專利名稱：一種與致病力相關的稻瘟菌基因及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及植物病害防治領域，更具體地，本發明涉及一種與稻瘟菌(Magnaporthe grisea)致病力相關的與酵母、人類等生物尿卟啉原脫羧酶基因同源性較高的基因，即MgURO-D基因。本發明還涉及該基因在植物病害防治中的應用以及作為用于植物病害防治的藥物的靶標的應用。
背景技術：
由稻瘟菌(Magnaporthe grisea)引發的稻瘟病，是栽培水稻最嚴重的病害，每年所造成的水稻產量損失達到10％到30％。除了水稻，這種絲狀真菌還可以侵染許多禾本科的其它種類，例如小麥、穆子等作物(Ekwamu，1991；Igarashi et al.，1986)。它是通過一種特化的侵染結構—附著胞，侵入到植物細胞中去的。附著胞是一種圓頂狀、細胞壁黑色素化的細胞，由萌發的分生孢子受疏水表面誘導發育而成(Dean，1997)，它可以通過快速的甘油積累而產生巨大的膨壓(de Jong，1997)，并憑借該膨壓所產生的機械壓力侵入水稻葉片表皮。侵染菌絲在寄主葉片細胞內生長迅速，幾天內便可以觀察到梭形病斑出現。如果稻瘟病發生在秧苗期，會嚴重影響生長及產量，更有甚者，會導致秧苗死亡。
稻瘟菌為絲狀真菌，常見形態為單倍體，有性世代屬子囊菌亞門，因為適用于各種經典及現代分子遺傳學操作，所以可以作為一種模式物種來研究真菌與寄主植物的相互作用。稻瘟菌菌株70-15的基因組草圖及相關分析，最近剛剛報道。全基因組估計約有40.3Mb，測序工作已達到7倍以上的覆蓋率，38.8Mb的序列已經獲得(Dean et al.，2005)。基因組序列可以從因特網上免費獲得，這為該領域的研究者提供了揭示這一具有破壞性的絲狀病原真菌致病機理并制定相應對策的巨大契機。
與傳統的轉化方法相比，根癌農桿菌介導的轉化(Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation，ATMT)具有諸多優點。該方法操作簡便；無論是經過隨機插入還是依靠同源重組，轉化效率均高；分生孢子、菌絲都可以用作轉化的初始材料，從而避開了繁瑣的原生質體制備過程；用ATMT方法獲得的轉化子中，T-DNA單拷貝插入幾率高，這為進一步研究所觀察到的轉化子表型與T-DNA標定基因的相關性提供了便利；T-DNA在染色體上的插入近乎是隨機的；不能被T-DNA標定的突變所占比例低；所獲得的轉化子表型與T-DNA共分離比率高。基于上述優點，無論是通過定點靶向的替換突變方式，還是通過隨機的插入突變方式對真菌進行系統突變研究，ATMT方法都是一個非常有價值的轉化工具(Caroline et al.，2005)。因此，我們采用了這一方法。
URO-D(EC4.1.1.37)是亞鐵血紅素(heme)合成途徑中催化第五步反應的酶。亞鐵血紅素能參與諸多細胞功能，在依賴于氧的生命活動中，亞鐵血紅素是一種發揮重要作用的物質；許多與氧結合、氧化傷害防御以及電子傳遞等功能相關的蛋白，都以亞鐵血紅素作為輔基(prosthetic group)；亞鐵血紅素還可以通過特定轉錄調控因子的活性來調控基因的表達(Laura，2004)。因此，亞鐵血紅素在生物體中是一種很重要的物質。
在進化過程中，亞鐵血紅素的合成途徑是非常保守的(Wyckoff et al.1996)。亞鐵血紅素的合成，從甘氨酸和琥珀酰輔酶A起始，共包括八步酶促反應(見附圖1)，URO-D以二聚體(dimer)的形式催化第五步反應，將尿卟啉原III(uroporphyrinogen III)轉化為卟啉原III(coproporphyrinogenIII)(見附圖2)。該反應發生在細胞質中，無需輔因子參與，URO-D催化從底物的乙酸側鏈上依次脫去四個羧基，同時形成以下中間產物七羧基卟啉原(hepta-carboxyporphyrinogen)，六羧基卟啉原(hexa-carboxyporphyrinogen)，以及五羧基卟啉原(penta-carboxyporphyrinogen)(Rytka et al.，1984)。在人體中，由于遺傳或其它原因而導致的URO-D酶活性下降，會發生一種最為常見的卟啉癥(porphyries)遲發性皮膚卟啉癥(porphyria cutanea tarda，PCT)(Nordmann and Puy，2002)。URO-D酶活性顯著下降會導致人體水溶性卟啉的大量積累，在有光的條件下會被激活生成活性氧，進而損害皮膚。小鼠中該酶活性下降也會導致類似的癥狀，該基因的純合突變在早期小鼠胚胎中是致死的(Johm D.Phillips et al，2001)。用于研究人類PCT疾病的模型(model)已經分別在斑馬魚和小鼠上建立起來(Han Wang，1998；Johm，Phillips et al，2001)。
人類URO-D的晶體結構已經在分辨率為1.60的基礎上得以確定(見附圖3)。該蛋白分子量為40.8kDa，僅一個功能域(domain)，由一個(β/α)8-barrel結構組成，該結構帶有一個由折疊桶股(the barrel strands)羧基末端的環(loop)組成的深的活性位點裂縫(active site cleft)。許多保守殘基成簇集中在這一裂縫側鏈上固定不變的Arg37，Arg41，His339等殘基，可能與底物結合有關；而Asp86，Tyr164，Ser219等殘基，除可能與底物結合有關外，還可能參與催化反應。在溶液中，URO-D以二聚體形式存在，且趨向于形成晶體。二聚體將各單體的活性位點裂縫組裝并列在一起，這表明兩個催化中心的相互作用在發揮酶的催化功能時是起重要作用的(Frank et al，1998)。
在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，URO-D由基因HEM12編碼而成，該基因通過分別互補(complementation)等位的hem12和hem6突變體菌株而獨立克隆得到(Garey et al.1992；Diflumieri et al.1993)。釀酒酵母基因HEM12的兩個單倍體突變體菌株hem6-1B(點突變)和BY4742Δhem12-1A(缺失突變)，在不含血紅素(hemin)的培養基上不能生長，菌落形成紅色熒光，而且為甲硫氨酸營養缺陷型(methionineauxotrophy)。KlHEM12，則為編碼另一酵母，克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)中URO-D的基因，也已被克隆。該基因可以互補釀酒酵母的兩個突變體hem6-1B和BY4742Δhem12-1A，使其表型得以恢復。二級結構預測表明，該蛋白符合人類URO-D所報道的(β/α)8-barrel結構(Frank G.et al，1998)；基因KlHEM12被突變的克魯維酵母單倍體菌株，在不添加血紅素(hemin)的培養基上生長緩慢，由于積累卟啉，菌落形成紅色熒光。研究表明，該基因的轉錄并不受亞鐵血紅素或者葡萄糖所抑制，而被不可發酵碳源所輕微誘導(Laura N.et al，2004)。
在玉米中，URO-D基因的雜合突變體Les22，表現一種類病變壞死表型(lesion mimic)，在葉片上出現微小的、灰白或褐色的、點狀的壞死斑，光照會促進壞死的形成。編碼URO-D的基因突變導致URO-D活性下降，使其反應的前體尿卟啉原III積累，光照使其能量或電子傳給分子氧，成為活性氧，由此造成葉片細胞的損害(Hu et al.，1998)。
發明內容
本發明從已建立的稻瘟菌T-DNA插入群體中，選取一株致病力顯著下降的突變體-M230進行研究，序列分析表明，T-DNA插在編碼尿卟啉原脫羧酶(uroporphyrinogen decarboxylases，URO-D)基因起始密碼子的上游180bp處；該基因含有1104bp的開放閱讀框，編碼367個氨基酸，命名為MgURO-D，含4個內含子，5個外顯子，跟酵母、人類等生物的URO-D基因比對，存在較高的同源性；構建了一個用于互補的真菌表達載體pCMgURO-D，該表達載體可以使M230恢復致病力，這表明，MgURO-D出人意料地與稻瘟菌的致病力密切相關。
因此，本發明的一個目的是提供一種來自稻瘟菌(Magnaporthe grisea)的與酵母、人類等生物尿卟啉原脫羧酶基因同源性較高的基因，即MgURO-D基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
本發明還涉及由SEQ ID No.1所編碼的氨基酸序列，如SEQ ID No.2所示。
本發明還涉及含有上述基因的表達載體。在一個優選實施方案中，含有MgURO-D基因的所述表達載體為pCMgURO-D。根據布達佩斯條約，含有該表達載體pCMgURO-D的大腸桿菌已經于2005年11月29日保藏于中國北京中關村中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物保藏中心(CGMCC)，保藏號為CGMCC No.1548。
本發明還涉及含有上述表達載體的微生物宿主。所述宿主可以是大腸桿菌或農桿菌。
本發明另一個目的是提供上述基因在植物病害防治中的應用。所述植物病害特別是由稻瘟菌導致的稻瘟病。
本發明還有一個目的是提供所述的基因作為用于植物病害防治的藥物的靶標的應用。所述植物病害特別是由稻瘟菌導致的稻瘟病。
本發明還提供一種治療由稻瘟菌導致的植物稻瘟病的方法，包含阻斷或抑制稻瘟菌中MgURO-D基因的表達(例如利用該基因的反義RNA以及siRNA等)。
在本發明的另一方面，提供阻斷或抑制上述基因的表達的藥劑(如該基因的反義RNA以及siRNA等)在制備藥物中的應用，所述藥物用于控制由稻瘟菌導致的植物稻瘟病。
本研究表明，URO-D對稻瘟菌的致病性是至關重要的，MgURO-D基因由于T-DNA插入啟動子區而導致表達受到抑制時，突變體菌株的致病力顯著下降，病斑在水稻葉片上很難擴展，而將含該基因的表達載體pCMgURO-D轉入后，致病力則得以恢復，可見，該突變體菌株在侵入水稻葉片后，因不能有效抵御寄主防御反應而致使侵染菌絲的生長受到抑制。
圖1所示為酵母中亞鐵血紅素的合成途徑(http://db.yeastgenome.org/cgi-bin)；圖2所示為URO-D催化的脫羧反應(John D.et al，2001)；圖3所示為人類URO-D二聚體的立體結構(Frank G.et al，1998)；圖4所示為M230突變體菌株T-DNA的插入拷貝數檢測(Southern印跡分析，所選用限制性內切酶分別為A.EcoR I；B.Pst I)；圖5所示為T-DNA在突變體菌株M230中的插入部位；圖6所示為MgURO-D基因結構(深黑色為外顯子，而灰色為內含子)；圖7所示為不同生物URO-D蛋白氨基酸序列比對(三角符號表示與結合底物或者發揮催化功能密切相關的殘基，實心三角()表示數據源于人體，而空心三角()則表示數據來源于酵母)；圖8所示為URO-D蛋白系統進化樹；圖9所示為用于構建表達載體pCMgURO-D的序列；圖10所示為pCMgURO-D真菌表達載體圖譜；圖11所示為不同菌株致病力比較(接種水稻品種日本晴的稻瘟菌菌株從左至右依次為水，M230，轉入表達載體pMgURO-D的M230菌株，Y34)。
圖12所示為突變體菌株M230中T-DNA插入部位的側翼序列(注斜體部分為T-DNA右邊界序列，下劃線部分則為突變體菌株M230基因組序列)。
圖13所示為突變體菌株M230與Y34在V8液體培養基中的生長狀況比較。
具體實施例方式
下文將參考實施例詳細描述本發明，所述實施例僅是意圖舉例說明本發明，而不是意圖限制本發明的范圍。本發明的范圍由后附的權利要求具體限定。
實施例1.MgURO-D基因T-DNA插入突變體的獲得該突變體是通過根癌農桿菌介導的轉化法(ATMT)(Caroline et al.，2005)獲得的。
1.1農桿菌的培養挑取含有質粒pBHt2(Mullins，2001)的根癌農桿菌菌株Agl-1(Mullins，2001)單菌落，基本培養基(MM；Hooykaas et al.，1979)，50ug/ml卡那霉素，10ug/ml利福平，250rpm，28℃振蕩培養48h；4000rpm，離心5分鐘，棄上清，誘導培養基(IM；Bundock et al.，1995)重懸，4000rpm離心5分鐘，棄上清；IM(含300uM乙酰丁香酮)培養基重懸，28℃，250rpm振蕩搖菌6h。
1.2稻瘟菌孢子的獲得本研究選用自中國云南田間分離的致病菌株-Y34(中國農業大學提供)作為研究對象；將菌絲接種到含50ug/ml四環素，100ug/ml鏈霉素的燕麥培養基(OMA；燕麥50g/L)上；28℃暗培養5～7天，待菌落基本長滿培養皿時，用三角刮棒將表面菌絲刮去，連續光照再培養3天，便可見灰色的孢子層出現；用IM液體培養基刮取，Miracloth(CALBIOCHEMR，USA)過濾收集孢子，顯微鏡觀察，利用血球計數器調節孢子濃度為1×106/ml。
1.3農桿菌與稻瘟菌孢子共培養及轉化子篩選將在IM液體培養基中預先誘導6小時的農桿菌菌液和稻瘟菌孢子液等體積混合，加入AS，使終濃度達到500uM，混勻，然后按250～350ul/皿，均勻涂抹在鋪有微孔濾膜的IM培養基上，28℃黑暗培養48h；共培養完畢后，用無菌水刮取慮膜表面收集轉化孢子，每皿約加水2～3ml，分別均勻涂到3～6個燕麥培養基(含200ug/ml潮霉素，50ug/ml四環素，100ug/ml鏈霉素)上，潮霉素用于篩選轉化子，其它抗生素用于抑止農桿菌。3～5天后挑取擴展的菌落到含有同樣抗生素的燕麥培養基上。
1.4轉化子的純化及保存按上述方法獲得的轉化子，在連續光照下培養7～10天產孢；用接種針蘸取孢子液在燕麥培養基上劃線，28℃黑暗培養一天半后，挑取單菌落到含有潮霉素的燕麥培養基上，三天后觀察生長狀況，并加入已滅過菌的干燥濾紙片，7～10天后收集帶有孢子、菌絲的濾紙片，裝入已滅過菌的紙袋中，37℃干燥3～5天后，放干燥器保存備用。
1.5接種感病水稻葉片，檢測所獲得轉化子的致病表型接種實驗在網室進行。選用對稻瘟菌菌株Y34感病的水稻品種日本晴(中國科學院遺傳與發育研究所提供)，兩葉到三葉期接種，從播種開始計算，大約生長14～16天。為獲得接種用孢子液，將已純化的轉化子接種到燕麥培養基上，28℃黑暗培養6～8天，三角刮棒刮去表面菌絲，連續光照三天，無菌水(含0.3％土溫-20)收集孢子，Miracloth過濾，鏡檢，用血球計數器調節孢子濃度為0.5×106/ml。接種采用噴霧法，用真空泵或者香水瓶，將上述孢子液均勻細密地噴到葉片上，每次接種設正對照(Y34野生型)和負對照(含土溫-20的無菌水)。接種完畢，置黑暗處，保溫(25～30℃)，保濕(相對濕度90％以上)24小時，然后取出，置于水池中，保溫(18～32℃)，保濕(60～90％)。一周后記錄并分析發病情況。根據以上方法，得到一個致病力顯著減弱的突變體，代號為M230，用該菌株接種葉片后，病斑少，且在發病早期便停止擴展，因此病斑很小。M230在燕麥培養基、完全培養基(CM)、V8番茄汁等固體培養基(Camplell soup公司，美國。用超純水將離心上清按4∶1稀釋)上生長均正常，但在V8番茄汁液體培養基中震蕩培養，生長量則顯著下降(見附圖13)，這表明該突變菌株對氧氣的利用效率有所降低；與Y34相比較，菌落形態、分生孢子形態及數量沒有差異，在附著孢形成率，現狀，大小，黑色素沉淀，膨壓大小方面差異也不顯著。
2.T-DNA在致病突變體M230基因組中插入拷貝數及插入部位的分析2.1M230菌株基因組DNA的提取稻瘟菌轉化子菌絲接種到燕麥培養基上，28℃，培養4～7天，用V8番茄汁液體培養基，收集菌絲體，置于50ml離心管中，定容到15～20ml上述V8培養基(含75ug/ml潮霉素，50ug/ml四環素，100ug/ml鏈霉素)，28℃，250rpm振蕩培養2～4天。然后，用Miracloth真空過濾菌絲體，并用滅菌去離子水沖洗兩次，吸去菌絲體殘存液體，置研缽中，加液氮研磨成粉末，基因組DNA提取參照文獻報道的方法(吳志紅，2001)。1％瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量，并根據與標準品λDNA的亮度對比，進行定量。
2.2Southern blot分析檢測突變體中T-DNA插入拷貝數各吸取1ug基因組DNA置兩管中，分別加入10單位的PstI和EcoRI限制性內切酶和5ul 10X緩沖液，加無菌重蒸水至總體積為50ul，37℃酶切過夜，在1％瓊脂糖凝膠上以40V電壓電泳分離DNA。DNA的轉膜，引物標記及雜交反應均參照《分子克隆》(Sambrook et al.，1989)，選用T-DNA內潮霉素抗性基因的一部分作為探針，以HPTa，HPTb為引物(序列見表1)，以pBHt2質粒DNA為模板，通過PCR擴增反應獲得，該片段長度約為800bp，用α-32P-dCTP和Ready To Go DNA標記試劑盒(Promega，美國)進行標記。Southern blot分析表明，致病突變體M230菌株為單拷貝T-DNA插入(見附圖4)。
表1普通PCR所用引物
2.3分析T-DNA在突變體菌株M230基因組中的插入部位插入部位采用熱不均一交錯聚合酶鏈式反應(TAIL-PCR)結合測序進行分析。TAIL-PCR反應所需引物(見表2)及擴增流程皆參照E.D.Mulling(2001)等人所述方法進行。第三步擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，擴增條帶用凝膠回收試劑盒(申能博彩公司，上海)回收，并連接到pGEM-Teasy載體上，然后測序(博亞公司，北京)(序列見圖12)。將得到的序列到稻瘟菌基因組測序網站(www.broad.mit.edu/annotation/fungi/magnaporthe/index.html)進行比對，分析結果表明，M230突變體菌株中，T-DNA插入在已注釋基因MG01622.4上游啟動子區，距離起始密碼子約180bp(見附圖5)。注釋表明，該基因具有URO-D功能域(Domain)，為-URO-D基因，因此命名為MgURO-D。
表2TAIL-PCR反應所需引物
3.MgURO-D基因的相關分析該基因為單拷貝(從測序網站分析得知)，位于I號染色體，全長1497bp(包括內含子)，與存放在NCBI網站中的稻瘟菌EST序列進行比較發現，幾條EST序列相互銜接，可以覆蓋整個編碼區，內含子與外顯子分布情況，見附圖6。取該基因的氨基酸序列到NCBI網站作Blast p，發現與其它生物尤其是與其它真菌相比較，該基因具有很高的同源性，見表3。將各種生物體的URO-D氨基酸序列放在一起，進行多序列比較發現，在催化活性部位的氨基酸殘基都是保守的，見附圖7。URO-D進化樹見附圖8。
表3MgURO-D蛋白與其它生物來源URO-D蛋白同源性比較
緊接URO-D催化的反應之后，卟啉原氧化酶(coproporphyrinogenoxidase)催化亞鐵血紅素合成途徑的第六步反應。對在不同條件下建立的EST庫(網站http://cogeme.ex.ac.uk/transcript.html)進行比較分析發現，以生長在水稻細胞壁為唯一碳源培養基上的菌絲為材料構建的EST庫中，編碼卟啉原氧化酶的基因的EST數量極顯著地高于七個其它材料的EST庫中該基因的EST數量(比如以生長在基本或者完全培養基上的菌絲為材料建立的EST庫等)。由此可見，亞鐵血紅素合成途徑在侵入水稻葉片的稻瘟菌中是非常活躍的，該途徑對稻瘟菌在寄主體內的生存以及擴展是至關重要的。
4.突變體M230的互補實驗4.1MgURO-D基因真菌表達載體的構建用于表達載體構建的質粒為pSULFgrp(Ane Sesma，2004)，MgURO-D基因片段由PCR擴增獲得(引物見表1)。除包含整個編碼區外，擴增產物還包括起始密碼子上游1.1Kb及中止密碼子下游0.5Kb，共3.2Kb，序列見附圖9。在引物MgURO-DF和MgURO-DR的5’端分別有一個XbaI和EcoRI限制性酶切位點(斜體、下劃線表示)。寡聚核苷酸引物由上海博亞生物公司合成，以Y34基因組DNA為模板，在含有1x擴增緩沖液，0.2uM/L擴增引物，0.2mM/L dNTPS，0.5單位高保真DNA聚合酶(Stratagene公司)的50uL擴增體系中進行PCR擴增反應。擴增條件為94℃預變性3分鐘，94℃變性50秒，60℃退火50秒，72℃延伸3分30秒，循環30次，72℃再延伸8分鐘，擴增產物運行1％瓊脂糖凝膠電泳，條帶膠回收如前所述，與pGEM-T easy載體16℃連接過夜，取2ul連接產物電擊轉化大腸桿菌DH10B感受態細胞(Invitrogen，美國)，在含x-gal和IPTG的LB培養基(含100ug/ml氨卞青霉素)固體培養基上挑取白色菌落，經質粒提取，限制性內切酶分析，確定連接成功后，將該轉化子交生物公司(三博遠志，北京)測序，SEQ ID No.1。用XbaI、EcoRI限制性內切酶酶切該轉化子的質粒，并與XbaI、EcoRI限制性內切酶酶切的pSULFgfp雙元載體的大片段連接，電擊轉化大腸桿菌DH10B感受態細胞，在含50ug/ml卡那霉素的LB固體培養基上挑取菌落，經質粒提取，酶切分析后確定為轉化子，命名為pCMgURO-D，圖譜見附圖10。將該載體電擊轉化到根癌農桿菌(A.Tumefaciens)Agl-1菌株中，經卡那霉素篩選，質粒分析證明其結構完全正確后，即可用于稻瘟菌轉化。
4.2突變體菌株M230的互補轉化用含有載體pCMgURO-D的農桿菌AGL-1菌株轉化稻瘟菌突變體M230菌株的方法如前所述，不同之處在于共培養后的篩選培養基用DCM(Sweigard)，抗生素則換為除草劑氯嘧磺隆(100ug/ml)(德地得農化產品營銷公司，北京)，轉化子長出后，將其轉入含同樣除草劑的培養基上再篩選一次，然后轉入燕麥培養基(200ug/ml潮霉素；100ug/ml鏈霉素，50ug/ml四環素)，連續光照產孢，經劃線純化后，濾紙片收集，干燥保存備用。
4.3轉化子的PCR檢測取2～4ng稻瘟菌轉化子基因組DNA作為擴增模板，在含有1X擴增緩沖液，0.2uM/L擴增引物MgURO-DF2和MgURO-DR2(在MgURO-D基因內部，分別位于T-DNA插入位點兩側，序列見表1)，0.2mM/LdNTPs，0.5單位TaqDNA聚合酶的20ul擴增體系中進行PCR擴增反應。擴增條件為94℃預變性3分鐘，94℃變性50秒，60℃退火50秒，72℃延伸5分鐘，循環30次。取6ul擴增反應混合物，運行1％的瓊脂糖凝膠電泳。預期擴增片段有兩條，大小分別為4Kb，1.7Kb，電泳結果表明，接近50％(10/21)的轉化子與預期相符，即兩條帶均擴出，其余則只有4Kb條帶。由于除草劑氯嘧磺隆抗性基因ILV1是從稻瘟菌中克隆的，因此pCMgURO-D進入稻瘟菌后可能會發生同源重組，雖然仍能抗氯嘧磺隆除草劑，但用于互補的基因片段卻遭丟失，因此，只能擴增出含有T-DNA的4Kb基因片段。
4.4接種感病水稻葉片，檢測致病力從上述所獲得的PCR結果與預期相符的十個轉化子中隨機挑取5個，培養，產孢，用于致病力檢測，方法同上。結果表明，5個轉化子的致病力，均與野生型Y34相近(見附圖11)，可見互補成功。由此可以得出結論，M230致病力之所以顯著下降，是由于T-DNA插在MgURO-D基因上游啟動子區，影響其表達引起的。
從本實施例可以看出，本發明要求保護的基因的失活直接導致稻瘟菌致病力的下降。因此，本發明要求保護的基因可以用于植物病害防治，特別是由稻瘟菌所導致的稻瘟病。另外，本發明要求保護的基因可以作為開發用于植物病害防治的藥物的靶標。本領域技術人員可以根據本說明書的教導和啟示，開發用于防治植物病害、特別是稻瘟病的藥物。
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序列表<110>中國科學院微生物研究所<120>一種與致病力相關的稻瘟菌基因及其應用<130>IB056407<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1104<212>DNA<213>Magnaporthe grisea<400>1atgggtcata ctttcgagcc actcaaaaac gacctggtta tcaggactgc ctggggccaa60aaagtcgaga gaccaccaat atggatcatg agacaggctg gccggtactt gcccgagtat120catgaggcca agggcaacag agactttttc gagtgctgtc gcgacccaga ggtggcctcc180accctgactc tacagcccat cgaccgcttc gatggcctgc ttgacgcctc catcatcttc240tccgacattc ttgtcatccc ccaggccatg ggcatggtcg ttgagatggt cgacaagaag300ggcccgcact tcccaaaccc ccttcagtcg cccgacgatg gccagtacgc cgaggtgctc360gcgcgggatg tggacgtctc caaggagctg gactacgtct acaaggccat caccctgacc420cgtaagaagc ttcagggccg agtgccgctc attggcttct gcggtgctcc ctggaccctg480ttctgctaca tggtcgaggg tggtggcacc aagctcttca tccagagcaa gaaatggata540ttcaggcatc ccgaggagag caagaagatg ctgcaaaaga tcgccgagct ctgcgtcgag600tatctcgccc tgcaggttca ggccggagca cagcttgtcc aagtctttga ctcttgggca660ggagagctct ctcctgcatc cttcgagcag ttttctgctc cttacctgcg ctatatttcg720gaaaacctcc cgaaaaggct caaggagctg agtctggatc ccgtcccaat gattgttttc780cccaagggtg cctggttcgc cctggaggat tgctgcgcca tgggttacaa cgtcgttggg840ctcgattggc tctacagtcc tgccaaggcc aaccaggtcc gaggagatcg ggaaatcgtc900ctgcagggca acgccgaccc tggagtgctc tacggcacta aggatgccat tacagctgct960gtcaaggaca tggttgaagg atttgactgg aaggagaaga agaagggctg gatagtaaac1020ctgggccacg gaattacacc gctcgtcaac ccggacgacc tgaagtttta tctgcaggag1080atccacagac aaaccaaaga ctag 1104
<210>2<211>367<212>PRT<213>Magnaporthe grisea<400>2Met Gly His Thr Phe Glu Pro Leu Lys Asn Asp Leu Val Ile Arg Thr1 5 10 15Ala Trp Gly Gln Lys Val Glu Arg Pro Pro Ile Trp Ile Met Arg Gln20 25 30Ala Gly Arg Tyr Leu Pro Glu Tyr His Glu Ala Lys Gly Asn Arg Asp35 40 45Phe Phe Glu Cys Cys Arg Asp Pro Glu Val Ala Ser Thr Leu Thr Leu50 55 60Gln Pro Ile Asp Arg Phe Asp Gly Leu Leu Asp Ala Ser Ile Ile Phe65 70 75 80Ser Asp Ile Leu Val Ile Pro Gln Ala Met Gly Met Val Val Glu Met85 90 95Val Asp Lys Lys Gly Pro His Phe Pro Asn Pro Leu Gln Ser Pro Asp100 105 110Asp Gly Gln Tyr Ala Glu Val Leu Ala Arg Asp Val Asp Val Ser Lys115 120 125Glu Leu Asp Tyr Val Tyr Lys Ala Ile Thr Leu Thr Arg Lys Lys Leu130 135 140Gln Gly Arg Val Pro Leu Ile Gly Phe Cys Gly Ala Pro Trp Thr Leu145 150 155 160Phe Cys Tyr Met Val Glu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Phe Ile Gln Ser165 170 175Lys Lys Trp Ile Phe Arg His Pro Glu Glu Ser Lys Lys Met Leu Gln180 185 190Lys Ile Ala Glu Leu Cys Val Glu Tyr Leu Ala Leu Gln Val Gln Ala
195 200 205Gly Ala Gln Leu Val Gln Val Phe Asp Ser Trp Ala Gly Glu Leu Ser210 215 220Pro Ala Ser Phe Glu Gln Phe Ser Ala Pro Tyr Leu Arg Tyr Ile Ser225 230 235 240Glu Asn Leu Pro Lys Arg Leu Lys Glu Leu Ser Leu Asp Pro Val Pro245 250 255Met Ile Val Phe Pro Lys Gly Ala Trp Phe Ala Leu Glu Asp Cys Cys260 265 270Ala Met Gly Tyr Asn Val Val Gly Leu Asp Trp Leu Tyr Ser Pro Ala275 280 285Lys Ala Asn Gln Val Arg Gly Asp Arg Glu Ile Val Leu Gln Gly Asn290 295 300Ala Asp Pro Gly Val Leu Tyr Gly Thr Lys Asp Ala Ile Thr Ala Ala305 310 315 320Val Lys Asp Met Val Glu Gly Phe Asp Trp Lys Glu Lys Lys Lys Gly325 330 335Trp Ile Val Asn Leu Gly His Gly Ile Thr Pro Leu Val Asn Pro Asp340 345 350Asp Leu Lys Phe Tyr Leu Gln Glu Ile His Arg Gln Thr Lys Asp355 360 36權利要求
1.一種來自稻瘟菌(Magnaporthe grisea)的與酵母、人類等生物尿卟啉原脫羧酶基因同源性較高的基因，即MgURO-D基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.由SEQ ID No.1所編碼的氨基酸序列，如SEQ ID No.2所示。
3.含有根據權利要求1所述的基因的表達載體。
4.根據權利要求3的表達載體，其為pCMgURO-D。
5.含有根據權利要求3或4的表達載體的微生物宿主。
6.權利要求1所述的基因在植物病害防治中的應用，所述植物病害特別是由稻瘟菌導致的稻瘟病。
7.權利要求1所述的基因作為用于植物病害防治的藥物的靶標的應用，所述植物病害特別是由稻瘟菌導致的稻瘟病。
8.一種治療由稻瘟菌導致的植物稻瘟病的方法，包含阻斷或抑制稻瘟菌中MgURO-D基因的表達。
9.阻斷或抑制權利要求1所述基因的表達的藥劑在制備藥物中的應用，所述藥物用于控制由稻瘟菌導致的植物稻瘟病。
全文摘要
本發明涉及一種與酵母、人類等生物尿卟啉原脫羧酶URO－D基因同源性較高的稻瘟菌基因，命名為MgURO－D，該基因編碼367個氨基酸，含4個內含子，5個外顯子。本發明還涉及含有該基因的表達載體和宿主以及該基因在植物病害(特別是稻瘟病)防治中的應用以及作為用于植物病害防治的藥物的靶標的應用。
文檔編號C12N15/52GK1982464SQ20051012649
公開日2007年6月20日 申請日期2005年12月14日 優先權日2005年12月14日
發明者何朝族, 李桂華 申請人:中國科學院微生物研究所