粘附到裝置I中的洗滌劑水溶液中，從所述洗滌劑水溶液中分離所述待測種群的昆蟲， 得到所述待測種群的昆蟲；所述捕獲裝置I由支撐桿I和設于其頂端的黃色盤子構成，盤子內裝有濃度為20% -30%的洗滌劑水溶液；b)包括如下步驟在每塊所述田地中放置若干個捕獲裝置II，所述待測種群的昆蟲被粘附到裝置II中的蟲膠上，將粘有所述昆蟲的板冷凍，從中剝離所述昆蟲，即得到所述待測種群的昆蟲；所述捕獲裝置II由支撐桿II和設置于其頂端的黃色板構成，黃色板上涂有蟲膠；和/或，所述支撐桿I的高度和支撐桿II的高度均與所述田地中植物的高度滿足如下條件所述支撐桿的高度占所述田地中植物高度的1/3-1/2 ；所述支撐桿的高度具體為1. 2米。
8.根據權利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于所述具有刺吸式口器的昆蟲為葉蟬科(Cicadellidae)昆蟲。
9.根據權利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于所述抗蟲基因為Bt基因；和/ 或，所述Bt基因為CrylAc基因。
10.一種輔助檢測轉抗蟲基因植物對非靶標生物是否安全的方法，包括如下步驟以非靶標生物中的具有刺吸式口器的昆蟲作為待測種群，按照權利要求1-9中任一所述方法檢測轉抗蟲基因植物對所述待測種群是否安全，若所述轉抗蟲基因植物對所述待測種群是安全的，則確定所述轉抗蟲基因植物為候選的對所述非靶標生物安全的轉抗蟲基因植物， 若所述轉抗蟲基因植物對所述待測種群是不安全的，則確定所述轉抗蟲基因植物為候選的對所述非靶標生物不安全的轉抗蟲基因植物。
全文摘要
本發明公開了一種檢測轉抗蟲基因玉米對非靶標生物是否安全的方法。本發明的檢測轉抗蟲基因玉米對非靶標生物是否安全的方法包括如下步驟以非靶標生物中的具有刺吸式口器的昆蟲作為待測種群，檢測轉抗蟲基因植物對所述待測種群是否安全，若所述轉抗蟲基因植物對所述待測種群是安全的，則候選確定所述轉抗蟲基因植物對所述非靶標生物是安全的，若所述轉抗蟲基因植物對所述待測種群是不安全的，則候選確定所述轉抗蟲基因植物對所述非靶標生物是不安全。本發明彌補了轉基因玉米對非靶標生物影響的研究領域中單獨以咀嚼式口器昆蟲為研究對象的不足，對完善轉基因作物對非靶標生物的影響研究具有重要意義，對轉基因植物的生物安全性的確定具有重要意義。
文檔編號G01N33/48GK102156187SQ201010595170
公開日2011年8月17日 申請日期2010年12月10日 優先權日2010年12月10日
發明者石旺鵬, 董學會, 趙可, 郭艷艷 申請人:中國農業大學