涉及植物半矮化的sd1基因和其應用的制作方法

專利名稱：涉及植物半矮化的sd1基因和其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及分離和鑒定植物半矮化的基因和利用該基因的植物半矮化。
背景技術：
1956年在Taiwan，新的稻品種臺中本地1號(Taichung Native 1)獲得了在常規的秈稻品種中觀察不到的高產量，臺中本地1號由當地半矮化品種低腳鳥尖(Dee-geo-woo-gen)和抗病菜園品種(Tsai-yuang-chung)雜交育成。在1960年后期，相同的半矮化品種低腳鳥尖和印度尼西亞優質長稈(long-culm)稻品種(Peta)于菲律賓國際水稻研究所(IRRI)雜交育成。由于其顯著改進了單位面積的產量，所以將該半矮化品種[IR8]稱作“奇跡稻(miracle rice)”。“奇跡稻”播種的日益擴大拯救了亞洲的食物危機并且也引起了“綠色革命”。臺中本地1號和IR8對高產貢獻的基因是源于低腳鳥尖的半矮化基因sd1。然而，時至今日，僅僅確定了sd1基因的大致染色體基因座(Maeda等，Breeding Science47317-320，1997)。
一般而言，植物，尤其是有用的農業作物例如水稻，如果想增加它們的產量則必須在非常肥沃的條件(即富集氮的條件)下種植。然而，在這種條件下植株會變得非常高使得其受臺風等影響易于倒伏，結果是降低產量。解決該問題的一種方法是矮化植株并將它們在豐富的肥料條件下培養。sd1基因僅稍稍矮化植株，并沒有因此而降低分蘗數和谷粒大小，或降低種子數。其還可以在豐富的肥料條件下抑制植物倒伏并改進株型。在這種情形下，sd1基因使表型不同于那些已知的矮化基因d1和d61所誘導的表型(Ashikari M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，9610284-10289，1999；YamamuroC.等，Plant Cell，121591-1605，2000)。這種抗倒伏的改善使得植物能在肥沃的條件下種植；同樣地，植株型的改善增強物質的生產能力和同化產物向谷粒和種子的分配率。時至今日，利用這些特性，許多水稻品種，包括在世界范圍內有最大種植面積的IR64，已經通過回交被賦予了由sd1基因誘導的表型以育出新的水稻品種。
另一方面，隨著最近人口爆炸式的劇增，谷物產量需要進一步增加50％，因而迫切地需要培育出多種高產有用的作物品種。所以為了提高各種植物，特別是包括水稻(rice)的有用的農作物的產量，利用sd1基因誘導在肥沃條件下穩定地提高產量是有利的。然而，分離和鑒定包括水稻在內的植物的sd1基因尚未報道過。
發明公開本發明是在這些情況下進行的。本發明的目的是提供一種涉及植物半矮化的sd1基因。此外，本發明另一目的是提供一種使用sd1基因使植物半矮化的方法。
植物激素赤霉素(GA)涉及在許多生長進程，例如萌發，莖/葉的延伸，以及花芽的形成。GA合成途徑已經被詳細研究，并且編碼催化GA合成的酶的基因已經從擬南芥，水稻，玉米，南瓜等中分離出(Hedden和Kamiya，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.48431-460，1997)。在涉及GA合成或遺傳信息傳遞的基因變得異常時，植物不能將GA用于其生長，因而變得矮化。事實上，許多報道已經顯示缺乏涉及GA合成或遺傳信息傳遞的基因會產生矮化突變體(Hedden和Kamiya，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.48431-460，1997)。因此，本發明人推測GA涉及水稻的半矮化，并將GA應用于sd1突變的低腳鳥尖(Dee-geo-woo-gen)以檢測GA反應性。結果，使用GA導致低腳鳥尖(Dee-geo-woo-gen)莖/葉的延伸。此外，一種GA生物合成的酶，C20氧化酶，在GA生物合成途徑中催化下面的步驟GA53-GA44-GA19-GA20和GA12-GA15-GA24-GA9。現在C20氧化酶已經從南瓜，擬南芥和水稻中分離出來(Lange等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，918552-8556，1994；Phillips等，Plant physiol.1081049-1057，1995；Xu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，926640-6644，1995；Toyomasu等，Physiol.Plant.99111-118，1997)，并且據報道在擬南芥基因組中至少存在三種C20氧化酶基因(Phillips等，Plant Physiol.1081049-1057，1995)。
由此可見，本發明人推測sd1基因是涉及GA生物合成的基因，尤其是植物基因組中重復出現的C20氧化酶基因。如果如此，這就解釋了為什么水稻sd1基因不誘導植株型的顯著矮化。因此，本發明人意欲首先分離和鑒定了擬南芥C20氧化酶的水稻對應物(couterpart)。
結果，本發明人成功地分離和鑒定了一種新的水稻GA C20氧化酶基因。此外，本發明人又研究該基因的染色體座位是否接近水稻sd1座位，以及在水稻半矮化品種中是否該新的水稻GA C20氧化酶基因突變。結果發現該基因的染色體基因座非常接近于水稻sd1的基因座。此外在確定和比較一些包含低腳鳥尖(Dee-geo-woo-gen)和相應野生型的sd1突變體中GA C20氧化酶基因的核苷酸序列時，該GA C20氧化酶基因在所有的突變體中sd1發生突變。因此，第一次表明水稻sd1基因等同于編碼新的C20氧化酶的基因，暗示植物sd1基因(C20氧化酶基因)的突變會誘導植物的半矮化。
植物sd1基因可通過標記選擇而用于高效育種。在利用常規雜交育種來制備導入了sd1基因的品種時，例如在將sd1基因導入日本最廣泛種植的品種Koshihikari時，有必要通過將Koshihikari與IR64或具有sd1基因的品種雜交來制備F1，接著將F1與Koshihikari重復回交直至除了sd1基因座的所有染色體被Koshihikari的那些所取代。由于利用sd1基因作為分子標記允許人們有效地選擇具有僅被sd1基因取代的Koshihikari染色體的個體，因而分離sd1基因節省了育種所需的大量時間和勞動，而且，植物sd1基因可以允許使用分子生物學技術諸如反義和RNAi方法制備植物轉化體。還可預計提高有用農作物，包括谷物，諸如小麥，大麥，玉米，蔬菜和果樹的產量，而且通過矮化賦予觀賞植物，諸如觀葉植物(foliage plants)以美學價值，培育出新品種。
具體地，本發明涉及分離和鑒定植物半矮化的基因，和利用該sd1基因使植物半矮化，更具體的是提供下述的[1]用于半矮化植物的根據(a)到(c)中任一所述的DNA(a)編碼與植物sd1基因轉錄產物互補的反義RNA的DNA；(b)編碼具有特異切割植物sd1基因轉錄產物的核酶活性的RNA的DNA；和(c)編碼通過共抑制效果抑制植物sd1基因表達的RNA的DNA；[2][1]的DNA，其中所述植物sd1基因是水稻sd1基因；[3]包含[1]或[2]的DNA的載體； 保持[1]或[2]的DNA處于可表達狀態的轉化植物細胞；[5][4]的轉化植物細胞，其中所述植物是水稻；[6]包含[4]或[5]轉化植物細胞的植物轉化體；[7]一種植物轉化體，其是[6]的植物轉化體的后代或克隆；[8][6]或[7]植物轉化體，其中所述植物是水稻；[9][6]到[8]中任一植物轉化體的繁殖材料；[10]制備[6]到[8]中任一植物轉化體的方法，其中所述方法包括下述步驟將[1]或[2]的DNA導入植物細胞，以及從所述植物細胞再生植物體；[11]一種半矮化植物的方法，其中所述方法包括抑制植物細胞中內源sd1基因表達的步驟；[12][11]的方法，其中表達的抑制通過將[1]或[2]的DNA導入植物實現；[13][10]到[12]中任一項的方法，其中所述植物是水稻；和[14]編碼水稻sd1蛋白的DNA。
本發明揭示植物sd1基因的突變誘導植物半矮化。因此，在肥沃的條件下通過抑制植物sd1基因的表達有可能制備出能獲得穩定高產量的半矮化品種。
本發明所述的“植物半矮化”是指僅使植株的高度稍微矮化而沒有降低分蘗數，谷粒大小及種子數。通過這種半矮化，植株被賦予了在肥沃的條件下的抗倒伏性并且其植株型得以改善。結果，可以獲得穩定的高產量。
在本發明中所述“植物sd1基因”指的是編碼植物C20氧化酶的基因，并且包括水稻sd1基因(編碼SEQ ID NOs3和4的DNA)，擬南芥sd1基因(Phillips等，Plant physiol.1081049-1057，1995)，和源于其它植物的sd1基因。
可以利用雜交(Southern等，Journal of Molecular Biology 98503，1975)和聚合酶鏈式反應(PCR)(Saiki等，Science 2301350-1354，1985；Saiki等，Science 239487-491，1988)技術實施鑒定未知“植物sd1基因”。也就是，本領域的技術人員可以分離與來自其它目的植物的sd1基因高度同源的DNAs，并測定它們的序列，例如通過用水稻sd1基因的核苷酸序列(編碼SEQ IDNOs3和4的DNA)或其部分作為探針，或通過用與sd1基因的核苷酸序列特異雜交的寡核苷酸作為引物。
雜交反應通常在嚴謹條件下進行以分離所述DNA，嚴謹的雜交條件包括諸如下面的條件6M尿素，0.4％ SDS，0.5×SSC；和那些有類似嚴謹度的條件。分離具有更高同源性的DNAs可以通過更高嚴謹度條件下實施雜交而達到，例如，6M尿素，0.4％ SDS，和0.1×SSC。可以將分離的DNAs通過已知的方法測序。
是否所分離的DNA是編碼sd1蛋白的DNA通常可以通過序列間的同源性程度而判斷。使用諸如BLASTN(核酸序列水平)或BLASTX(氨基酸序列水平)的程序測定(Altschul等，J.Mol.Biol.215403-410，1990)。該程序基于Karlin和Altschul所述的算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-2268，1990；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5877，1993)。在根據BLASTN分析核苷酸序列時，參數設置為例如得分(score)＝100和字段長(word length)＝12。另一方面，為了通過BLASTX分析氨基酸序列，參數設置為例如得分＝50和字段長＝3。此外，在氨基酸序列使用Gapped BLAST程序分析時，分析可以按照Altschul等所述進行(Nucleic Acids Res.253389-3402，1997)。利用BLAST和Gapped BLAST程序時使用各程序的默認參數。這些分析方法的具體技術在本領域是已知的(見http//www.ncbi.nlm.nih.gov.)。
本發明中，并不對通過抑制sd1基因的表達而賦予半矮化性狀的植物進行具體限定。因此，任何植物可以被半矮化，盡管優選的是使用有用的農作物或觀賞植物。有用的農作物包括，例如，單子葉植物，諸如水稻，玉米，小麥和大麥，以及雙子葉植物諸如油菜，大豆，棉花，蕃茄，馬鈴薯。觀賞植物(ornamental plant)包括花卉植物，諸如菊花，玫瑰，康乃馨(carnation)，和仙客來(cyclamen)。
根據本發明的方法制備半矮化的植物是通過下述方法得到的將抑制sd1基因表達的DNA插入合適的載體，將該載體導入植物細胞，然后再生所得的轉化的植物細胞。術語“抑制sd1基因的表達”指的是抑制sd1基因轉錄和抑制翻譯成蛋白質。它還包括DNA表達的停止和這種表達的降低。
植物中特定內源基因的表達通過使用本領域技術人員普遍使用的反義技術的方法而得以抑制。Ecker等首先證實使用瞬時基因表達的方法通過電穿孔將反義RNA導入植物細胞的反義效果(Ecker和Davis(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 835372)。其后，據報道靶基因的表達通過表達反義RNAs而在煙草和矮牽牛花中降低(Krol等(1988)Nature 333866)。反義技術現在已經被確立為抑制植物中基因表達的一種方法。通過反義核酸多重因素導致靶基因表達受到抑制。這些包括由三鏈形成抑制轉錄的起始；在RNA聚合酶已經形成局部開放環結構的位點處形成雜交而抑制轉錄；與不斷繼續合成的RNA形成雜交而抑制轉錄；由在內含子和外顯子交接處形成雜交抑制拼接；由在剪接體形成的位點形成雜交抑制剪接；與mRNA形成雜交而抑制mRNA由核向細胞質的移動；在加帽位點或添加poly A的位點形成雜交而抑制拼接；對于翻譯起始因子在結合位點形成雜交而抑制翻譯的起始；在起始密碼子附近的核糖體結合位點形成雜交而抑制翻譯；在mRNA的翻譯區中或在多核糖體結合的位點形成雜交而抑制肽鏈的延長；和在核酸和蛋白質相互作用的位點形成雜交而抑制基因表達。這些因素通過抑制轉錄，剪接，和/或翻譯過程而抑制靶基因的表達(Hirashima和Inoue，“Shin Seikagaku Jikken Koza(New Biochemistry Experimentation Lectures)2，Kakusan(Nucleic Acids)IV，Idenshi No Fukusei To Hatsugen(Replication andExpression of genes)”，Nihon Seikagakukai(The Japanese Biochemical Society)(ed.)，Tokyo Kagaku Dozin，pp.319-347，(1993))。
因此，本發明的反義序列可以通過上述機制而抑制靶基因的表達。在一實施方案中，如果將反義序列設計成與接近該基因mRNA的5’末端的非翻譯區互補，將會有效地抑制基因的翻譯。還可能使用與編碼區或3’側非翻譯區互補的序列。因此，本發明所用反義DNA包括具有基因非翻譯區和翻譯區反義序列的DNA。將所要使用的反義DNA連接到合適啟動子的下游，并且，優選的是，將包含轉錄終止信號的序列連接到3’側。
基于SEQ ID NO3的DNA的序列信息，例如通過硫代磷酸法，制備反義DNA(Stein，Nucleic.Acid.Res.163209-3221，1988)。將所制得的DNA通過已知的方法轉染至目的植物。反義DNA的序列優選的是與要轉化的植物的內源基因或其部分互補的序列，然而并不需要100％的互補，只要其可以有效地抑制基因表達。轉錄RNA優選的是90％或更高，甚至是更優選的是95％或更高地與靶基因的轉錄產物互補。為了有效地通過反義序列抑制靶基因的表達，反義DNA應至少長為15個核苷酸甚至更長，優選的是100個核苷酸或更多，更優選的是500個核苷酸或更長。通常所用的反義DNA一般是短于5kb，更優選的是短于2.5kb。
編碼核酶的DNA可用于抑制內源基因的表達。核酶是指具有催化活性的RNA分子。RNA雖然具有各種核酶活性，但是對核酶作為切割RNA的酶的研究使得能夠設計特異切割RNA位點的目的核酶。而諸如I組內含子類型和包含于RnaseP中的MIRNA核酶可以是大的，具有400個核苷酸或更多，也有更小的，包括具有約40個核苷酸活性結構域的錘頭型和發夾型(Koizumi和Ohtsuka(1990)Tanpakushitsu Kakusan Kohso(Protein，Nucleicacid，and Enzyme)352191)。
錘頭型核酶的自我切割結構域在序列G13U14C15的3’側C15處切割。在U14和在第九位的A之間形成的核苷酸對被認為對于核酶的活性是重要的。而且，顯示當在第15位的核苷酸是A或U而不是C時，切割也可以發生(Koizumi等(1988)FEBS Lett.228225)。如果核酶的底物結合位點被設計為與靶位點臨近的RNA序列互補，可以生成能識別靶RNA內序列UC，UU或UA限制酶樣RNA切割核酶(Koizumi等(1988)FEBS Lett.239285；Koizumi和Ohtsuka(1990)Tanpakushitsu Kakusan Kohso(Protein，Nucleic acid，and Enzyme)，352191；Koizumi等(1989)Nucleic Acids Res.177059)。
發夾型核酶也可以用于本發明中。例如煙草環斑病毒衛星RNA負鏈中可以發現發夾型核酶(Buzayan(1986)Nature 323349)。該酶也顯示靶特異性地切割RNA(Kikuchi和Sasaki(1992)Nucleic Acids Res.196751；Kikuchi(1992)Kagaku To Seibutsu(Chemistry and Biology)30112)。
被設計用于切割靶的核酶與啟動子諸如花椰菜花葉病毒35S啟動子以及轉錄終止序列融合，以使得其在植物細胞中轉錄。然而，如果將額外序列添加到轉錄RNA的5’末端或3’末端，就會失去核酶活性。在這種情況下，可以將附加的修飾(trimming)的核酶，其是順式作用以進行在核酶部分5’側或3’側的修飾，從而自包含核酶的轉錄RNA精確地切割核酶部分(Taira等(1990)Protein Eng.3733；Dzaianott和Bujarski(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 864823；Grosshands和Cech(1991)Nucleic.Acids.Res.193875；Taira等(1991)Nucleic.Acid.Res.195125)。靶基因內的多位點可以通過將這些結構單元串聯而被切割以獲得更大的效果(Yuyama等，Biochem.Biophys.Res.Commun.1861271(1992))。使用這種核酶，就有可能特異地切割本發明靶基因的轉錄產物，從而抑制該基因的表達。
內源基因的表達也可通過共抑制，用與靶基因序列具有相同或相似序列的DNA進行轉化而得以抑制。“共抑制”指的是這種現象，其中將具有與靶內源基因序列具有相同或相似序列的基因通過轉化導入植物，導入的外源基因和靶內源基因的表達被抑制。盡管詳細的共抑制的機制還未被完全理解，然而其在植物中被經常觀察到(Curr.Biol.7R793，1997；Curr.Biol.6810，1996)。例如，如果希望獲得其中sd1基因被共抑制的植物體，所研究的植物體可用載體DNA進行轉化，所述載體DNA為被設計成表達sd1基因或具有類似序列的DNA，以在所得的植物中選擇具有sd1突變體特性的植物，即半矮化植物。用于共抑制的該基因不需要完全與靶基因相同，然而，其應該至少有70％或更多，優選80％或更多，更優選90％或更多(例如95％或更多)的序列同一性。
此外，本發明內源基因的表達也可通過用具有靶基因顯性陰性表型的基因轉化植物而得以抑制。具有顯性陰性表型的基因指的是通過基因表達，能夠消除或降低植物的野生型內源基因活性的基因。
本發明還提供包含能抑制上述內源基因表達的DNA的載體，保持該DNA在可表達狀態的轉化植物細胞，包含該轉化植物體細胞的植物轉化體，上述植物轉化體的后代的或克隆的植物轉化體，和植物轉化體的繁殖材料。
此外本發明涉及制備前述植物轉化體的方法，包括將能抑制內源基因表達的DNA導入植物細胞；自植物細胞再生植物體。
本發明的DNA可通過本領域已知的方法導入植物細胞，例如，農桿菌介導的轉移方法，電穿孔的方法和粒子轟擊的方法。
如上所述的農桿菌的方法，例如可以使用Nagel等的方法(Microbiol.Lett.67325，1990)。根據該方法，將重組載體轉化入農桿菌細胞，然后將轉化的農桿菌通過已知的方法例如葉盤法(leaf disk method)導入植物細胞。上述載體，例如，包括在其導入植物體后允許本發明的DNA在植物體中表達的啟動子。一般而言，本發明的DNA位于所述啟動子的下游，而且終止子位于該DNA的下游。本領域的技術人員可以根據轉化的方法和植物類型合適的選擇用于所述轉化的重組載體。前述啟動子包括例如，衍生自花椰菜花葉病毒的CaMV35S啟動子和玉米遍在蛋白的啟動子(未經審查的公開的日本專利申請(JP-A)Hei2-79983)。
此外，上述的終止子包括衍生自花椰菜花葉病毒的和煙堿合成酶基因的。然而，本發明并不限于此，在植物體中起功能的任何啟動子和終止子都可以應用。
此外，導入本發明DNA的植物體可以是外植體移植。或者，由這些植物培養的細胞，并且這種DNA可以被導入培養細胞。本文中，術語“植物細胞”包括，例如，來自葉，根，莖，花，以及種子中的盾片(胚盤)的植物細胞，愈傷組織，和培養細胞懸浮物。
而且，為了有效選擇通過導入本發明DNA轉化的植物細胞，上述重組載體優選包含合適的選擇標記基因，或優選和包含這種選擇標記基因的質粒一起導入植物細胞。本文所用的選擇標記基因，例如，對抗生素潮霉素有抗性的潮霉素磷酸轉移酶基因，對卡那霉素或慶大霉素有抗性的新霉素磷酸轉移酶基因，對除草劑膦絲菌素有抗性的乙酰轉移酶基因。
將導入了重組載體的植物細胞涂平板并在已知包含合適篩選藥物的選擇培養基中培養，所述藥物根據導入的選擇標記基因的種類而變化。結果，可以得到轉化植物培養細胞。
植物體由本發明DNA轉化的植物細胞而得以再生。依據植物細胞的類型用已知的方法實施植物體再生(Toki等，(1995)Plant Physiol.1001503-1507)。例如，轉化和再生水稻植株的方法包括(1)使用聚乙二醇將基因導入原生質體，并再生植物體(適合秈稻品種(indica))(Datta等，(1995)in“Gene Transfer To Plants”，Potrykus I and Spangenberg Eds.，pp66-74)；(2)使用電脈沖將基因導入原生質體，并再生植物體(適合粳稻品種(japonica))(Toki等(1992)Plant Physiol.1001503-1507)；(3)通過粒子轟擊將基因直接導入細胞，并再生植物體(Christou等(1991)Bio/Technology，9957-962)；和(4)使用農桿菌導入基因，并再生植物體(Hiei等(1994)PlantJ.6271-282)。這些方法已經得以確立并在本領域中廣泛利用。因此，這些方法可適合用于本發明中。
由轉化細胞再生的植物體然后在條件培養基上培養。當馴化的再生植物體隨后培養在通常的培養條件下時得到半矮化植物體，然后該植物體成熟并結實而形成種子。
本文中，所存在的導入的外源基因可以通過已知的PCR或Southern雜交方法，或通過植物體中DNA的核苷酸序列分析在已經如上再生并培養的植物轉化體中得以證實。
在這種情況下，根據已知的J.Sambrook等方法由植物轉化體進行DNA提取(Molecular Cloning，2nded，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。
在使用PCR方法分析存在于再生植物體的包含本發明DNA的外源基因時，使用如上所述自再生植物體提取的DNA為模板，實施擴增反應。而且，具有根據本發明DNA或由本發明修飾的DNA合適選出的核苷酸序列的合成寡核苷酸可以用作引物以在反應溶液中實施擴增反應，該反應溶液包括這種寡核苷酸混合物的反應溶液。在擴增反應中，包含本發明DNA序列的DNA片段擴增產物可通過重復DNA的變性，退火，和延伸反應幾十次而獲得。當包含擴增產物的反應溶液，例如，在瓊脂糖凝膠上電泳時，各種擴增的DNA片段被分級分離以證實所述DNA片段如何對應于本發明的DNA。
一旦獲得染色體中導入本發明DNA-的轉化的植物體，就有可能通過有性或無性繁殖(sexual or vegetative propagation)獲得該種植物體的后代。或者，植物可由該轉化植物以及其后代或克隆獲得的育種材料(例如種子，果實，穗(ears)，塊莖，塊根(tubercles)，單株(tubs)，愈傷組織和原生質體)而大規模制備。轉化了本發明DNA的植物細胞，包括這些細胞的植物體，這些植物體的后代和克隆，以及由這些植物獲得的育種材料，其后代和克隆，都包括在本發明中。
本發明中植物的半矮化可以如上所述通過抑制sd1基因的表達而誘導。由本發明方法制得的半矮化植物預計是有用的，例如作為農作物，其可以穩定提供高產量，以及賦予觀賞植物新的審美價值。
此外，本發明提供編碼水稻sd1蛋白的DNA。sd1 DNA可以用于促進植物生長，尤其是促進莖/葉的延伸。使用編碼水稻sd1蛋白的DNA制備植物轉化體可通過上述的方法實施。也就是，這種制備可以通過將所述DNA插入前述載體，將所得的載體導入植物細胞，由該轉化的植物細胞再生植物體而實施。而且，基于本發明編碼水稻sd1蛋白的DNA序列，可以制備出編碼反義RNA的DNA，編碼具有核酶活性的RNA的DNA，以及編碼具有共抑制效果的RNA的DNA等，用于抑制植物sd1基因的表達。由此制備的DNAs可用于誘導植物半矮化。
本發明的“水稻sd1蛋白”不僅包括SEQ ID NO4的蛋白而且包括與該蛋白功能等價的源于水稻的蛋白。這種蛋白包括人工制備的和水稻中內源存在的那些蛋白。本文中術語“功能等價的”表示目的蛋白具有GA合成的活性且在導入植物時具有莖/葉延伸的活性。這種蛋白包括根據SEQ ID NO4的蛋白的突變體，同系物和變體。
與水稻sd1蛋白功能等價的蛋白質可使用例如本領域技術人員已知的用于在蛋白質氨基酸序列中導入突變的定點誘變的方法(Ausubel等，CurrentProtocols in Molecular Biology edit.Publish.Jhon Wily & Sons Section 81-8.5，1987)]制備。此外，在自然界中由氨基酸突變產生(arising nature)的水稻內源蛋白質可基于SEQ ID NO3的DNA使用雜交技術，基因擴增技術(PCR)等進行分離。
具有SEQ ID NO4中取代，缺失，插入和/或添加了一個或多個氨基酸的氨基酸序列的蛋白質，被包括在本發明中，只要它們具有與水稻sd1蛋白相同的功能。蛋白中的突變數目通常是30個氨基酸或更少，優選是10個氨基酸或更少，更優選是5個氨基酸或更少(例如，3個氨基酸或更少)。然而，并不限制突變的數目和位點，只要該蛋白的功能能夠得以保持即可。就保持蛋白質功能方面，用于取代的氨基酸優選與要取代的氨基酸具有類似的性質。例如，由于Ala，Val，Leu，Ile，Pro，Met，Phe和Trp均歸類為非極性氨基酸，它們可能相互具有類似的性質。此外不帶電荷的氨基酸包括Gly，Ser，Thr，Cys，Tyr，Asn和Gln。而且，酸性氨基酸舉例為Asp和Glu，堿性氨基酸舉例為Lys，Arg和His。
本發明中，對編碼水稻sd1蛋白的DNAs類型并不具體限制，只要它們能夠編碼上述的蛋白；它們可以是基因組DNAs，化學合成的DNAs或cDNA，其形式不限。此外，本發明的DNAs包括具有那些基于遺傳密碼簡并性的任意核苷酸，只要它們能夠編碼水稻sd1蛋白。本發明編碼水稻sd1蛋白的DNAs可以如上述，通過使用諸如SEQ ID NO3的DNA序列或其部分作為探針的雜交技術和使用基于這所述DNA序列信息設計的引物的基因擴增方法(PCR)，進行分離。這些探針或引物可以由本領域技術人員利用已知技術根據編碼本發明水稻sd1蛋白的DNAs容易地制備。
附圖簡述

圖1是顯示低腳鳥尖(Dee-geo-woo-gen)，Calrose 76和黎明(Reimei)中sd1基因的突變位點的圖。
實施發明的最佳模式下文通過實施例更具體地描述了本發明。然而，然而本發明并不應被限制。
實施例1基于擬南芥C20氧化酶基因的序列，設計引物OsC20U(5’-ccgctcgccgagaagcgccg-3’/SEQ ID NO1)和OsC20L(5’-atgaaggtgtcgccgatgtt-3’/SEQ ID NO2)。利用日本晴(Nipponbare)水稻基因組DNA作為模板實施PCR，以分離水稻GA C20氧化酶基因。結果得到618bp的擴增產物，測序顯示其是新的水稻GA氧化酶基因。GAC20屬于2-氧化戊二酸依賴型雙加氧酶(2-ODD)家族，保留用于結合2-氧化戊二酸的功能必需結構域(NYYPXCXXP)。此外，GAC20還保留三個組氨酸殘基以結合Fe離子和涉及GA結合的LPWKET結構域。水稻GAC20基因顯示與擬南芥有50％的同源性。
實施例2使用BIL(1998；TAG 96997-1003，Mapping quantitative trait locicontrolling seed dormancy and heading date in rice，Oryza sativa L.，usingbackcross inbred lines.)對新的GAC20氧化酶基因的染色體基因座進行連鎖分析顯示該基因位于水稻第1染色體上約155cM。該基因座非常接近sd1基因座，事實很有力地暗示水稻C20氧化酶基因可能等同于sd1基因。
實施例3由野生型日本晴(Nipponbare)構建基因組文庫，利用噬菌斑雜交方法分離包含GAC20氧化酶基因的基因組克隆以測定該基因的全部核苷酸序列(SEQ ID NO3)。所推導出的GAC20氧化酶的氨基酸序列在SEQ ID NO4中顯示。
實施例4
測定在sd1突變體低腳鳥尖(Dee-geo-woo-gen)和相應的野生型鳥尖(Woo-gen)中的GAC20氧化酶基因的核苷酸序列作比較。由此，發現自第一外顯子到第二外顯子延伸的386bp的核苷酸序列在低腳鳥尖中缺失。還在其它sd1突變體中測定了GAC20氧化酶基因核苷酸序列。結果，在sd1突變體Calrose 76中，在第二外顯子中一個堿基(胞嘧啶)被胸腺嘧啶取代，并且在氨基酸水平上，亮氨酸被苯丙氨酸取代。類似地，在sd1突變體Reimei中，在第三外顯子中一個堿基(鳥嘌呤)改變為胞嘧啶，在氨基酸序列水平上，天冬氨酸被組氨酸取代(圖1)。
工業實用性本發明提供一種植物sd1基因和利用該基因的方法。本發明十分期望利用植物sd1基因能增加植物尤其是有用農業作物和觀賞植物的產量，通過矮化來增加觀賞作物的審美價值，并且通過標記選擇來提高矮化植物的產量并促進高效培育。
序列表<110>本田技研工業株式會社(HONDA MOTOR CO.，LTD.)<120>涉及植物半矮化的sd1基因和其應用<130>H3-A0101P<140>
<141>
<150>JP 2001-185128<151>2001-06-19<160>4<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成引物序列<400>1ccgctcgccg agaagcgccg 20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成引物序列<400>2atgaaggtgt cgccgatgtt 20<210>3<211>5575<212>DNA
<213>稻(Oryza sativa)<400>3gtatatttac tagttaacga catcatgtat taaaaatcgg aggaggtata gaagtatgtt 60ctcctttctt gtaaacatag gttgatctgt atatttgttt ttgtcttatt ttgttttttc 120attgatctca ccattaaaca ggtggcctcc aaaaatgcat gcagccatgt atcttcccag 180tccatgaaat taatcttgaa ttattataaa ttaaaaacat attaggattt gatatatgaa 240aggtataatg gtagcagatc tatcatagaa aacctataac acgtagatga ccgagtagag 300aaaaaagata tacccaacat aatcaagtac cttgttaatt agtaagaagt aagaaamcca 360tataaataca agcatttggg tgaagctaga atgggaacta tattaccatg tatcccatac 420atatctatta cgcacttaat acctgaatta ttcgtgtaac gaagaacatg ctttggtaaa 480aaataaaata tttggaccgt ataccatgcg gttatcgcag ttatcacgtg cggtaatatt 540ctcagttttt caaaccgcgg tataacttgc aataaccgcg tggttttcgc ggtaaccacc 600aaaccgtggg gctgtggtaa ccccacctaa aacgatttgg taaaccctag tcagagctag 660cttgatcgtg gctccgccct ctgcatctcc tcatggtcac aagatcaatt tagaacctct 720tataagctgt tgaaccatca gtactacagt cccaagatta acatattttt taaaatatca 780aaattgctca tgatgaattg attaccgttc atgtgcctgt atggtgcatg ggtggtatag 840tgcaccgtga cctgtactgt gctagatgtt ccttccaacc ttagtacttc acgaaaagga 900gaggaaccat ttccctgtca ccttcctgca acatggtcag gcataaacca aacacgatcg 960aagcgaatcg gcgataccac acaatagccg cgcgtcgcaa acaacaattc cgcggctagc 1020tacttccgac ctccgaaact actgcgagcc caagtgggta cggttttagt gcaaataggg 1080taagtcttgt ttacatcata tcggtttcat tttggtacac gaatggagaa gaaatgaaag 1140agatcgaaaa aaggaagagc tcgctgtgta tctgtctcgt aacagccccg gtgttacacg 1200tgctctaaga gagattaatt aaatcgataa gctaccagag gtttagtttt ccacgtgtta 1260attagattgg aaagcgagag aaattaaaaa tagcgagtaa aaatagagat aaccttattg 1320ctattttgtt ttttttccag caacaaactt atctttcagg ctagtttagg cgatcgctta 1380gattccgcat cgtccttttc actatttttt ttctgtcagt gacaatgtga aaatttattg 1440gacagacgac tagcttgtgg tactagctag gaaattccct atcctcgata tgaacaactt 1500actcaactca gtagagtagc aaatgcccaa gaaagcccga gtcaatctat ttggaaatcc 1560aatctatttt ctcgtattcg tgtgggaaat caagctatac tagttgaaat tcaccggaag 1620aaatgcacgg cacttcaata taccaaaatt gcaaaggaga atcattcgat taacagtgga 1680attcaaccaa gaaatgaaaa ggtatatata ggaaatgcac tccaaccacc aaccaataag 1740tgattccggg caatcaattc tatccgcgag ttgtgggtct gttcagattc attatattag 1800aacgcgtcac gtaatggatg gagtattata caacaccatt ggttttgcca ctagtgttaa 1860ctctaataca tgggggttag ttttaccttt aaacttggtc taaaaggatg gacatatggc 1920aatgcaattg catgggggtc attgattcga ccatcatgtc tgtccagtgg caaccccctc 1980cctcatcccc tgtggtgggc cccccacggc gctcgtcttc tcccctgtta caaatacccc 2040accctcctgc ccagacagct cgccctgcac acacacacac actcacactc acacacgctc 2100tcaactcact cccgctcaac acagcgctca cttctcatct ccaatctcat ggtggccgag 2160caccccacgc caccacagcc gcaccaacca ccgcccatgg actccaccgc cggctctggc 2220attgccgccc cggcggcggc ggcggtgtgc gacctgagga tggagcccaa gatcccggag 2280ccattcgtgt ggccgaacgg cgacgcgagg ccggcgtcgg cggcggagct ggacatgccc 2340gtggtcgacg tgggcgtgct ccgcgacggc gacgccgagg ggctgcgccg cgccgcggcg 2400caggtggccg ccgcgtgcgc cacgcacggg ttcttccagg tgtccgagca cgggcgtcga 2460
cgccgctctg gcgcgcgccg cgctcgacgg cgccagcgac ttcttccgcc tcccgctcgc 2520cgagaagcgc cgcgcgcgcc gcgtcccggg caccgtgtcc ggctacacca gcgcccacgc 2580cgaccgcttc gcctccaagc tcccatggaa ggagaccctc tccttcggct tccacgaccg 2640cgccgccgcc cccgtcgtcg ccgactactt ctccagcacc ctcggccccg acttcgcgcc 2700aatggggtaa ttaaaacgat ggtggacgac attgcatttc aaattcaaaa caaattcaaa 2760acacaccgac cgagattatg ctgaattcaa acgcgtttgt gcgcgcagga gggtgtacca 2820gaagtactgc gaggagatga aggagctgtc gctgacgatc atggaactcc tggagctgag 2880cctgggcgtg gagcgaggct actacaggga gttcttcgcg gacagcagct caatcatgcg 2940gtgcaactac tacccgccat gcccggagcc ggagcggacg ctcggcacgg gcccgcactg 3000cgaccccacc gccctcacca tcctcctcca ggacgacgtc ggcggcctcg aggtcctcgt 3060cgacggcgaa tggcgccccg tcagccccgt ccccggcgcc atggtcatca acatcggcga 3120caccttcatg gtaaaccatc tcctattctc ctctcctctg ttctcctctg cttcgaagca 3180acagaacaag taattcaagc ttttttttct ctctcgcgcg aaattgacga gaaaaataag 3240atcgtggtag gggcggggct ttcagctgaa agcgggaaga aaccgacctg acgtgatttc 3300tctgttccaa tcacaaacaa tggaatgccc cactcctcca tgtgttatga tttatctcac 3360atcttatagt taataggagt aagtaacaag ctactttttt catattatag ttcgtttgat 3420tttttttttt taaagttttt ttagttttat ccaaatttat tgaaaaactt agcaacgttt 3480ataataccaa attagtctca tttagtttaa tattgtatat attttgataa tatatttatg 3540ttatattaaa aatattacta tatttttcta taaacattat taaaagccat ttataatata 3600aaatggaagg gagtaattaa tatggatctc ccccgacatg agaatatttt ccgatggtgt 3660gacgacgcca tgtaagcttc ggtgggcctg gacggccaga ggtgccaaca gccacgtcca 3720acaacccctg ggtccccccc taacactcca aacagtagtg agtagtgtct cgtcgcgttt 3780tagtatttga tgacaaacaa agtgtgagtt gagttagcca ccaccaactt gcacacgagc 3840acatacattt gtgtccattc tcgccagtca cttccatctc tagtcctaac tcctatctag 3900cgatgtaagc ggataatttc atcatccgta tataaacctg tttgttatag ttaatttcct 3960atataatact ataacagtat acattttaaa agaaaacaaa attaggataa acaggccctg 4020ctcctatcca tccatggcac ttggaaggac cagactcggt catgccatgc caagccaaga 4080tatgggttat ggaagagtag agaagaggag agatgagaga taagcatgcg ttctcctcct 4140cgttggatgt gtattttgga gggatttgtg tagtagtagc agcggcgccg cggggacgga 4200tgcggatggt ggcgctttcg gtggcgtttt cccggggggg ttttggtttg gcgcttgggg 4260gggatggcat ggcgcggcgt gcggctgcac gccacacaca cgcgcgcgca cgcacgtacg 4320tcgtcgtcgc cgcgggcgga cggtagctta gggtggtgtg ttccgcgcgc gggcgcggat 4380tgttccatgc cgatcgattt ggcgccaccc tcgccgcggc tcttgtcgcg tcgtgcgcct 4440ctctcgcgcg gtttgtcctt gtcgcgttgc tcagccggcg acgggggcac ggacattggc 4500gatgtagccc tgcacgtgtc ggcctctccg ttgatgaatg atgatgtatg tatgtatttt 4560tttttgtctg aaggaatttg tggggaattg ttgtgtgtgc aggcgctgtc gaacgggagg 4620tataagagct gcctgcacag ggcggtggtg aaccagcggc gggagcggcg gtcgctggcg 4680ttcttcctgt gcccgcggga ggacagggtg gtgcggccgc cgccgagcgc cgccacgccg 4740cagcactacc cggacttcac ctgggccgac ctcatgcgct tcacgcagcg ccactaccgc 4800gccgacaccc gcacgctcga cgccttcacg cgctggctcg cgccgccggc cgccgacgcc 4860gccgcgacgg cgcaggtcga ggcggccagc tgatcgccga acggaacgaa acggaacgaa 4920cagaagccga tttttggcgg ggcccacgcc cacgtgaggc cccacgtgga cagtgggccc 4980gggcggaggt ggcacccacg tggaccgcgg gccccgcgcc gccttccaat tttggaccct 5040accgctgtac atattcatat attgcaagaa gaagcaaaac gtacgtgtgg gttgggttgg 5100
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Phe His Asp Arg Ala Ala Ala Pro Val Val Ala Asp Tyr Phe Ser Ser165 170 175Thr Leu Gly Pro Asp Phe Ala Pro Met Gly Arg Val Tyr Gln Lys Tyr180 185 190Cys Glu Glu Met Lys Glu Leu Ser Leu Thr Ile Met Glu Leu Leu Glu195 200 205Leu Ser Leu Gly Val Glu Arg Gly Tyr Tyr Arg Glu Phe Phe Ala Asp210 215 220Ser Ser Ser Ile Met Arg Cys Asn Tyr Tyr Pro Pro Cys Pro Glu Pro225 230 235 240Glu Arg Thr Leu Gly Thr Gly Pro His Cys Asp Pro Thr Ala Leu Thr245 250 255Ile Leu Leu Gln Asp Asp Val Gly Gly Leu Glu Val Leu Val Asp Gly260 265 270Glu Trp Arg Pro Val Ser Pro Val Pro Gly Ala Met Val Ile Asn Ile275 280 285Gly Asp Thr Phe Met Ala Leu Ser Asn Gly Arg Tyr Lys Ser Cys Leu290 295 300His Arg Ala Val Val Asn Gln Arg Arg Glu Arg Arg Ser Leu Ala Phe305 310 315 320Phe Leu Cys Pro Arg Glu Asp Arg Val Val Arg Pro Pro Pro Ser Ala325 330 335Ala Thr Pro Gln His Tyr Pro Asp Phe Thr Trp Ala Asp Leu Met Arg340 345 350Phe Thr Gln Arg His Tyr Arg Ala Asp Thr Arg Thr Leu Asp Ala Phe355 360 365Thr Arg Trp Leu Ala Pro Pro Ala Ala Asp Ala Ala Ala Thr Ala Gln370 375 380Val Glu Ala Ala Ser38權利要求
1.一種根據(a)到(c)中任一用于半矮化植物的DNA(a)編碼與植物sd1基因轉錄產物互補的反義RNA的DNA；(b)編碼具有特異切割植物sd1基因轉錄產物的核酶活性的RNA的DNA；和(c)編碼通過共抑制效果抑制植物sd1基因表達的RNA的DNA。
2.權利要求1的DNA，其中所述植物sd1基因是水稻sd1基因。
3.一種載體，其中包含權利要求1或2的DNA。
4.一種保持權利要求1或2的DNA處于可表達狀態的轉化植物細胞。
5.權利要求4的轉化植物細胞，其中所述植物是水稻。
6.一種植物轉化體，其中包含權利要求4或5的轉化植物細胞。
7.一種植物轉化體，其是權利要求6的植物轉化體的后代或克隆。
8.權利要求6或7植物轉化體，其中所述植物是水稻。
9.權利要求6到8中任一植物轉化體的繁殖材料。
10.制備權利要求6到8中任一植物轉化體的方法，其中所述方法包括下述步驟將權利要求1或2的DNA導入植物細胞，以及從所述植物細胞再生植物體。
全文摘要
本發明人推測sd1基因是C20氧化酶基因，并且分離和鑒定了水稻的擬南芥C20氧化酶基因的對應物。結果顯示水稻sd1基因編碼新的C20氧化酶。進一步的研究顯示該基因的突變導致植物半矮化。預計利用該植物sd1基因可以提高植物產量，尤其是有用農業作物和觀賞植物等，通過矮化以賦予植物的審美價值，并且通過標記選擇提高產量和有效培育矮化植物。
文檔編號C12N5/04GK1896240SQ20061008420
公開日2007年1月17日 申請日期2002年6月7日 優先權日2001年6月19日
發明者大河美保, 松岡信, 蘆苅基行 申請人:本田技研工業株式會社