專利名稱：以綠膿桿菌外排泵外膜蛋白MexAB－OprM為靶點的抗綠膿桿菌藥物篩選模型的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種以綠膿桿菌外排泵外膜蛋白MexAB-OprM為靶點的抗綠膿桿菌藥物篩選模型，以及利用所述篩選模型篩選抗耐藥綠膿桿菌的藥物之方法。本發明還涉及一種用于上述篩選模型和篩選方法的過量表達MexAB-OprM蛋白之重組綠膿桿菌。本發明還涉及利用上述篩選模型和方法獲得的抗綠膿桿菌藥物。
背景技術：
綠膿桿菌(pseudomonas aeruginosa)，又名銅綠假單胞茵，是一種重要的院內感染條件致病菌，在機會性感染的病源菌中位于前三甲之列，經常感染癌癥病人、燒傷患者等免疫力低下的病人，引起茵血癥，肺炎，泌尿系統感染和囊性纖維化等疾病。
由于綠膿桿菌具有先天的和后天獲得的耐藥性，對多種在結構和作用機制上都大相徑庭的抗生素產生多重高度耐藥，使臨床治療十分困難，一旦感染，死亡率很高，為臨床醫生面臨的治療難題之一。
綠膿桿菌的耐藥機理十分復雜，但其對多種抗茵藥物產生多重高度耐藥主要得益于如下兩種機制一種是綠膿桿菌外膜通透性很低，其非特異性通透性僅為大腸桿菌的0.2％-1％；另一種是綠膿桿菌中存在著可以外排多種藥物的主動外排系統。有關綠膿桿菌外排泵的作用機制、耐藥機制、毒性機理的基礎研究已成為全球的研究熱點。目前在綠膿桿菌中已經發現了7種跨膜質子梯度能驅動(Transmembrane protongradient energy driven)的外排泵，分別命名為MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN、MexXY-OprM、MexJK-OprM、MexGHI-OpmD和最近發現的MexVW-OprM。對綠膿桿菌基因組數據的分析表明，可能還存在著8種潛在的外排系統。
隨著對外排泵研究的不斷深入，人們逐漸認識到藥物的外排作用不僅可以直接降低細胞內的藥物濃度，提高菌體對藥物的MIC值，還可以間接地通過在細胞內較低藥物濃度下，對抗性突變體進行快速選擇，從而進一步提高細菌的耐藥水平；篩選外排泵抑制劑(efflux pumpinhibitor，EPI)，不僅可以抑制綠膿桿菌的外排作用，大大降低綠膿桿菌對藥物的先天抗性，而且還可以逆轉后天獲得的抗性，降低臨床治療中高水平耐藥菌株出現的頻率，克服耐藥綠膿桿菌帶來的威脅。
在已經發現的外排系統中，MexAB-OprM是綠膿桿菌中底物譜最廣，外排作用最強的外排泵，可以外排四環素、氯霉素、喹諾酮類抗生素、新生霉素、大環內酯類抗生素、β-內酰胺類抗生素和β-內酰胺酶抑制劑等多種廣泛使用的抗生素，在綠膿桿菌的多重耐藥性中起著極其重要的作用。其他幾種外排泵，如MexCD-OprJ，MexEF-OprN和MexXY-OprM只在一些突變體中或是經過特殊誘導才會表達，在通常的實驗室條件中，并不表達或表達量很低。
對臨床分離的高度耐藥綠膿桿菌進行分析的結果表明絕大多數的耐藥綠膿桿菌都有MexAB-OprM高表達，進一步證明了MexAB-0prM外排系統，是綠膿桿菌產生多重高度耐藥性的主要原因。因此，有效抑制高度耐藥的綠膿桿菌之MexAB-OprM外排系統，將有助于改善綠膿桿菌的耐藥現狀。
國外一些著名的藥物研發機構對于外排泵抑制劑的研究正如火如荼地進行。1999年的ICAAC(The Interscience Conference onAntimicrobial Agents and Chemotherapy)會議上MicrocidePharmaceutical Co.和日本第一制藥株式會社共同報道了三種抗外排泵藥物的成功化學合成；2001年，日本的研究人員報道了在其化合物庫中篩選得到了一種外排抑制劑MC-207，110，可以使綠膿桿菌對左旋氧氟沙星的MIC值降低32到64倍，其結構也被認為是一種很有前景的先導化合物。對先導化合物MC-207110的最優化處理得到的一些廣譜外排泵抑制劑，對綠膿桿菌體內有效；2002年，發現的新的外排抑制劑(MC-02,595)，可以將左旋氧氟沙星的MI C值降低8倍，一系列以此化合物為基礎的研究正在展開；2003年，篩選得到了作用于MexAB-OprM外排泵的抑制劑MC-510,050，正在對該化合物的結構優化，以期獲得活性更強的外排抑制劑。但是，到目前為止，還沒有專門作用于外排系統的抗綠膿桿菌藥物應用于臨床。因此，始終需要不斷篩選以早日獲得能夠真正用于臨床的抗綠膿桿菌藥物或前體化合物。
本發明人首次提出建立以綠膿桿菌外排泵為靶點的高通量藥物篩選模型，旨在從微生物的代謝產物中優選的以外排泵MexAB-OprM為靶點篩選抗耐藥綠膿桿菌藥物。所述篩選模型在國內、外的文獻中均未見到相關的報道。
具體的，在缺失外排系統的綠膿桿菌中克隆表達外排蛋白mexAB-oprM基因，構建過量表達MexAB-OprM蛋白的綠膿桿菌，以此作為檢定菌建立高通量的藥物篩選模型，篩選作用于MexAB-OprM的抗耐藥綠膿藥物。本發明的篩選模型克服了現有技術中通過大腸桿菌作為宿主表達外排蛋白所導致的外排底物譜發生改變，以及由于外膜通透性不同所帶來的假陽性，具有極高的特異性。
采用本發明所述篩選模型獲得的抗耐藥綠膿桿菌藥物與目前臨床上廣泛應用的抗細菌藥物具有完全不同的作用機制，可以大大降低綠膿桿菌對藥物的先天抗性，克服由于外排作用導致的高度耐藥綠膿桿菌，逆轉其后天獲得的抗性，使一大批因為綠膿桿菌的外排作用失去對相關感染的治療功能的抗生素在臨床應用中恢復應有的活性。
發明內容
本發明人針對綠膿桿菌的耐藥機制，通過分子生物學方法，構建高效表達外排泵，特別是過量表達外膜蛋白MexAB-OprM的重組綠膿桿菌作為檢定菌，成功建立了作用于綠膿桿菌外排系統之藥物的高通量藥物篩選模型。該模型能夠用于從微生物代謝產物中篩選例如以外排泵MexAB-OprM為靶點的新型抗耐藥綠膿桿菌藥物。
在本發明的一個實施方案中，涉及一種以綠膿桿菌外排泵例如外膜蛋白Mex AB-OprM為靶點的抗綠膿桿菌藥物篩選模型。
在本發明的一個實施方案中，提供了一種以外膜蛋白Mex AB-OprM為靶點的抗綠膿桿菌藥物篩選模型，其是通過以重組綠膿桿菌XY229(含有質粒pAK1900-mexAB-oprM)為檢定茵，以剛好低于所述檢定菌MIC值濃度的抗生素(MexAB-OprM的底物)為輔助抗生素，通過比較加入或不加入待測化合物后不同時間點于540nm測定的光吸收值，從待測樣品中獲得以外膜蛋白Mex AB-OprM為靶點的抗綠膿桿菌藥物。
在本發明中，所述待測樣品，包括但不限于，天然來源的樣品和微生物發酵產物，和人工合成的化合物。
本發明還涉及一種利用本發明上述篩選模型篩選抗耐藥綠膿桿菌的藥物之方法，所述方法包括如下步驟1)在加入終濃度為100μg/ml的鏈霉素和100μg/ml的氨芐青霉素的MH培養基中，37℃，200rpm過夜培養接種含有重組質粒pAK1900-mexAB-oprM的重組綠膿桿菌作為檢定茵；2)在96孔板中分別加入生長對照組(C)和樣品篩選組(S)的樣品，樣品對照組(S’)，在540nm波長下分別檢測生長對照組、樣品對照組和樣品篩選組樣品的光吸收值，其中生長對照組的組成為MH液體培養基，剛好低于所述檢定菌MIC值的輔助抗生素以及1％的步驟1)中制備的檢定菌過夜培養物；樣品對照組的組成為MH液體培養基，剛好低于所述檢定茵MIC值的輔助抗生素以及待測發酵液樣品；樣品篩選組的組成為MH液體培養基，剛好低于所述檢定茵MIC值的輔助抗生素，1％的步驟1)中制備的檢定茵過夜培養物以及待測發酵液樣品；3)將生長對照組、樣品對照組和樣品篩選組的樣品于37℃培養24小時后，再次分別測定540nm處的光吸收。
4)依據步驟2)和3)中兩次測定的光吸收值，判定所述待測樣品是否具有抗耐藥綠膿桿菌活性。
在本發明的一個具體實施方案中，本發明涉及一種以外排蛋白MexAB-OprM為靶點篩選抗耐藥綠膿桿菌的藥物的方法，包括1)在3ml MH培養基中，加入終濃度為100μg/ml的鏈霉素和100μg/ml的氨芐青霉素，接種含有重組質粒pAK1900-mexAB-oprM的重組綠膿桿菌XY229(CGMCC1375)作為檢定菌，37℃，200rpm過夜培養；2)在96孔板中分別加入生長對照組(C)，樣品對照組(S’)和樣品篩選組(S)的樣品，在540nm波長下分別檢測生長對照組、樣品對照組和樣品篩選組樣品的光吸收值，其中生長對照組的組成為MH液體培養基180μl，剛好低于所述檢定菌MIC值的輔助抗生素以及1％的步驟1)中制備的檢定茵過夜培養物；樣品對照組的組成為MH液體培養基180μl，剛好低于所述檢定菌MIC值的輔助抗生素以及待測發酵液樣品20μl；樣品篩選組的組成為MH液體培養基180μl，剛好低于所述檢定菌MIC值的輔助抗生素，1％的步驟1)中制備的檢定菌過夜培養物以及待測發酵液樣品20μl；3)將生長對照組、樣品對照組和樣品篩選組的樣品于37℃培養24小時后，再次分別測定540nm處的光吸收。
4)依據步驟2)和3)中兩次測定的光吸收值，判定所述待測樣品是否具有抗耐藥綠膿桿菌活性。
在本發明中，通過如下方程計算各濃度的輔助抗生素對綠膿桿菌的生長抑制作用R={1-(S24-S0)-(S′24-S′0)C24-C0}×100]]>其中R為細菌生長抑制率(100％)，C24-C0為37℃培養24小時后生長對照組中的樣品之光吸收OD540值的增加量，S24-S0為37℃培養24小時后樣品篩選組中的樣品之光吸收OD540值的增加量，S’24-S’0為37℃培養24小時后樣品對照組中的樣品之光吸收OD540值的增加量。
R值越大，表明綠膿桿菌被抑制的程度越高。換言之，如果待測樣品例如微生物發酵液中含具有外排泵抑制劑作用的活性成分，則將顯著性降低輔助抗生素抑菌濃度，故而可將R值顯著性升高改變作為初篩依據。
在本發明中，將R值大于50％的樣品確定為初篩陽性樣品。
本發明所述篩選抗耐藥綠膿桿菌的藥物之方法還可以包括復篩的步驟。
在本發明的具體實施方案中，針對初篩陽性樣品進行復篩的方法，包括分別以XY229(pAK1900-mexAB-oprM)+輔助抗生素為鑒定組，以XY229(pAK1900)、XY229(pAK1900-mexAB-oprM)、XY229(pAK1900-mexAB-oprM)+抗生素(另外一種MexAB-OprM的底物)為對照組，對于初篩所得的陽性樣品進行復篩。
本發明還涉及一種用于上述篩選模型和篩選方法的過量表達MexAB-OprM蛋白之重組綠膿桿菌。在本發明的一個實施方案中，作為檢定菌用于本發明篩選模型的重組綠膿桿菌是含有重組質粒pAK1900-mexAB-oprM的重組綠膿桿菌XY229，其已于2005年5月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京，中關村北一條13號，100080)，保藏號CGMCC 1375。
本發明通過成功建立作用于綠膿桿菌外排泵的藥物篩選模型，能夠高通量地從微生物代謝產物中和其他來源的化合物中，篩選作用于外排泵的抗耐藥綠膿桿菌新型藥物及先導化合物，以克服目前臨床上綠膿桿菌高度耐藥問題，為解決臨床上所面臨的治療難題做出貢獻。
實施例1外膜蛋白mexAB-oprM操縱子基因的克隆1)用CTAB法從野生綠膿桿茵PAO1中提取總DNA按照常規方法過夜培養5ml的PAO1懸液，離心2分鐘。沉淀加入567μl的pH8.0的TE緩沖液，重懸，加入30μl的10％的SDS溶液和6μl的20mg/ml的蛋白酶K溶液，37℃水浴1小時。混合物加入100μl的5mol/l的NaCl溶液，再加入80μl的CTAB/NaCl溶液，65℃溫浴10分鐘。酚/氯仿/異戊醇抽提兩次。用異丙醇常溫下沉淀基因組DNA。
2)PCR擴增目的基因將如步驟1)所述獲得的綠膿桿菌PAO1的基因組DNA，用限制性內切酶HindIII處理，作為PCR的模版。根據綠膿桿菌基因組數據庫中的序列數據，設計引物引物15’-AGCGAGCTCAGCAGGCGTCCGTCGAAAAGG-3’；引物25’-CAGAAGCTTGCTGACCCGCAACCGCTAAG-3’，擴增得到mexAB-oprM操縱子基因。
實施例2過量表達MexAB-OprM蛋白的重組綠膿桿菌的構建1)將實施例1所得操縱子基因mexAB-oprM連接到表達載體pAK1900用限制性內切酶HindIII將如實施例1所述獲得的存在于克隆載體pUC 18中的目的基因切下后，進行去磷酸化處理，連接到同樣由HindIII處理并去磷酸化的表達載體pAK1900中，得到重組質粒pAK1900-mexAB-oprM。
2)常規方法電擊轉化宿主茵XY229(MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN、MexXY-OprM四種外排泵缺失，由Komori.Y博士惠贈)。
3)制備感受態細胞挑單茵落接種到25ml LB液體培養基中，37℃劇烈震蕩培養過夜；將1ml過夜培養物接種到50ml LB液體培養基中，37℃劇烈震蕩培養至OD600＝0.5；把培養物冰浴10分鐘后，用冰預冷的SMEB緩沖液洗兩遍。然后用200μl SMEB緩沖液重懸，置于冰上待用。
4)電擊轉化把1μl pAK 1900、pAK1900-mexAB-oprM分別與40μl依上述步驟3)制備好的感受態細胞XY229混勻，轉移到0.2cm電擊轉化杯中，電擊(C＝25μF；PC＝200ohm；V＝2.5kV)。電擊完成后，迅速把質粒/細胞混合物轉移到1ml SOC培養基中，37℃劇烈震蕩培養，然后涂布氨芐平板，37℃過夜孵化。挑選陽性克隆，并提取質粒并進行酶切鑒定。
實施例3以綠膿桿菌外排泵外膜蛋白MexAB-OprM為靶點的抗綠膿桿菌藥物篩選之初篩模型本發明所述初篩模型采用濁度法高通量篩選具有抑制外排泵活性的物質。以XY229(pAK1900-mexAB-oprM)為檢定菌，以剛好低于其MIC值濃度的抗生素(MexAB-OprM的底物)為輔助抗生素，初篩天然樣品及人工合成的化合物。如下表所示在96孔板中分別加入相應組分，于540nm測定光吸收。37℃培養24小時后，再次測定540nm處的光吸收。
用如下方程計算各濃度輔助抗生素對綠膿桿菌的生長抑制作用R={1-(S24-S0)-(S′24-S′0)C24-C0}×100]]>其中R值大于50％的確定為初篩陽性樣品根據光吸收度所反映出的綠膿桿菌生長情況，篩選有外排泵抑制活性的陽性發酵液。
實施例4以綠膿桿菌外排泵外膜蛋白MexAB-OprM為靶點的抗綠膿桿茵藥物篩選之復篩模型以XY229(pAK1900-mexAB-oprM)+輔助抗生素為鑒定組，以XY229(pAK1900)、XY229(pAK1900-mexAB-oprM)、XY229(pAK1900-mexAB-oprM)+抗生素(另外一種MexAB-OprM的底物)為對照組，對于初篩所得的陽性樣品進行復篩。復篩模型的實驗步驟參照初篩模型。其中鑒定組XY229(pAK1900-mexAB-oprM)+輔助抗生素復篩的實驗方案，就是初篩的那個方案。各個對照組只需把鑒定菌和輔助抗生素調整成相應的成分既可。
權利要求
1.一種以綠膿桿菌外排泵為靶點的抗綠膿桿菌藥物篩選模型，其特征在于使用過量表達所述綠膿桿菌外排泵的重組綠膿桿菌為檢定菌，以剛好低于所述檢定菌MIC值濃度的外排泵之底物抗生素為輔助抗生素，通過比較加入或不加入待測化合物后不同時間點于540nm測定的光吸收值，用于以綠膿桿菌外排泵為靶點的抗綠膿桿菌藥物篩選。
2.權利要求1所述的篩選模型，其中所述綠膿桿菌外排泵選自MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN、MexXY-OprM、MexJK-OprM、MexGHI-OpmD和MexVW-OprM，優選的為外膜蛋白MexAB-OprM。
3.權利要求1所述的篩選模型，其中所述檢定菌為含有重組質粒pAK1900-mexAB-oprM的重組綠膿桿菌XY229(CGMCC1375)。
4.一種利用權利要求1所述篩選模型篩選抗耐藥綠膿桿菌的藥物之方法，包括如下步驟1)在加入終濃度為100μg/ml的鏈霉素和100μg/ml的氨芐青霉素的MH培養基中，37℃，200rpm過夜培養含有重組質粒pAK1900-mexAB-oprM的重組綠膿桿菌作為檢定菌；2)在96孔板中分別加入生長對照組(C)和樣品篩選組(S)的樣品，樣品對照組(S’)，在540nm波長下分別檢測生長對照組、樣品對照組和樣品篩選組樣品的光吸收值，其中生長對照組的組成為MH液體培養基，剛好低于所述檢定菌MIC值的輔助抗生素以及1％的步驟1)中制備的檢定菌過夜培養物；樣品對照組的組成為MH液體培養基，剛好低于所述檢定菌MIC值的輔助抗生素以及待測發酵液樣品；樣品篩選組的組成為MH液體培養基，剛好低于所述檢定菌MIC值的輔助抗生素，1％的步驟1)中制備的檢定菌過夜培養物以及待測發酵液樣品；3)將生長對照組、樣品對照組和樣品篩選組的樣品于37℃培養24小時后，再次分別測定540nm處的光吸收；4)依據步驟2)和3)中兩次測定的光吸收值，判定所述待測樣品是否具有抗耐藥綠膿桿菌活性。
5.權利要求4的方法，其中還包括如下的復篩步驟分別以XY229(pAK1900-mexAB-oprM)+輔助抗生素為鑒定組，以XY229(pAK1900)、XY229(pAK1900-mexAB-oprM)、XY229(pAK1900-mexAB-oprM)+抗生素(另外一種MexAB-OprM的底物)為對照組，對于初篩所得的陽性樣品進行復篩。
6.一種用于權利要求1的篩選模型和/或權利要求4的篩選方法的過量表達MexAB-OprM蛋白之重組綠膿桿菌。
7.權利要求6所述重組綠膿桿菌，其為含有重組質粒pAK1900-mexAB-oprM的重組綠膿桿菌CGMCC1375。
8.利用權利要求1的篩選模型和/或權利要求2的方法獲得的抗綠膿桿菌藥物。
全文摘要
本發明涉及一種以綠膿桿菌外排泵外膜蛋白MexAB－OprM為靶點的抗綠膿桿菌藥物篩選模型，以及利用所述篩選模型篩選抗耐藥綠膿桿菌的藥物之方法。本發明還涉及一種用于上述篩選模型和篩選方法的過量表達MexAB－OprM蛋白之重組綠膿桿菌。本發明還涉及利用上述篩選模型和方法獲得的抗綠膿桿菌藥物。
文檔編號C12Q1/18GK1876832SQ20051007527
公開日2006年12月13日 申請日期2005年6月9日 優先權日2005年6月9日
發明者肖春玲, 楊麗霞, 田睿, 姚天爵, 劉藝霜, 游雪甫 申請人:中國醫學科學院醫藥生物技術研究所