專利名稱：無血清動物細胞培養基及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種生物技術領域，是一種不存在動物源物質血清情況下，生產下游產品的無血清動物細胞培養基制備方法。
背景技術：
無血清培養基是一種不需要動物血清的人工合成培養基，它可避免動物血清在細胞培養過程中帶來的污染和血清中不明成分對培養結果造成不確定影響。中國專利申請號2004100184938公開了一種無血清動物細胞培養基，該專利公開的技術成品為粉末型便于運輸，特別為配合有血清下游產品銜接操作而設計的方法，但是，其存在著血清與培養基雙成本；血清對環境污染大，后續處理成本高；使用血清后對培養結果產生一定概率的不確定因素的缺陷，因此必須進行改進，最好的辦法是避免使用血清，而本專利方法可使生產無血清培養基時減低成本便于操作，從而使得在低成本代價下產生高效益。以滿足有關部門的需要。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種無血清動物細胞培養基及其制備方法，以克服現有技術存在的缺陷，滿足有關部門的需要。
本發明的無血清動物細胞培養基，由A部分和B部分組成，以無血清動物細胞培養基的總重量為基準，A部分和B部分的組分和重量份數包括A部分基礎培養基1000份丙酮酸鈉 22份谷胱甘肽 0.1份硫酸鋅·7H2O 0.1732份維生素C 0.01132份硫酸亞鐵·7H2O 0.26份檸檬酸三鈉 0.26份維生素B120.272份次黃嘌呤 0.06份硫辛酸 0.0412份L-丙氨酸 1.78份L-門冬氨酸 2.64份L-谷氨酸 2.94份甘氨酸 1.5份L-脯氨酸 2.3份L-絲氨酸 2.1份L-門冬酰胺 2.64份B部分必需脂肪酸 0.01682份痕量元素A1份痕量元素B1份痕量元素C1份痕量元素D1份維生素E 0.02份膽固醇 0.04份鹽酸丁二胺 0.04份生物素 0.001466份吐溫80 1份L-丙氨酸-谷氨酰胺 120份。
所說的基礎培養基選自上海旭太生物工程有限公司產的MEM(α)或GlasgowMEM(上海旭太生物工程有限公司產的MEM(G))；MEM(α)的組成和制備方法在文獻stanners，N.P；Eliceiri，G.L；Green，HNature New Biology 230 52-54(1971)中已經有公開的報道，可采用市售產品，如上海旭太生物工程有限公司旭字牌MEM(α)的產品；GlasgowMEM的組成和制備方法在House，WMedical ResearchCouncil，Institute of Visology University of Glasgow Scotland November1964文獻中已經有公開的報道，可采用市售產品，如上海旭太生物工程有限公司牌號為MEM(G)的產品；所說的必需脂肪酸選自上海旭太產旭字牌必需脂肪酸M；所說的痕量元素A選自上海旭太產旭字牌痕量元素A；痕量元素B選自上海旭太產旭字牌痕量元素B；痕量元素C選自上海旭太產旭字牌痕量元素C；痕量元素D選自上海旭太產旭字牌痕量元素D；生物素選自市售D生物素。
優選的A部分和B部分的組分和重量份數包括A部分基礎培養基 1000份丙酮酸鈉 22份谷胱甘肽 0.1份硫酸鋅·7H2O 0.1732份維生素C 0.01132份硫酸亞鐵·7H2O 0.26份檸檬酸三鈉 0.26份維生素B120.272份次黃嘌呤 0.06份硫辛酸 0.0412份L-丙氨酸 1.78份L-門冬氨酸 2.64份L-谷氨酸 2.94份甘氨酸 1.5份L-脯氨酸 2.3份L-絲氨酸 2.1份L-門冬酰胺 2.64份B部分必需脂肪酸 0.01682份痕量元素A1份痕量元素B1份痕量元素C1份痕量元素D1份維生素E 0.02份膽固醇 0.04份鹽酸丁二胺 0.04份生物素 0.001466份吐溫80 1份L-丙氨酸-谷氨酰胺120份。
本發明的無血清動物細胞培養基的制備方法，包括如下步驟a.按照比例，將A部分的原料在60～80℃下真空干燥18～30小時；B部分的原料在30～50℃真空干燥18～30小時；b.將干燥后的A部分原料球磨2～4小時，然后過30～50目篩成為固態粉末狀中間體；c.將B部分原料與A部分原料混合，球磨2～4小時，可采用市售雙頭2缸球磨機，然后過30～50目篩，獲得產品。
本發明的無血清動物細胞培養基可以用于動物細胞的培養，優選的動物細胞為BHK21細胞或Vero細胞，所說的BHK21細胞為一種細胞是制造口蹄疫疫苗的重要細胞株，農業部第336號公告(2004年)，豬口蹄疫O型滅活疫苗質量標準為“O型口蹄疫疫豬源病毒需接種在BHK-21細胞之中。可采用市售產品，如中國科學院細胞庫提供的產品，所說的Vero細胞為一種綠猴腎細胞，可采用市售產品，如中國科學院細胞庫公司提供的產品。
本發明的無血清動物細胞培養基用于動物細胞的培養時，培養基方法如下一例按比例配成重量濃度為1.1～1.36％的水溶液；將原有有血清培養細胞換上不含小牛血清的無血清培液洗滌1～2次，加入不含小牛血清的培液，培養2～3天(此時可接種病毒)，倒出培液；再加不含小牛血清的無血清培液，繼續培養2～3天，此時細胞培養在無血清培養中成長。
本發明的無血清動物細胞培養基用于培養動物細胞，與有血清下游產品銜接較好，根據技術監督局批準的企業標準Q/TOSC-2003的規程來檢驗產品經培養細胞一般從1～5×104經三天培養后達到1×106，在無血清階段細胞數量達到1×106能夠滿足有關部門的需要。
具體實施例方式
實施例中，基礎培養基MEM的組分和重量份數含量采用參考文獻stanners，N.P；Eliceiri，G.L；Green，HNature New Biology 23052-54(1971)公開的技術；GlasgowMEM組分和重量份數含量采用參考文獻House，WMedical Research Council，Institute of Visology University ofGlasgow Scotland November 1964.均采用上海旭太生物有限公司的市售產品，實施例1～2BHK21細胞無血清培養基(粉末)實施例1實施例2A組 單位g A組 單位gMEM 500 GlasgowMEM 500丙酮酸鈉11丙酮酸鈉 11谷胱甘肽0.05 谷胱甘肽 0.05硫酸鋅·7H2O0.0866硫酸鋅·7H2O 0.0863維生素C 0.00566 維生素C 0.00566硫酸亞鐵·7H2O 0.13 硫酸亞鐵·7H2O 0.13檸檬酸三鈉 0.13 檸檬酸三鈉 0.13維生素B12 0.0136維生素B120.0136次黃嘌呤0.03 次黃嘌呤 0.03硫辛酸 0.0206硫辛酸 0.0206L-丙氨酸 0.89L-門冬氨酸 1.32L-谷氨酸 1.47
甘氨酸 0.75L-脯氨酸 1.15L-絲氨酸 1.05L-門冬酰胺 1.32B組 單位g B組 單位g必需脂肪酸*0.00841 必需脂肪酸*0.00841痕量元素A*0.5 痕量元素A*0.5痕量元素B*0.5 痕量元素B*0.5痕量元素C*0.5 痕量元素C*0.5痕量元素D*0.5 痕量元素D*0.5維生素E 0.01維生素E 0.01膽固醇 0.02膽固醇 0.02鹽酸丁二胺 0.02鹽酸丁二胺 0.0161生物素 0.000733生物素 0.000733吐溫80 0.5 吐溫80 0.5L-丙氨酸-谷氨酰胺 60實施例1中，所說的必需脂肪酸選自上海旭太產旭字牌必需脂肪酸M；所說的痕量元素A選自上海旭太產旭字牌痕量元素A；痕量元素B選自上海旭太產旭字牌痕量元素B；痕量元素C選自上海旭太產旭字牌痕量元素C；痕量元素D選自上海旭太產旭字牌痕量元素D；生物素選自市售D生物素。
實施例2中，所說的必需脂肪酸選自上海旭太產旭字牌必需脂肪酸M；所說的痕量元素A選自上海旭太產旭字牌痕量元素A；
痕量元素B選自上海旭太產旭字牌痕量元素B；痕量元素C選自上海旭太產旭字牌痕量元素C；痕量元素D選自上海旭太產旭字牌痕量元素D；生物素選自市售D生物素。
制備方法a.按照比例，將A部分的原料在70℃下真空干燥24小時；B部分的原料在45℃真空干燥24小時；b.將干燥后的A部分原料球磨3小時，然后過40目篩成為固態粉末狀中間體；c.將B部分原料與A部分原料混合，球磨3小時，可采用市售雙頭2缸球磨機，然后過40目篩，獲得產品。
實施例3～4Vero細胞無血清培養基(粉末)實施例3實施例4A組 單位g A組 單位gDMEM 500 DMEM 500谷胱甘肽 0.05 谷胱甘肽 0.05硫酸鋅·7H2O0.0863 硫酸鋅·7H2O0.0863維生素C 0.011維生素C 0.00566檸檬酸三鈉 0.13 檸檬酸三鈉 0.13偏硅酸鈉 0.014維生素B120.0136維生素B120.0136 次黃嘌呤 0.03次黃嘌呤 0.03 硫辛酸 0.0206硫辛酸 0.0206 硫酸亞鐵·7H2O 0.13L-丙氨酸-谷氨酰胺60
B組 單位g B組單位g必需脂肪酸*0.016 必需脂肪酸*0.0084痕量元素A*0.5 痕量元素A*0.5痕量元素B*0.5 痕量元素B*0.5痕量元素C*0.5 痕量元素C*0.5痕量元素D*0.5 痕量元素D*0.5維生素E 0.001 維生素E0.001膽固醇0.02 膽固醇 0.02鹽酸丁二胺0.0161鹽酸丁二胺 0.0161生物素0.000733 生物素 0.000733吐溫800.5 吐溫80 0.5硫酸亞鐵·7H2O 0.13實施例3中，所說的必需脂肪酸選自上海旭太產旭字牌必需脂肪酸M；所說的痕量元素A選自上海旭太產旭字牌痕量元素A；痕量元素B選自上海旭太產旭字牌痕量元素B；痕量元素C選自上海旭太產旭字牌痕量元素C；痕量元素D選自上海旭太產旭字牌痕量元素D；生物素選自市售D生物素。
實施例4中，所說的必需脂肪酸選自上海旭太產旭字牌必需脂肪酸M；所說的痕量元素A選自上海旭太產旭字牌痕量元素A；痕量元素B選自上海旭太產旭字牌痕量元素B；痕量元素C選自上海旭太產旭字牌痕量元素C；痕量元素D選自上海旭太產旭字牌痕量元素D；生物素選自市售D生物素。
制備方法同實施例1。
實施例5將1～5×104的BHK21細胞接種于2ml實施例1的培養基，然后在18～24℃下無菌培養48小時，采用Q/TOSC-2003企業標準規定以定量法的方法計數細胞，進行檢測，結果如下細胞形態飽滿，穩定；在所需生長周期內恰好完成生長數量任務。
由此可見，本發明的培養基工藝，具有使所生產的無血清培養基達到可用，穩定的效果。
實施例6將1～5×104的Vero細胞接種于2ml實施例4的培養基，然后在18～24℃下無菌培養培養48小時，采用Q/TOSC-2003企業標準規定以定量法的方法計數細胞，進行檢測，結果如下細胞形態飽滿，穩定；在所需生長周期內恰好完成生長數量任務。
由此可見，本發明的培養基本發明的培養基工藝，具有使所生產的無血清培養基達到可用，穩定的效果。
權利要求
1.一種無血清動物細胞培養基，其特征在于，由A部分和B部分組成，以無血清動物細胞培養基的總重量為基準，A部分和B部分的組分和重量份數包括A部分基礎培養基 1000份丙酮酸鈉 22份谷胱甘肽 0.1份硫酸鋅·7H2O 0.1732份維生素C0.01132份硫酸亞鐵·7H2O 0.26份檸檬酸三鈉 0.26份維生素B12 0.0544份次黃嘌呤 0.12份硫辛酸 0.0412份L-丙氨酸 1.78份L-門冬氨酸 2.64份L-谷氨酸 2.94份甘氨酸 1.5份L-脯氨酸 2.23份L-絲氨酸 2.1份L-門冬酰胺 2.64份B部分必需脂肪酸 0.01682份痕量元素A1份痕量元素B1份痕量元素C1份痕量元素D1份維生素E 0.02份膽固醇 0.04份鹽酸丁二胺 0.0322份生物素 0.001466份吐溫80 1份L-丙氨酸-谷氨酰胺120份。
2.根據權利要求1所述的無血清動物細胞培養基，其特征在于，所說的必需脂肪酸選自上海旭太產旭字牌必需脂肪酸M；所說的痕量元素A選自上海旭太產旭字牌痕量元素A；痕量元素B選自上海旭太產旭字牌痕量元素B；痕量元素C選自上海旭太產旭字牌痕量元素C；痕量元素D選自上海旭太產旭字牌痕量元素D；生物素選自市售D生物素。
3.根據權利要求1所述的無血清動物細胞培養基，其特征在于，優選的A部分和B部分的組分和重量份數包括A部分基礎培養基 1000份丙酮酸鈉22份谷胱甘肽0.1份硫酸鋅·7H2O0.1732份維生素C 0.01132份硫酸亞鐵·7H2O 0.26份檸檬酸三鈉 0.26份維生素B12 0.272份次黃嘌呤0.06份硫辛酸 0.0412份L-丙氨酸1.78份L-門冬氨酸 2.64份L-谷氨酸2.94份甘氨酸 1.5份L-脯氨酸2.3份L-絲氨酸2.1份L-門冬酰胺 2.64份B部分必需脂肪酸 0.01682份痕量元素A 1份痕量元素B 1份痕量元素C 1份痕量元素D 1份維生素E 0.02份膽固醇 0.04份鹽酸丁二胺 0.04份生物素 0.001466份吐溫80 1份L-丙氨酸-谷氨酰胺 120份。
4.根據權利要求3所述的無血清動物細胞培養基，其特征在于，優選的A部分和B部分的組分和重量份數包括A部分基礎培養基 1000份丙酮酸鈉 22份谷胱甘肽 0.1份硫酸鋅·7H2O 0.1732份維生素C0.01132份硫酸亞鐵·7H2O 0.26份檸檬酸三鈉 0.26份維生素B12 0.272份次黃嘌呤 0.06份硫辛酸 0.0412份L-丙氨酸 1.78份L-門冬氨酸 2.64份L-谷氨酸 2.94份甘氨酸 1.5份L-脯氨酸 2.3份L-絲氨酸 2.1份L-門冬酰胺 2.64份B部分必需脂肪酸 0.01682份痕量元素A 1份痕量元素B 1份痕量元素C 1份痕量元素D 1份維生素E0.02份膽固醇 0.04份鹽酸丁二胺 0.04份生物素 0.001466份吐溫80 1份L-丙氨酸-谷氨酰胺 120份。
5.根據權利要求1～4任一項所述的無血清動物細胞培養基，其特征在于，動物細胞為BHK21細胞或Vero細胞。
6.制備權利要求1～5任一項無血清動物細胞培養基的方法，包括如下步驟a.按照比例，將A部分的原料在60～80℃下真空干燥18～30小時；B部分的原料在30～50℃真空干燥18～30小時；b.將干燥后的A部分原料球磨2～4小時，然后過30～50目篩成為固態粉末狀中間體；c.將B部分原料與A部分原料混合，球磨2～4小時，可采用市售雙頭2缸球磨機，然后過30～50目篩，獲得產品。
全文摘要
本發明公開了一種無血清動物細胞培養基及其制備方法。無血清培養基是一種不需要動物血清的人工合成培養基，它可避免動物血清在細胞培養過程中帶來的污染和血清中不明成分對培養結果造成不確定影響。本發明公開的技術成品為粉末型便于運輸，特別為配合有血清下游產品銜接操作而設計的方法，但是，其存在著血清與培養基雙成本；血清對環境污染大，后續處理成本高；使用血清后對培養結果產生一定概率的不確定因素；的缺陷，因此必須進行改進，最好的辦法是避免使用血清，而本發明方法可使生產無血清培養基時減低成本便于操作，從而使得在低成本代價下產生高效益。
文檔編號C12N5/06GK101033458SQ200610024459
公開日2007年9月12日 申請日期2006年3月7日 優先權日2006年3月7日
發明者徐俊杰, 徐斌 申請人:上海旭太生物工程有限公司