表達傳染性法氏囊病毒基因編碼蛋白永生化細胞制備方法

專利名稱：表達傳染性法氏囊病毒基因編碼蛋白永生化細胞制備方法
技術領域：
本發明涉及生物技術和細胞遺傳學領域，尤其涉及一種表達傳染性法氏囊病毒基因編碼蛋白永生化細胞制備方法。本發明具有深遠的研究性和廣泛的應用性，包括用于研究宿主細胞免疫反應具有穩定性及可表達所需蛋白的哺乳動物細胞的永生化。
背景技術：
傳染性法氏囊病(IBD)是由傳染性法氏囊病毒(IBDV)引起的一種以損害雞中樞免疫器官-法氏囊淋巴濾泡未成熟細胞為特征的急性高度接觸性免疫抑制性傳染病。1957年Cosgrove在美國Delaware的Gamboro鎮首先發現此病，1962年Winterfield分離鑒定出IBDV。該病在美國及世界各國均有發生和流行。88-92年IBD在我國大面積爆發，發病率和死亡率高達30-70％，造成了巨大的經濟損失。近年來，IBD的發生和流行出現了新的特征，即由臨床感染轉化為以亞臨床感染為主、死亡率降低、免疫抑制作用增強。
IBDV病毒基因組為dsRNA，編碼VP1、VP2、VP3、VP4、VP5共5種蛋白，除VP1由B片段編碼外，余者均由A片段編碼。其中VP2、VP3是病毒的主要結構蛋白，構成病毒衣殼的主要成分。VP2具有一個構象依賴性(不連續)的中和抗原決定簇，其誘導的中和抗體能被動地保護宿主不受IBDV感染(變異株和超強毒株除外)，故一般認為VP2是病毒的宿主保護性抗原；VP3具有一個非構象依賴性(連續)的抗原決定簇，是病毒群特異性抗原。VP4是一種具有蛋白酶活性的病毒多肽，在病毒蛋白的成熟過程中起著重要作用。L512A↓A513和M755A↓A756分別對于VP2-VP4和VP4-VP3的剪切是必需的，但是VP4在翻譯中和翻譯后加工過程中會因其結構和拓撲學變化而行使功能。基因組A節段中大ORF上游并與之部分重疊的另外小ORF A編碼非結構蛋白(NP)，即VP5蛋白。VP1是RNA依賴RNA聚合酶(RdRp)，與病毒dsRNA復制有關，同時還具有鳥苷酸轉移酶和甲基轉移酶活性。

發明內容
本發明的目的是提供一種傳染性法氏囊病毒基因編碼蛋白永生化細胞制備方法。
它的步驟如下1)自傳染性法氏囊病毒浙江分離株(NB)的雞胚成纖維細胞(CEF)適應毒中用蛋白酶K消化法抽提病毒dsRNA，長距離一步法RT-PCR擴增病毒全長cDNA，并以此為模板PCR擴增不同編碼蛋白的基因片段與哺乳動物細胞真核表達pCI-neo構建表達質粒pCI-neo-A、pCI-neo-VP243、pCI-neo-VP5、pCI-neo-VP3、pCI-neo-VP2、pCI-neo-VP2(CΔ60)、pCI-neo-VP2(CΔ25)、pCI-neo-VP2(CΔ18)、pCI-neo-VP2(CΔ11)和pCI-neo-VP1，經42℃熱擊轉化CaCl2法制備的大腸桿菌Top10感受態細胞；2)用Luria-Bertani Medium作為基礎培養基，各培養1-3ml濃度為1-1.5OD600值的含目的基因重組質粒的菌液，通過超純質粒純化試劑盒制備無內毒素的超純質粒；3)用含10-15％小牛血清的Minimum Essential Medium作為基礎培養基，各重組質粒經Opti-MEM稀釋后在Lipofectamine 2000介導下轉染90-95％融合的生長活力旺盛的單層Vero細胞；4)在含500μg/ml濃度G418的Minimum Essential Medium培養基中，通過極限稀釋法獲得單克隆化細胞；5)單克隆化細胞經PCR、RT-PCR、Southern blot、Northern blot和IFA/IPMA檢測后，獲得含有目的基因的永生化細胞。
本發明制備的表達傳染性法氏囊病毒基因編碼蛋白永生化細胞，容易培養，增殖快速，可無限擴大，性質穩定，易保存，研究方便。方法技術成熟，重復性強，一般研究人員就可完成。


圖1是傳染性法氏囊病毒基因組及編碼蛋白的物理圖譜；圖2是真核細胞表達載體pCI-neo的質粒圖譜；圖3是IBDV A片段編碼基因的PCR擴增電泳圖；圖4是IBDV系列VP2截斷體克隆化細胞的RT-PCR電泳圖；圖5是IBDV VP5基因克隆化細胞系的Southern blot圖；圖6是IBDV編碼基因克隆化細胞Northern blot圖；圖7是IBDV編碼基因克隆化細胞IFA/IPMA圖。
具體實施例方式
表達傳染性法氏囊病毒基因編碼蛋白永生化細胞制備方法的步驟如下1、傳染性法氏囊病毒全長cDNA的克隆用9-11日齡SPF種蛋制備雞胚成纖維細胞，培養至單層，接種傳染性法氏囊病毒浙江分離株(NB)細胞適應毒，繼續培養96小時，收集含病毒的細胞液，經過復凍融3次，14000rpm，4℃，離心5min；取上清，35000rpm，4℃，超離心2.5小時；將沉淀懸浮于適量TEN溶液，再經過40-60％蔗糖密度梯度，40000rpm，4℃，離心2小時，獲得純化的IBD病毒粒子。取50μl含病毒的蔗糖溶液在含0.5％SDS條件下，加入20mg/ml蛋白酶K直至終濃度為1mg/ml，置50℃消化3小時后，酚/氯仿抽提病毒RNA，RT擴增IBDV A或B節段cDNA，核苷酸序列序列如下IBDV A核苷酸序列GGATACGATCGGTCTGACCCCGGGGGAGTCACCCGGGGACAGGTCGCCAAGGCCTTGTTCCAGGATGGAACTCCTCCTTCTATAACGCTATCATTGATGGTCAGTAGAGATCAGACAAACGATCGCAGCGATGACAAACCTGCAAGATCAAACCCAACAGATTGTTCCGTTCATGCGGAGCCTTCTGATGCCAACAACCGGACCGGCGTCCATTCCGGACGACACCCTGGAGAAGCACACTCTCAGGTCAGAGACCTCGACCTACAATTTGACTGTGGGGGACACAGGGTCAGGGCTAATTGTCTTTTTCCCTGGATTCCCTGGCTCAATTGTGGGTGCTCACTACACACTGCAGAGCAATGGGAACTACAAGTTCGATCAGATGCTCCTGACTGCCCAGAACCTACCGGCCAGTTACAACTACTGCAGGCTAGTGAGTCGGAGTCTCACAGTGAGGTCAAGCACACTTCCTGGTGGCGTTTATGCACTAAACGGCACCATAAACGCCGTGACCTTCCAAGGAAGCCTGAGTGAACTGACAGATGTTAGCTACAATGGGTTGATGTCTGCAACAGCCAACATCAACGACAAAATTGGGAACGTCCTAGTAGGGGAAGGGGTCACCGTCCTCAGCTTACCCACATCATATGATCTTGGGTATGTGAGGCTTGGTGACCCCATTCCCGCAATAGGGCTTGACCCAAAAATGGTAGCCACATGTGACAGCAGTGACAGGCCCAGAGTCTACACCATAACTGCAGCCGATGATTACCAATTCTCATCACAGTACCAACCAGGTGGGGTAACAATCACACTGTTCTCAGCCAACATTGATGCCATCACAAGCCTCAGCGTTGGGGGAGAGCTCGTGTTTCAAACAAGCGTCCATGGCCTTGTACTGGGCGCCACCATCTACCTCATAGGCTTTGATGGGACAGCGGTAATCACCAGGGCTGTGGCCGCAAACAATGGGCTGACGACCGGCACCGACAACCTTTTGCCATTCAATCTTGTGATTCCAACAAACGAGATAACCCAGCCAATCACATCCATCAAACTGGAGATAGTGACCTCCAAAAGTGGTGGTCAGGCAGGGGATCAGATGTCATGGTCCGCAAGAGGGAGCCTAGCAGTGACGATCCATGGTGGCAACTATCCAGG
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CCAATGGGGATGGAGGCCCCAACACGGTCCAAGAACGCCGTGAAAATGGCCAAACGGCGGCAACACCAAAAAGAGAGCCGCCAATAGCCATGATGGGAACCACTCAAGAAGAGGACACTAATCCCAGACCCCGTATCCCCGGCCTTCGCCTGCGGGGGCCCCC2、一系列重組傳染性法氏囊病毒基因大腸桿菌表達菌的構建分別以IBDV A或B節段cDNA為PCR擴增模板，采用相應的引物擴增傳染性法氏囊病毒編碼蛋白的基因片段A、VP243、VP5、VP3、VP2、VP2(CΔ60)、VP2(CΔ25)、VP2(CΔ18)、VP2(CΔ11)、VP1(見圖1)，上述PCR產物經過引物上附帶的限制性內切酶酶切后，與經過相同的限制性內切酶酶切的哺乳動物細胞真核表達載體pCI-neo(見圖2)連接，構建表達質粒pCI-neo-A、pCI-neo-VP243、pCI-neo-VP5、pCI-neo-VP3、pCI-neo-VP2、pCI-neo-VP2(CΔ60)、pCI-neo-VP2(CΔ25)、pCI-neo-VP2(CΔ18)、pCI-neo-VP2(CΔ11)和pCI-neo-VP1，經42℃熱擊轉化CaCl2法制備的大腸桿菌Top10感受態細胞。
3、一系列重組傳染性法氏囊病毒基因的質粒轉染Vero細胞及相應的單克隆細胞系的建立用Luria-Bertani Medium作為基礎培養基，各培養1-3ml濃度為1-1.5 OD600值的含目的基因重組質粒的菌液，通過超純質粒純化試劑盒制備無內毒素的超純質粒；在轉染實驗前一天在24孔培養板接種細胞，用含10-15％小牛血清的Minimum Essential Medium培養基進行培養，轉染當天細胞應達到90-95％融合并融合；混合好溶液A和溶液B，①溶液A用Opti-MEM稀釋DNA(pCI-neo、相應的重組傳染性法氏囊病毒基因的pCI-neo)各0.8-1.0μg到總體積50μl。②溶液B用Opti-MEM稀釋2μl脂質體Lipofectamine2000到終容積50μl。③混合溶液A和B，輕柔混合(不要振蕩)，室溫孵育30min，將100μl脂質體/DNA混合物(從培養孔一邊到另一邊)逐滴加入對應孔，邊加邊輕搖培養板；5％CO237℃孵育24小時后，消化并進行細胞計數，用極限稀釋法克隆單細胞，并改用含500μg/ml濃度G418的培養基培養；在G418篩選濃度下持續培養14天后，挑出單克隆，擴大培養。
4、單克隆細胞系基因組DNA的PCR擴增及Southern blot檢測擴大培養每個克隆細胞，用胰酶消化后再離心收集細胞，重新懸浮于預冷的PBS，漂洗2次，用7.5倍細胞容積的細胞裂解液(6M鹽酸胍，0.1M NaAc，pH5.5)懸浮細胞，將離心管固定于多角度搖勻器上，于室溫慢速搖動1小時；在一新離心管中加入3倍細胞裂解液體積的無水乙醇，然后小心將細胞裂解物鋪于乙醇之上；用一帶鉤的玻璃棒在裂解液與乙醇交界面慢慢攪動，沉淀出的膠狀DNA將掛在玻璃棒上，繼續攪拌直到裂解液與乙醇完全混勻；將纏繞的DNA的玻璃棒重新浸入1個含5ml乙醇的離心管中，室溫下浸泡2分鐘；將纏繞的DNA的玻璃棒放在1張保水蠟膜上，室溫將乙醇蒸發；再將纏繞的DNA的玻璃棒重新浸入1個含5ml乙醇的離心管中，室溫下浸泡2分鐘，重復上一步驟；將玻璃棒浸入含0.5ml TE(pH8.0)的離心管中，4℃下過夜，使DNA吸水膨脹，便于與玻璃棒分離；過夜后，將膠狀DNA從玻璃棒上分離下來。(參考Sambrook and Russell主編的分子克隆實驗指南(第三版))。取1μl基因組DNA稀釋50倍后做模板PCR擴增相應的目的基因(見圖3)。
用限制性內切酶消化10μg基因組DNA樣品；在1V/cm的電壓下進行瓊脂糖凝膠電泳；完畢后，瓊脂糖凝膠經0.25mol/L HCl使DNA脫嘌呤，變性液(0.5mol/L NaOH，1.5mol/L NaCl)使DNA變性，中和液(0.5mol/L Tris-HCl，1.5mol/LNaCl)使之中和；裁尼龍膜預先用蒸餾水浸濕后用20×SSC浸泡；安裝轉移裝置，上面蓋三張經20×SSC飽和過的濾紙(Whatman 3MM)，平臺兩側的濾紙應浸泡在緩沖液中，趕出濾紙中所有氣泡；將凝膠面向下倒扣在濾紙上，凝膠與濾紙間無氣泡，凝膠四周用膠布或塑料薄膜包裹以防緩沖液從凝膠周圍直接流至紙中(虹吸短路)；三張大小合適20×SSC浸濕的3MM濾紙鋪在濾膜表面；放一疊干燥的吸水紙(約5～8cm高)，置一玻璃板于吸水紙上，其上放一重約0.75～1kg的物體；確保槽內有足夠的20×SSC，通過毛細管原理轉移DNA，轉移12-16h；完畢，拆卸印跡裝置，將膜與凝膠一起轉移至干燥的濾紙上，凝膠在上，用軟鉛筆標記凝膠和濾膜的加樣孔位置，撕去凝膠；5×SSC漂洗雜交膜以去除瓊脂糖殘跡，在干燥濾紙上稍微晾干后，經80℃高溫烘烤2小時，使DNA固定于濾膜上，用相應的α-32P標記的DNA探針在Church & GilbertHybridization buffer體系中雜交16-18小時，洗膜，將尼龍膜壓于磷屏下曝光以獲得放射自顯影影像，經Typhoon9200檢測儀對放射信號進行檢測(見圖5)。
5、單克隆細胞系總RNA的RT-PCR擴增及Northern bloting檢測每個克隆細胞擴大培養，按10cm2貼壁細胞1ml比例加入Trizol抽提液，搖動使其勻漿，室溫下放置5分鐘，將抽提液移入離心管；按1ml Trizol加200μl氯仿比例加氯仿，劇烈搖蕩15sec，于室溫放置2-3分鐘；于4℃，12000rpm離心15分鐘，取上清液于一新離心管中，加入600μl的異丙醇，顛倒混勻；室溫放置10分鐘；于4℃，12000rpm離心10分鐘，棄去上清液；加1ml 75％酒精輕洗RNA沉淀，重復1次；4℃，7500rpm離心5分鐘，棄去上清，室溫干燥，溶解在30μl DEPC處理的水中。取1μg總RNA用于RT-PCR擴增相應的目的基因(見圖4)。
取20μg樣品總RNA加入20μl滅菌的并經DEPC處理的甲醛凝膠加樣緩沖液，70℃處理10min后置冰上；制備甲醛變性膠凝膠并預電泳5min，電壓為5V/cm，隨后將樣品加至凝膠加樣孔；3-4V/cm電壓下電泳至溴酚藍遷出凝膠2/3，電泳結束；用DEPC處理水漂洗凝膠數次，除去甲醛，0.05mol/L氫氧化鈉浸泡，無RNA酶的水淋洗凝膠，并用20×SSC浸泡凝膠后，裁尼龍膜預先用蒸餾水浸濕后用20×SSC浸泡；安裝轉移裝置，上面蓋三張經20×SSC飽和過的濾紙(Whatman 3MM)，平臺兩側的濾紙應浸泡在緩沖液中，趕出濾紙中所有氣泡；將凝膠面向下倒扣在濾紙上，凝膠與濾紙間無氣泡，凝膠四周用膠布或塑料薄膜包裹以防緩沖液從凝膠周圍直接流至紙中(虹吸短路)；三張大小合適20×SSC浸濕的3MM濾紙鋪在濾膜表面；放一疊干燥的吸水紙(約5～8cm高)，置一玻璃板于吸水紙上，其上放一重約0.75～1kg的物體；確保槽內有足夠的20×SSC，通過毛細管原理轉移DNA，轉移12-16小時；完畢，拆卸印跡裝置，將膜與凝膠一起轉移至干燥的濾紙上，凝膠在上，用軟鉛筆標記凝膠和濾膜的加樣孔位置，撕去凝膠；6×SSC漂洗雜交膜以去除瓊脂糖殘跡，在干燥濾紙上稍微晾干后，經80℃高溫烘烤2小時，使DNA固定于濾膜上，用相應的α-32P標記的DNA探針在Church & Gilbert Hybridization buffer體系中雜交16-18小時，洗膜，將尼龍膜壓于磷屏下曝光以獲得放射自顯影影像，經Typhoon9200檢測儀對放射信號進行檢測(見圖6)。
6、單克隆細胞系的傳染性法氏囊病毒基因編碼蛋白的表達檢測將單克隆細胞接種于96孔細胞培養板，等細胞長成單層后，移去培養液，用PBS清洗，細胞在-20℃下，用100μl等量丙酮和甲醇的混合液中滲透和固定45min，室溫晾干；在37℃下，細胞用200μl 5％奶粉液中，孵育90min；用含0.25％Tween 20的100μl PBS(PBST)清洗三次；每孔加入50μl用含3％奶粉、0.05％Tween 20的PBS(即PBS-M-T)稀釋成適當濃度的一抗，37℃下孵育60-90min；PBST清洗三次；HRP標記的適當稀釋的羊抗鼠IgG或FITC標記的適當稀釋的羊抗鼠IgG，孵育60-90min；PBST清洗三次；前者用AEC試劑盒顯色后在普通顯微鏡下觀察，陽性細胞呈橙紅色，后者直接在倒置熒光顯微鏡下觀察，陽性細胞發綠色熒光。
本發明運用重組DNA技術、細胞重組技術，采用反轉錄PCR方法得到了傳染性法氏囊病毒A節段cDNA，以之為模板擴增構建了一系列表達編碼蛋白的真核表達載體，經脂質體Lipofectamine 2000介導下轉染90-95％融合的生長活力旺盛的單層Vero細胞，在G418抗性壓力和96孔極限稀釋法克隆抗性單細胞，運用RT-PCR、Southern bloting和Northern bloting技術證實傳染性法氏囊病毒外源基因已經成功轉染進Vero細胞，并整合到細胞基因組中，在mRNA水平轉錄，通過IFA/IPMA證實傳染性法氏囊病毒外源基因表達蛋白在細胞內表達。
本發明將參照附圖在下列實施例中做進一步描述。這些實施例展示的是在G418壓力下表達傳染性法氏囊病毒基因編碼蛋白的永生化細胞系的建立，具有遺傳穩定性。
實施例11、寡核苷酸引物的設計與合成根據GenBank中注冊的雞傳染性法氏囊病毒A節段核苷酸序列(X84034)，設計1對半RT-PCR引物上游引物5’-GGAATTCGGATACGATCGGTCTGACCCCGG-3’下游引物15’-GGGGACCCGCGAACGG-3’(RT)下游引物25’-TTACTGAAATTTATTAAATATCATCTA-3’(PCR)根據GenBank中不同IBDV毒株基因組B片段核苷酸序列，設計并合成了下列RT-PCR引物上游引物B15’-GGAATTCGGATACGATGGGTCTGACCCT-3’下游引物B25’ATTTCTAGAGGGGGCCCCCGCAGGCGAA-3’2、傳染性法氏囊病毒的RNA的提取用9-11日齡SPF種蛋制備雞胚成纖維細胞，培養至單層，接種IBDV-NB毒株細胞適應毒，繼續培養96小時，收集病毒液，經過復凍融3次，14000rpm，4℃，離心5min；取上清，35000rpm，4℃，超離心2.5小時；將沉淀懸浮于適量TEN，再經過40-60％蔗糖密度梯度，40000rpm，4℃，離心2小時，獲得純化的IBD病毒粒子。取50μl含病毒的蔗糖溶液在含0.5％SDS條件下，加入20mg/ml蛋白酶K直至終濃度為1mg/ml，置50℃消化3小時后，酚/氯仿抽提病毒dsRNA。
3、傳染性法氏囊病毒A片段全長cDNA合成病毒dsRNA和不含酶切位點的下游引物1在98℃變性5分鐘使雙鏈RNA解鏈，立即放置冰上，在50℃條件下加入(5×First-Strand Buffer，0.1M DTT，dNTP)混合液，利用SuperscriptII酶反轉錄合成全長cDNA，經RNase H除去雜交鏈的RNA后，用位于病毒基因組非編碼區(NCR)兩端的上游引物和下游引物2一步擴增出IBDV A節段的片段(3.3Kb)。割膠回收PCR產物，PCR純化試劑盒純化PCR產物。純化的PCR產物與pGEM-T easy載體連接，轉化大腸桿菌Top10，經藍白斑篩選、酶切和PCR鑒定重組質粒。步行法測定A片段的核苷酸序列。
4、傳染性法氏囊病毒B片段全長cDNA合成采用上海生工反轉錄試劑盒(RevertAidTM M-MuLV reverse transcriptase)進行。冰上將IBDV dsRNA和引物B2混合均勻，于95℃作用3min使RNA充分變性，迅速置冰上2min。加入反轉錄混合液(含5×RT buffer，20U Ribonucleaseinhibitor，1mM dNTP)，在反轉錄酶的作用下，45℃反轉錄合成B節段全長cDNA，經RNase H除去雜交鏈的RNA后，用位于病毒基因組B節段非編碼區(NCR)兩端的引物B1和引物B2一步擴增出IBDV B節段的全長片段(2.8Kb)。割膠純化PCR產物。純化的PCR產物與pGEM-T easy載體連接，轉化大腸桿菌Top10感受態細胞，經藍白斑篩選，酶切和PCR鑒定重組質粒。步行法測定B片段的核苷酸序列。
實施例21、IBDV基因組A節段在真核表達細胞系的建立在一步法RT-PCR克隆IBDV A全長cDNA的基礎上，構建包括兩端非編碼區的完整的A片段的真核表達載體pCI-neo-A(載體圖譜見圖1)。重組pCI-neo-A轉化大場桿菌Top10。挑取含目的基因的單菌落，37℃振蕩培養至OD600為1.0-1.5，超純化pCI-neo-A質粒。取0.8-1μg重組質粒在2μl Lipofectamine 2000介導下轉染90-95％融合的單層Vero細胞。轉染后1天，消化細胞并計數，采用極限稀釋，制備約10個細胞/ml的細胞懸液(含G418的MEM培養基)，鋪若干塊96孔板，待細胞貼壁后，在顯微鏡下觀察，標記好單個細胞孔。每隔3-4天換液，大約兩周至三周后，可以看到擴長的單克隆細胞成團狀成長，然后將細胞消化逐級擴大培養。對于不能確定為單細胞的克隆孔必要時按同樣方法進行第二次克隆。pCI-neo-A在通過連續兩次克隆獲得3個單細胞7B4、9B4、9C4。
2、IBDV多聚蛋白VP243在真核表達細胞系的建立BDV A全長cDNA為模板，通過上游引物5’-CCGGAATTCATGACAAACCTGCAAGATCAAACCC-3’和下游5’-GCGCGCGGCCGCTCACTCAAGGTCCTCATCAG-3’PCR擴增IBDV大ORF編碼的由1012個氨基酸組成的多聚蛋白基因片段，其他質粒純化、轉染、單細胞克隆的方法步驟同上，兩次克隆獲得三個表達IBDV VP2蛋白的細胞系4G8、3C4和3C6。
3、表達IBDV VP5蛋白的細胞株的建立以IBDV A全長cDNA為模板，通過上游引物5’-CCGGAATTCATGGTTAGTAGATATCAGACAAACG-3’和下游引物5’-GATCGTCGACTCACTCAGGCTTCCTTGGAAGGTC-3’擴增IBDV小ORF編碼的含145個氨基酸的完整VP5基因，并定向克隆到pCI-neo載體，通過重組質粒超純純化(High purity Plasmid Miniprep System)后，在Lipofectamine2000介導下轉染90-95％融合的單層Vero細胞，在G418抗性篩選下，通過96孔極限稀釋法，克隆獲得相應的單克隆細胞。一次單克隆在篩選獲得8個陽性克隆，分別為B1、C1、C5、D8、G10、C11、C12、F4，二次單克隆獲得2F11陽性克隆。
4、VP2以及VP2(CΔ60)、VP2(CΔ25)、VP2(CΔ18)、VP2(CΔ11)4個截短突變體編碼蛋白的細胞株的建立表1擴增一系列不同長度VP2基因的引物

以IBDV A全長cDNA為模板，運用上述引物組合，擴增并構建了5個不同VP2基因片段載體，即pCI-neo-VP2、pCI-neo-VP2(CΔ60)、pCI-neo-VP2(CΔ25)、pCI-neo-VP2(CΔ18)、pCI-neo-VP2(CΔ11)。其他質粒純化、轉染、單細胞克隆的方法步驟同上(1)pCI-neo-VP2(CΔ60)一次單克隆在篩選獲得8個陽性克隆，分別為B9、C12、C3、D9、D8、D3、E8、E4，二次單克隆獲得7C5陽性克隆。
(2)pCI-neo-VP2(CΔ25)通過連續兩次克隆獲得到3E5、4C7、3D3、4B11陽性克隆。
(3)pCI-neo-VP2(CΔ18)連續兩次克隆的基礎上獲得5G3、5D9 2個陽性克隆。
(4)pCI-neo-VP2(CΔ11)連續兩次克隆一個陽性克隆5C1。
(5)pCI-neo-VP2通過連續兩次篩選到陽性3B2、3B3、3D2、3E2、3C4 5個。
5、表達IBDV VP3蛋白的細胞株的建立以IBDV A全長cDNA為模板，通過上游引物5’-CCGGAATTCATGGCATCAGAGTTCAAAGAG-3’和下游引物5’-GCGCGCGGCCGCTCACTCAAGGTCCTCATCAG-3’擴增IBDV VP3蛋白編碼基因，上游引物中自帶ATG使VP3的ORF完整。其他質粒純化、轉染、單細胞克隆的方法步驟同上。一次單克隆獲得5個陽性細胞系D2、D7、G9、F4、F6。
6、表達IBDV VP1蛋白的細胞株的建立以IBDV B節段全長cDNA為模板，通過VP1基因上游引物5′-CCGGAATTCATGAGTGACATFTTCAACAGT-3’和下游引物5’-AATCTCGAGTCATGGCTGTTGGCGGCTCTCC-3’PCR擴增IBDV B節段ORF編碼的由879個氨基酸組成的RdRp蛋白基因片段，其他質粒純化、轉染、單細胞克隆的方法步驟同上，一次單克隆獲得6個表達IBDV VP1蛋白的陽性細胞系B10、C2、C10、D7、D9和E12。
實施例31、單克隆細胞系的PCR鑒定擴繁后的各個單克隆細胞經細胞裂解液(6M鹽酸胍，0.1M NaAc，pH5.5)法提取細胞基因組DNA，經ddH2O 50倍稀釋后做PCR模板擴增相應的目的基因，體系如下1μl稀釋后的模板，5μl 10×PCR Buffer(含Mg2+)，1μl 10mM dNTPMix，0.5μl TaqPlus，各1μl 12μM相應的上下游引物，加水至50μl體系。反應條件95℃預變性2min，95℃變性15s，(58-61℃)退火15s，72℃延伸Xmin(根據擴增序列大小，按1分鐘合成1000bp計算)，共30個循環，72℃再延伸10min。取5μl PCR產物跑電泳，觀察(見圖3以1-5號樣品為例，分別為pCI-neo-VP2-3E2、pCI-neo-VP2(CΔ11)-5C1、pCI-neo-VP2(CΔ18)-5D9、pCI-neo-VP2(CΔ25)-3E5、pCI-neo-VP2(Δ60)-7C5，其他克隆省略)。
2、單克隆細胞系的Southern blot鑒定單克隆細胞樣品基因組DNA抽提；限制性內切酶消化；1V/cm電壓下瓊脂糖凝膠電泳；凝膠經DNA脫嘌呤、變性、中和處理；將DNA轉移到帶正電的尼龍膜；探針標記(TaKaRa的Random Prime DNA Labeling Kit Ver.2)；0.5MNa2HPO4平衡膜，Church & Gilbert Hybridization buffer預/雜交；洗膜；磷屏對濾膜曝光以獲得放射自顯影影像；Typhoon9200檢測儀(Apharmacia公司)對放射信號進行檢測(見圖5以樣品pCI-neo-VP5-2F11為例，1號為陰性對照，2號為陽性對照，其他克隆省略)。
3、單克隆細胞系的Northern blot鑒定單克隆細胞樣品總RNA抽提(Trizol法)；3-4V/cm電壓下甲醛變性凝膠電泳；凝膠經DEPC處理水漂洗、0.05mol/L氫氧化鈉浸泡、20×SSC浸泡處理；將DNA轉移到帶正電的尼龍膜；探針標記(TaKaRa的Random Prime DNALabeling Kit Ver.2)；0.5M Na2HPO4平衡膜，Church & Gilbert Hybridization buffer預/雜交；洗膜；磷屏對濾膜曝光以獲得放射自顯影影像；Typhoon9200檢測儀(Apharmacia公司)對放射信號進行檢測(見圖6以1-15號樣品為例擴增VP2內的高變區450bp大小片段，分別為pCI-neo-VP2-3D2、pCI-neo-VP2-3B3、pCI-neo-VP2-3C4、pCI-neo-VP2(CΔ11)-5C1、pCI-neo-VP2(CΔ18)-5D9、pCI-neo-VP2(CΔ25)-3E5、pCI-neo-VP2(CΔ25)-4C7、pCI-neo-VP2(Δ60)-7C5、pCI-neo-VP2(Δ60)-C12、pCI-neo-VP2(Δ60)-D8、pCI-neo-A-9C4、pCI-neo-A-7B4、pCI-neo-VP243-4G8、pCI-neo-VP243-3C4、pCI-neo-VP5-2F11，其他克隆省略)。
4、單克隆細胞系的RT-PCR鑒定Trizol法抽提各個單克隆細胞樣品總RNA，使用特異性引物反轉錄合成目的基因的cDNA，體系步驟如下1μg Total RNA，1μl 12μM相應的特異性下游引物，補DEPC處理水至12μl，70℃變性5min，冰上放置2min，加入混合液(4μl5×Reaction Buffer，1μl Ribonuclease inhibitor，2μl 10mM dNTP Mix)，37℃孵育5min，加入1μl 200U/μl的M-MuLV transcriptase，42℃孵育60min，70℃滅活10min，直接用PCR。PCR體系1μl cDNA反應液，5μl 10×PCR Buffer(含Mg2+)，1μl 10mM dNTP Mix，0.5μl TaqPlus，各1μl 12μM相應的上下游引物，加水至50μl體系。反應條件95℃預變性2min，95℃變性15s，(58-61℃)退火15s，72℃延伸Xmin(根據擴增序列大小，按1分鐘合成1000bp計算)，共30個循環，72℃再延伸10min。取5μl PCR產物跑電泳，觀察(見圖4以1-17號樣品為例擴增VP2內的高變區450bp大小片段，分別為pCI-neo-VP2-3E2、pCI-neo-VP2-3D2、pCI-neo-VP2-3B3、pCI-neo-VP2-3C4、pCI-neo-VP2(CΔ11)-5C1、pCI-neo-VP2(CΔ18)-5D9、pCI-neo-VP2(CΔ25)-3E5、pCI-neo-VP2(CΔ25)-4C7、pCI-neo-VP2(Δ60)-7C5、pCI-neo-VP2(Δ60)-C12、pCI-neo-VP2(Δ60)-D8、pCI-neo-A-9B4、pCI-neo-A-9C4、pCI-neo-A-7B4、pCI-neo-VP243-4G8、pCI-neo-VP243-3C6、pCI-neo-VP243-3C4，其他克隆省略)。
實施例41、IBDV-A單克隆細胞系表達產物的IFA/IMPA檢測將單克隆細胞按適當濃度接種于96孔細胞培養板，各4個孔，并設4孔為陰性對照，4孔為IBDV感染細胞為陽性對照，等細胞長成單層后，移去培養液，用PBS清洗，細胞用100μl等量丙酮和甲醇的混合液在-20℃滲透和固定45min，室溫晾干；在37℃下，細胞用200μl 5％奶粉液中，孵育90min；用含0.25％Tween20的100μl PBS(PBST)清洗三次；每孔加入50μl用含3％奶粉、0.05％Tween 20的PBS(即PBS-M-T)稀釋成適當濃度的一抗，37℃下孵育60-90min；PBST清洗三次；每個樣品中的2孔加HRP標記的適當稀釋的羊抗鼠IgG，另外2孔加FITC標記的適當稀釋的羊抗鼠IgG，孵育60-90min；PBST清洗三次；前者用AEC試劑盒顯色后在普通顯微鏡下觀察，陽性細胞呈橙紅色，后者直接在倒置熒光顯微鏡下觀察，陽性細胞發綠色熒光。7B4、9B4、9C4被鑒定為陽性(圖省略)。
2、IBDV-VP243單克隆細胞系表達產物的IFA/IMPA檢測將單克隆細胞按適當濃度接種96孔細胞培養板，各4個孔，并設4孔為陰性對照，4孔為IBDV感染細胞為陽性對照，等細胞長成單層后，去培養液，PBS清洗，丙酮/甲醇混合液固定；，在37℃下，5％奶粉液中封閉；PBST清洗；PBS-M-T稀釋的一抗37℃下孵育；PBST清洗；加HRP標記的適當稀釋的羊抗鼠IgG或FITC標記的適當稀釋的羊抗鼠IgG孵育；PBST清洗；前者用AEC試劑盒顯色后在普通顯微鏡下觀察，后者直接在倒置熒光顯微鏡下觀察。獲得4G8、3C4、3C6 3個陽性克隆(圖省略)。
3、IBDV-VP5單克隆細胞系表達產物的IFA/IMPA檢測將2F11、B1、C1、C5、D8、G10、C11、C12、F4等單克隆細胞，按適當濃度接種96孔細胞培養板，各4個孔，并設4孔為陰性對照，4孔為IBDV感染細胞為陽性對照，等細胞長成單層后，去培養液，PBS清洗，丙酮/甲醇混合液固定；，在37℃下，5％奶粉液中封閉；PBST清洗；PBS-M-T稀釋的一抗37℃下孵育；PBST清洗；加HRP標記的適當稀釋的羊抗鼠IgG或FITC標記的適當稀釋的羊抗鼠IgG孵育；PBST清洗；前者用AEC試劑盒顯色后在普通顯微鏡下觀察，后者直接在倒置熒光顯微鏡下觀察。2F11、B1、C1、C5、D8、G10、C11、C12、F4鑒定為陽性克隆(見圖7以VP5-2F11為例，其他克隆樣品省略)。
4、IBDV-VP3單克隆細胞系表達產物的IFA/IMPA檢測將單克隆細胞，按適當濃度接種96孔細胞培養板，各4個孔，并設4孔為陰性對照，4孔為IBDV感染細胞為陽性對照，等細胞長成單層后，去培養液，PBS清洗，丙酮/甲醇混合液固定；，在37℃下，5％奶粉液中封閉；PBST清洗；PBS-M-T稀釋的一抗37℃下孵育；PBST清洗；加HRP標記的適當稀釋的羊抗鼠IgG或FITC標記的適當稀釋的羊抗鼠IgG孵育；PBST清洗；前者用AEC試劑盒顯色后在普通顯微鏡下觀察，后者直接在倒置熒光顯微鏡下觀察。獲得5個陽性克隆，即D2、D7、G9、F4、F6(圖省略)。
5、IBDV-VP2單克隆細胞系表達產物的IFA/IMPA檢測將3B2、3B3、3D2、3E2、3C4等單克隆細胞，按適當濃度接種96孔細胞培養板，各4個孔，并設4孔為陰性對照，4孔為IBDV感染細胞為陽性對照，等細胞長成單層后，去培養液，PBS清洗，丙酮/甲醇混合液固定；，在37℃下，5％奶粉液中封閉；PBST清洗；PBS-M-T稀釋的一抗37℃下孵育；PBST清洗；加HRP標記的適當稀釋的羊抗鼠IgG或FITC標記的適當稀釋的羊抗鼠IgG孵育；PBST清洗；前者用AEC試劑盒顯色后在普通顯微鏡下觀察，后者直接在倒置熒光顯微鏡下觀察。3B2、3B3、3D2、3E2、3C4被鑒定為陽性克隆(圖省略)。
6、IBDV-VP2(CΔ60)單克隆細胞系表達產物的IFA/IMPA檢測將單克隆細胞7C5、B9、C12、C3、D9、D8、D3、E8、E4等單細胞克隆，按適當濃度接種96孔細胞培養板，各4個孔，并設4孔為陰性對照，4孔為IBDV感染細胞為陽性對照，等細胞長成單層后，去培養液，PBS清洗，丙酮/甲醇混合液固定；，在37℃下，5％奶粉液中封閉；PBST清洗；PBS-M-T稀釋的一抗37℃下孵育；PBST清洗；加HRP標記的適當稀釋的羊抗鼠IgG或FITC標記的適當稀釋的羊抗鼠IgG孵育；PBST清洗；前者用AEC試劑盒顯色后在普通顯微鏡下觀察，后者直接在倒置熒光顯微鏡下觀察。7C5、B9、C12、C3、D9、D8、D3、E8、E4為陽性單細胞克隆(圖省略)。
7、IBDV-VP2(CΔ25)單克隆細胞系表達產物的IFA/IMPA檢測將單克隆細胞3E5、4C7、3D3、4B11等單細胞克隆按適當濃度接種96孔細胞培養板，各4個孔，并設4孔為陰性對照，4孔為IBDV感染細胞為陽性對照，等細胞長成單層后，去培養液，PBS清洗，丙酮/甲醇混合液固定；，在37℃下，5％奶粉液中封閉；PBST清洗；PBS-M-T稀釋的一抗37℃下孵育；PBST清洗；加HRP標記的適當稀釋的羊抗鼠IgG或FITC標記的適當稀釋的羊抗鼠IgG孵育；PBST清洗；前者用AEC試劑盒顯色后在普通顯微鏡下觀察，后者直接在倒置熒光顯微鏡下觀察。其中克隆號(3E5、4C7、3D3、4B11)為陽性克隆(圖省略)。
8、IBDV-VP2(CΔ18)單克隆細胞系表達產物的IFA/IMPA檢測將單克隆細胞5G3、5D9等單細胞克隆按適當濃度接種96孔細胞培養板，各4個孔，并設4孔為陰性對照，4孔為IBDV感染細胞為陽性對照，等細胞長成單層后，去培養液，PBS清洗，丙酮/甲醇混合液固定；，在37℃下，5％奶粉液中封閉；PBST清洗；PBS-M-T稀釋的一抗37℃下孵育；PBST清洗；加HRP標記的適當稀釋的羊抗鼠IgG或FITC標記的適當稀釋的羊抗鼠IgG孵育；PBST清洗；前者用AEC試劑盒顯色后在普通顯微鏡下觀察，后者直接在倒置熒光顯微鏡下觀察。5G3、5D9單克隆細胞系經IFA/IPAM鑒定為陽性克隆(圖省略)。
9、IBDV-VP2(CΔ11)單克隆細胞系表達產物的IFA/IMPA檢測將單克隆細胞5C1等單細胞克隆按適當濃度接種96孔細胞培養板，各4個孔，并設4孔為陰性對照，4孔為IBDV感染細胞為陽性對照，等細胞長成單層后，去培養液，PBS清洗，丙酮/甲醇混合液固定；，在37℃下，5％奶粉液中封閉；PBST清洗；PBS-M-T稀釋的一抗37℃下孵育；PBST清洗；加HRP標記的適當稀釋的羊抗鼠IgG或FITC標記的適當稀釋的羊抗鼠IgG孵育；PBST清洗；前者用AEC試劑盒顯色后在普通顯微鏡下觀察，后者直接在倒置熒光顯微鏡下觀察。IFA/IPMA結果表明IBDV-VP2(CΔ11)只有5C1為陽性單克隆細胞(圖省略)。
權利要求
1.一種表達傳染性法氏囊病毒基因編碼蛋白永生化細胞制備方法，其特征在于它的步驟如下1)自傳染性法氏囊病毒抽提病毒RNA，長距離一步法RT-PCR擴增病毒全長cDNA，并以此為模板PCR擴增不同編碼蛋白的基因片段與哺乳動物細胞真核表達pCI-neo構建表達質粒pCI-neo-A、pCI-neo-VP243、pCI-neo-VP5、pCI-neo-VP3、pCI-neo-VP2、pCI-neo-VP2(CΔ60)、pCI-neo-VP2(CΔ25)、pCI-neo-VP2(CΔ18)、pCI-neo-VP2(CΔ11)和pCI-neo-VP1，經42℃熱擊轉化CaCl2法制備的大腸桿菌Top10感受態細胞；2)用Luria-Bertani Medium作為基礎培養基，各培養1-3ml濃度為1-1.5OD600值的含目的基因重組質粒的菌液，通過超純質粒純化試劑盒制備無內毒素的超純質粒；3)用含10-15％小牛血清的Minimum Essential Medium作為基礎培養基，各重組質粒經Opti-MEM稀釋后在Lipofectamine 2000介導下轉染90-95％融合的生長活力旺盛的單層Vero細胞；4)在含500μg/ml濃度G418的Minimum Essential Medium培養基中，通過極限稀釋法獲得單克隆化細胞；5)單克隆化細胞經PCR、RT-PCR、Southern blot、Northern blot和IFA/IPMA檢測后，獲得含有目的基因的永生化細胞。
2.根據權利要求1所述的一種表達傳染性法氏囊病毒基因編碼蛋白永生化細胞制備方法，其特征在于所述的IBDV含兩端非編碼區A節段、VP243、VP5、VP3、VP2、VP2(CΔ60)、VP2(CΔ25)、VP2(CΔ18)、VP2(CΔ11)、VP1基因與含有CMV啟動子的真核表達載體pCI-neo組建成表達載體pCI-neo-A、pCI-neo-VP243、pCI-neo-VP5、pCI-neo-VP3、pCI-neo-VP2、pCI-neo-VP2(CΔ60)、pCI-neo-VP2(CΔ25)、pCI-neo-VP2(CΔ18)、pCI-neo-VP2(CΔ11)和pCI-neo-VP1。
3.根據權利要求2所述的一種表達傳染性法氏囊病毒基因編碼蛋白永生化細胞制備方法，其特征在于所述的pCI-neo-A、pCI-neo-VP243、pCI-neo-VP5、pCI-neo-VP3、pCI-neo-VP2、pCI-neo-VP2(CΔ60)、pCI-neo-VP2(CΔ25)、pCI-neo-VP2(CΔ18)、pCI-neo-VP2(CΔ11)和pCI-neo-VP1重組質粒，經42℃熱擊轉化CaCl2法制備的大腸桿菌Top10感受態細胞后，分別構建含上述表達質粒的大腸桿菌。
4.根據權利要求3所述的一種表達傳染性法氏囊病毒基因編碼蛋白永生化細胞制備方法，其特征在于所述的含目的基因的大腸桿菌經過質粒超純純化后，在Lipofectamine 2000介導下轉染生長活力旺盛的單層Vero細胞，相應的傳染性法氏囊病毒基因編碼蛋白的以獨立形式沉積在細胞內。
5.根據權利要求4所述的一種表達傳染性法氏囊病毒基因編碼蛋白永生化細胞制備方法，其特征在于所述的含目的基因的重組質粒轉染后的細胞進行G418抗性篩選，獲得G418抗性的細胞。
6.根據權利4或5要求所述的一種表達傳染性法氏囊病毒基因編碼蛋白永生化細胞制備方法，其特征在于所述的G418抗性的細胞，通過極限稀釋法獲得單克隆化細胞。
7.根據權利要求6所述的一種表達傳染性法氏囊病毒基因編碼蛋白永生化細胞制備方法，其特征在于所述的單克隆化細胞，在含500μg/ml濃度G418的Minimum Essential Medium培養基中傳代、擴繁，經過PCR、RT-PCR、Southernblot、Northern blot和IFA/IPMA檢測后，獲得含有目的基因的單克隆永生化細胞。
8.根據權利要求7所述的一種表達傳染性法氏囊病毒基因編碼蛋白永生化細胞制備方法，其特征在于所述的獲得含有目的基因的單克隆永生化細胞為研究傳染性法氏囊病毒基因編碼蛋白對宿主細胞基因表達調控提供載體，以及表達傳染性法氏囊病毒基因編碼蛋白應用于傳染性法氏囊病的免疫接種。
全文摘要
本發明公開了一種表達傳染性法氏囊病毒基因編碼蛋白永生化細胞制備方法。反轉錄獲得傳染性法氏囊病毒基因組cDNA，PCR擴增不同編碼蛋白的基因片段與哺乳動物細胞真核表達pCI－neo構建成重組表達質粒。在Lipofectamine 2000介導下轉染Vero細胞，在G418的抗性下，通過極限稀釋法克隆單細胞，經PCR、RT－PCR、Southern blot、Northern blot、IFA/IPMA檢測，獲得含目的基因的克隆化細胞系，經反復傳代培養后不丟失。這些細胞系可作為研究傳染性法氏囊病毒基因編碼蛋白對宿主細胞基因表達調控的載體，以及將表達傳染性法氏囊病毒基因編碼蛋白應用于傳染性法氏囊病的免疫接種。本發明應用基因工程技術、細胞重組技術制備表達傳染性法氏囊病毒基因編碼蛋白的永生細胞，具有重復性強、穩定性好，再生能力強等特點。
文檔編號C12N15/33GK1696292SQ20051004930
公開日2005年11月16日 申請日期2005年3月8日 優先權日2005年3月8日
發明者周繼勇, 葉菊秀, 陳慶新, 鄭肖娟 申請人:浙江大學