專利名稱：一種可視的多個基因突變位點同時檢測的方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種可視的多個基因突變位點同時檢測的方法。
背景技術：
基因突變是由于DNA分子中發生堿基對的插入、缺失或改變，而引起的基因結構的改變。近年來，對癌癥病人進行個性化治療已經成為一種趨勢，它是根據癌癥患者藥物遺傳學和藥物基因組學特點，采用特異和最佳的化療藥物方案進行治療的方法。目前，基因突變分析已經使癌癥患者個性化治療成為可能，用基因突變分析可以為醫生提供有力的證據和信息，在實施治療方案時，可選擇對患者最有效的藥物治療方案，不僅提高了療效，還可以降低化療的毒副作用，同時提高患者的生存質量。另外，人體內一些基因型的存在會增加人類患某種疾病的風險，這種基因就叫疾病易感基因。通過疾病易感基因突變分析，可向人們提供個性化健康指導服務、個性化用藥指導服務和個性化體檢指導服務。就可以在疾病發生之前的幾年、甚至幾十年進行準確的預防，而不是盲目的保健；人們可以通過調整膳食營養、改變生活方式、增加體檢頻度、接受早期診治等多種方法，有效地規避疾病發生的環境因素。基因突變分析方法常采用電泳分析和固相雜交的方法，如DNA測序、限制酶切片段長度多態性分析、單鏈DNA構象多態性分析、異源雙鏈核酸分析、等位基因特異性寡聚核苷酸雜交、錯配酶切分析、寡聚核苷酸連接分析等，這些方法需要繁瑣的分離或洗滌程序， 增加了檢測時間。采用均相檢測方法可以避免上述問題，目前的均相檢測方法均基于熒光偏振或小分子熒光染料之間的熒光共振能量轉移，偏振化熒光的強度大大降低，導致了基于熒光偏振的方法靈敏度不高；基于熒光共振能量轉移的方法均要對探針分子進行雙修飾，導致成本很高。隨著個性化醫療時代的到來，操作簡單高靈敏多基因突變位點的均相的同時分析不僅能減少檢測成本，簡化工作流程，而且還能為患者節省時間，讓醫生快速準確地制定治療和預防方案。目前一些已知的基因突變位點檢測不太靈敏，如PIK3CA基因(NM_006218)的突變位點 E545K、H1047R、E542K、H1047L, BRCAl 基因(NM_007294)的突變位點 185delAG、 5382insC, BRCA2 基因(NM_000059)的突變位點 6174delT ；Kras 基因(NM_004985)的突變位點;34G > A、38G > A.35G > A, BRAF基因(NM_004333)的突變位點V600E，因此研究一種可以檢測這些位點的方法可以為醫生快速準確地制定治療和預防方案奠定基礎。EM^(為PIK3CA基因所編碼蛋白的第542位E突變為K，PIK3CA基因的第16 位核苷酸G突變為A。E545K為PIK3CA基因所編碼蛋白的第545位E突變為K，PIK3CA基因的第1633位核苷酸G突變為A。H1047R為PIK3CA基因所編碼蛋白的第1047位H突變為R，PIK3CA基因的第3140位核苷酸A突變為G。H1047L為PIK3CA基因所編碼蛋白的第
權利要求
1. 一種檢測或輔助檢測待測DNA中突變位點的方法，包括以下步驟1)以待測DNA為模板進行多重PCR擴增，得到PCR產物，2)用熒光物質標記步驟1)得到的PCR擴增產物，得到標記熒光物質的產物；3)將步驟幻得到標記熒光物質的產物與式(I)的化合物反應，直接目測觀察反應產物的顏色確定所述待測DNA中的目標基因的突變位點； 式(I)中，R代表鏈端含有四級胺的直鏈或支鏈的烷基，所述烷基的主鏈長為2-12個碳，X代表鹵素；所述式(I)化合物的數均分子量為5000-100000。 '
2.如權利要求1所述的方法，其特征為步驟1)中，所述多重PCR擴增的引物為能夠擴增所述待測DNA中的目標基因的所有突變位點的引物組；所述引物組由若干個能擴增所述待測DNA中的目標基因的突變位點的引物對組成；步驟2、中，所述用熒光物質標記步驟1)得到的PCR擴增產物包括如下步驟 向步驟1)得到的PCR擴增產物中加入突變型特異性引物和與所述突變型特異性引物對應的熒光物質標記的dNTP或ddNTP，進行單堿基延伸反應，得到標記熒光物質的產物；所述突變型特異性引物與所述突變位點相鄰20-2^p的序列互補，且所述突變型特異性引物的3'末端核苷酸與所述突變位點的突變型核苷酸互補；所述突變型特異性引物對應的熒光物質標記的dNTP或ddNTP與所述突變位點相鄰的堿基互補；所述突變位點相鄰的堿基為位于所述突變型特異性引物延伸方向下游的一個堿基；每一條所述突變型特異性引物及其對應的所述熒光物質標記的dNTP或ddNTP對應一個突變位點；所述突變型特異引物的條數和所述熒光物質標記的dNTP或ddNTP的個數均與所述目標基因中的突變位點的個數相同；每一個所述熒光物質標記的dNTP或ddNTP的熒光物質的熒光顏色不同； 步驟幻中，所述將步驟幻得到標記熒光物質的產物與上述式(I)的化合物反應包括如下步驟將步驟幻得到標記熒光物質的產物與上述式(I)的化合物混勻，得到反應產物；所述觀察反應產物的顏色確定所述待測DNA中的目標基因的突變位點為 若反應產物的顏色與熒光物質標記的dNTP或ddNTP的熒光物質顏色相同，則所述待測 DNA的目標基因含有或候選含有與所述dNTP或ddNTP互補的堿基相鄰的突變位點；若反應產物的顏色與熒光物質標記的dNTP或ddNTP的熒光物質顏色不同，則所述待測DNA的目標基因不含有或候選不含有與所述dNTP或ddNTP互補的堿基相鄰的突變位點； 所述熒光物質具體為熒光素、德克薩斯紅或Cy3。
3.如權利要求1或2所述的方法，其特征為 步驟1)中，所述引物組為如下的任一一種1)所示的引物組由引物對A和引物對B組成；2)所示的引物組由引物對C、引物對D和引物對E組成；3)所示的引物組由引物對F和引物對G組成； 所述引物對A由引物1和引物2組成，所述引物對B由引物3和引物4組成， 所述引物對C由引物5和引物6組成， 所述引物對D由引物7和引物8組成， 所述引物對E由引物9和引物10組成， 所述引物對F由引物11和引物12組成， 所述引物對G由引物13和引物14組成， 所述引物1-14的核苷酸序列依次為序列表中的1-14 ；步驟2、中，所述突變型特異性引物及其對應的熒光物質標記的dNTP或ddNTP和對應的突變位點分別為如下1)-3)中任一一種1)、所述突變型特異性引物由引物組H和引物組I組成；所述引物組H由引物15和引物16組成；所述引物組I由引物17和引物18組成； 所述引物15對應的熒光物質標記的dNTP或ddNTP為德克薩斯紅標記的dATP，其對應的突變位點為E545K ；所述引物16對應的熒光物質標記的dNTP或ddNTP為熒光素標記的dUTP，其對應的突變位點為H1047R ；所述引物17對應的熒光物質標記的dNTP或ddNTP為德克薩斯紅標記的dATP，其對應的突變位點為EMI；所述引物18對應的熒光物質標記的dNTP或ddNTP為熒光素標記的dUTP，其對應的突變位點為H1047L ；2)所述突變型特異性引物為所述引物組J，所述引物組J由引物19-21組成；所述引物19對應的熒光物質標記的dNTP或ddNTP為熒光素標記的ddUTP，其對應的突變位點為185delAG ；所述引物20對應的熒光物質標記的dNTP或ddNTP為德克薩斯紅標記的ddATP，其對應的突變位點為5382insC ；所述引物21對應的熒光物質標記的dNTP或ddNTP為Cy3標記的ddGTP，其對應的突變位點為6174delT ；3)所述突變型特異性引物為所述引物組K和/或所述引物組L，所述引物組K由引物 22和引物23組成；所述引物組L由引物M和引物25組成；所述引物22對應的熒光物質標記的dNTP或ddNTP為德克薩斯紅標記的dATP，其對應的突變位點為34G > A ；所述引物23對應的熒光物質標記的dNTP或ddNTP為熒光素標記的dCTP，其對應的突變位點為38G > A ；所述引物M對應的熒光物質標記的dNTP或ddNTP為熒光素標記的dUTP，其對應的突變位點為35G > A ；所述引物25對應的熒光物質標記的dNTP或ddNTP為德克薩斯紅標記的dATP，其對應的突變位點為V600E ；所述引物15-25的核苷酸序列為序列表中的序列15-25 ；步驟3)中，所述反應為混勻；所述觀察反應產物的顏色是在紫外燈下進行。
4.如權利要求1-3中任一所述的方法，其特征為 步驟1)所述多重PCR擴增的退火溫度均為60°C ； 步驟幻中，所述單堿基延伸反應的退火溫度均為60°C ；在步驟1)和步驟2~)之間，還包括如下步驟將步驟1)得到的PCR擴增產物進行核酸外切酶I和磷酸水解酶消化，得到消化產物；在步驟幻和步驟幻之間，還包括如下步驟將步驟幻得到標記熒光物質的產物進行堿性磷酸酶消化，得到消化產物。
5.如權利要求1-4中任一所述的方法，其特征為所述待測DNA是癌細胞、癌組織、正常細胞或正常組織的基因組DNA ； 所述癌為結腸癌或乳腺癌。
6.一種檢測待測DNA中突變位點的引物，由引物組a、b、c組成；所述引物組a由權利要求3-5中任一所述方法中的所述1)所示的引物組、所述引物組 H和所述引物組I組成；所述引物組b由權利要求3-5中任一所述方法中的所述2、所示的引物組和所述引物組J;所述引物組c由權利要求3-5中任一所述方法中的所述幻所示的引物組、所述引物組 K和所述引物組L組成；所述引物組a、b、c為獨立包裝。
7.根據權利要求6所述的引物，其特征在于所述待測DNA是癌細胞、癌組織、正常細胞或正常組織的基因組DNA ； 所述癌為結腸癌或乳腺癌。
8.一種檢測待測DNA中突變位點的反應試劑，由試劑al-cl和試劑a2_c2組成， 所述試劑al由所述1)所示的引物組、DNA聚合酶、dNTPs和PCR擴增緩沖液組成； 所述試劑bl由所述2、所示的引物組、DNA聚合酶、dNTPs和PCR擴增緩沖液組成； 所述試劑cl由所述幻所示的引物組、DNA聚合酶、dNTPs和PCR擴增緩沖液組成； 所述1)- 所示的引物組中的各條引物在所述試劑al-cl中的終濃度均為200nM ； 所述試劑a2由所述引物組H、熒光素標記的dUTP、德克薩斯紅標記的dATP、DNA聚合酶和反應緩沖液組成或由所述引物組I、熒光素標記的dUTP、德克薩斯紅標記的dATP、DNA聚合酶和反應緩沖液組成；所述引物組H或所述引物組I中的各條引物在所述試劑a2中的終濃度均為1 μ M ； 所述試劑1^2由所述引物組J、熒光素標記的ddUTP、德克薩斯紅標記的ddATP和Cy3標記的ddGTP和反應緩沖液組成；所述引物組J中的各條引物在所述試劑1^2中的終濃度均為1 μ M ；所述試劑c2由所述引物組K、熒光素標記的dUTP、德克薩斯紅標記的dATP和反應緩沖液組成或由所述引物組L、熒光素標記的dCTP、德克薩斯紅標記的dATP和反應緩沖液組成；所述引物組K或所述引物組L中的各條引物在所述試劑c2中的終濃度均為1 μ M ； 所述待測DNA是癌細胞、癌組織、正常細胞或正常組織的基因組DNA ； 所述癌為結腸癌或乳腺癌。
9.一種檢測待測DNA中突變位點的試劑盒，由試劑盒1-3組成； 所述試劑盒1包括所述試劑al和所述試劑a2 ；所述試劑盒2包括所述試劑bl和所述試劑1^2 ； 所述試劑盒3包括所述試劑cl和所述試劑c2 ； 所述試劑盒中的各物質均為獨立包裝。
10.根據權利要求9所述的試劑，其特征在于所述待測DNA是癌細胞、癌組織、正常細胞或正常組織的基因組DNA ； 所述癌為結腸癌或乳腺癌。
全文摘要
本發明公開了一種可視的多個基因突變位點同時檢測的方法。本發明提供了一種檢測或輔助檢測待測DNA中突變位點的方法，包括以下步驟1)以待測DNA為模板進行多重PCR擴增，得到PCR產物，2)用熒光物質標記步驟1)得到的PCR擴增產物，得到標記熒光物質的產物；3)將步驟2)得到標記熒光物質的產物與上述式(I)的化合物反應，觀察反應產物的顏色確定所述待測DNA中的目標基因的突變位點；本發明的實驗證明，本發明利用少量DNA就能夠檢測到多個基因的多個位點的突變情況，對于癌癥的用藥指導和早期診斷具有重要意義。
文檔編號C12Q1/68GK102382892SQ20111036999
公開日2012年3月21日 申請日期2011年11月18日 優先權日2011年11月18日
發明者宋金召, 楊瓊, 王樹 申請人:中國科學院化學研究所