專利名稱：一種有核細胞體外分離試劑盒及其應用方法
技術領域：
本發明涉及生物醫學技術領域，特別是涉及一種人體骨髓或臍帶血中有核細胞體外分離試劑盒及其應用方法。
背景技術：
骨髓和臍帶血是人的造血組織，含有豐富的各系造血干細胞/祖細胞及大量的成熟細胞，如紅細胞、白細胞、血小板等，各系干細胞又因為各自表面所含有的抗原性不同，可以分為一百多種，如CD34、CD117、CD10、SCA-1、Lin-等。各系干細胞和成熟的白細胞均為有核細胞。有核細胞中包含單核細胞，多核細胞，淋巴細胞及各系干細胞/祖細胞，間充質細胞等。
目前國際國內從骨髓、臍帶血中分離提取干細胞的方法很多有按照細胞的類型分離的，如單純分離單核細胞、分離間充質干細胞、分離淋巴細胞等，有按其細胞表面抗原不同分離某一類干細胞的，如分離CD34、CD117、CD10等，所采用的方法有磁珠法，免疫熒光標記法，富選法，流式細胞儀法等。
這些方法所存在的共同問題是第一不能有效保留所有類型的干細胞，第二造價貴，第三技術條件要求較高，離工業化生產有一定的距離，在臨床推廣應用上有一定的難度。
發明內容
本發明的目的就在于克服上述現有技術的缺陷，提供一種從人類骨髓和臍帶血中分離有核細胞的體外分離試劑盒，該技術不僅具有方法簡單，造價低廉，可以工業化生產，易于推廣的特點，最重要的可以保留骨髓和臍帶血中所有的造血干細胞。
本發明的另一是目的提供采用上述試劑盒分離有核細胞的分離方法。
本發明的技術方案為一種有核細胞體外分離試劑盒，其特征在于該試劑盒中包含有紅細胞沉淀劑、泛影酸鈉-聚蔗糖400#或HISTOPAQUE1077和細胞保養液，各試劑溶液分開保存；所述紅細胞沉淀劑是指由0.4％～1.2％的羥乙基淀粉或羧甲基淀粉或甲基纖維素與0.2％～0.4％葡萄糖酸鈣組成的水溶液，該水溶液PH為7～8所述泛影酸鈉-聚蔗糖400#由0.3％～1.5％泛影酸鈉和8％的聚蔗糖400#組成的水溶液，鈣水溶液PH值為7～8；所述細胞保養液為磷酸緩沖液或生理鹽水；上述有核細胞體外分離試劑盒的應用方法，其工藝過程為首先用細胞保養液將骨髓或臍帶血稀釋，然后與紅細胞沉淀劑混勻，靜置8～20分鐘后收取上清液，離心濃縮，濃縮液再加入泛影酸鈉-聚蔗糖400#或HISTOPAQUE1077后離心分離20～30分鐘，吸取有核細胞層，用細胞保養液清洗1～4次即可。
本發明既能分離骨髓又能分離臍帶血，所分離出的有核細胞存活率≥98％，有核細胞回收率≥85％，如果能按無菌要求操作，在局部100級潔凈工作臺中，分離不會因試劑而污染而且所分離出的細胞表面沒有任何標記物，不改變細胞的生物活性。
本發明的試劑盒可工業化生產，以實現了人類造血干細胞分離、純化技術的推廣，使醫生可以象用藥一樣方便的使用細胞來治療病人。
具體實施例方式
實施例1試劑盒組成1、紅細胞沉淀劑0.4％的羧甲基淀粉與0.4％葡萄糖酸鈣組成的水溶液，溶液PH值7.4；2、泛影酸鈉-聚蔗糖400#0.3％的泛影酸鈉和8％的聚蔗糖400#組成的水溶液，其PH值為7。
3、細胞保養液磷酸緩沖液(PBS)；上述三種液體配制后經過121℃，35分鐘滅菌，測試內毒素含量≤0.5EU/ml，后分別存放在試劑盒中。
取100ml骨髓或臍帶血，加100ml細胞保養液稀釋，加20ml紅細胞沉淀劑混勻后靜置8～20分鐘，收取上清液，以1200轉/8分鐘的速率離心濃縮。吸取濃縮液加到含有泛影酸鈉-聚蔗糖400#的離心管中，做密度梯度離心30分鐘，轉速控制在1200轉/分，吸取有核細胞層，再用細胞保養液清洗1～4次，用50ml細胞保養液稀釋備用，取5μ1用臭酚藍檢測細胞存活率.再取5μ1進行細胞計數。
每100ml骨髓或臍帶血分離的細胞總數不應少于2.6-5.9×107個細胞。
上述濃度為質量濃度。
實施例2試劑盒組成1、紅細胞沉淀劑1.2％的羥乙基淀粉與0.2％的葡萄糖酸鈣加水溶解所得的溶解液，PH值8；2、HISTOPAQUE1077；3、細胞保養液生理鹽水；上述三種液體配制后經過121℃，35分鐘滅菌，測試內毒素含量≤0.5EU/ml，后分別存放在試劑盒中。
具體應用方法同實施例1。
上述濃度為質量濃度。
實施例3試劑盒組成1、紅細胞沉淀劑0.8％的甲基纖維素與0.3％的葡萄糖酸鈣加水溶解所得的溶解液，PH值8；2、泛影酸鈉-聚蔗糖400#；3、細胞保養液磷酸緩沖液(PBS)；上述三種液體配制后經過121℃，35分鐘滅菌，測試內毒素含量≤0.5EU/ml，后分別存放在試劑盒中。
具體應用方法同實施例1。
上述濃度為質量濃度。
權利要求
1.一種有核細胞體外分離試劑盒，其特征在于該試劑盒中包含有紅細胞沉淀劑、泛影酸鈉-聚蔗糖400#或HISTOPAQUE1077和細胞保養液，各試劑溶液分開保存。
2.按照權利要求1所述的有核細胞體外分離試劑盒，其特征是所述紅細胞沉淀劑是指由0.4％～1.2％的羥乙基淀粉或羧甲基淀粉或甲基纖維素與0.2％～0.4％葡萄糖酸鈣組成的水溶液，該水溶液PH為7～8。
3.按照權利要求1所述的有核細胞體外分離試劑盒，其特征是所泛影酸鈉-聚蔗糖400#由0.3％～1.5％泛影酸鈉和8％的聚蔗糖400#組成的水溶液，該水溶液PH值為7～8。
4.按照權利要求1所述的有核細胞體外分離試劑盒，其特征是所述細胞保養液為磷酸緩沖液或生理鹽水。
5.一種如權利要求1所述的有核細胞體外分離試劑盒的應用方法，其工藝過程為首先用細胞保養液將骨髓或臍帶血稀釋，然后與紅細胞沉淀劑混勻，靜置8～20分鐘后收取上清液，離心濃縮，濃縮液再加入泛影酸鈉-聚蔗糖400#或HISTOPAQUE1077后離心分離20～30分鐘，吸取有核細胞層，用細胞保養液清洗1～4次即可。
全文摘要
本發明涉及一種人體骨髓或臍帶血中有核細胞體外分離試劑盒及其應用方法，該試劑盒中包含有紅細胞沉淀劑、泛影酸鈉－聚蔗糖400
文檔編號C12N5/0786GK1920012SQ20061010687
公開日2007年2月28日 申請日期2006年8月7日 優先權日2006年8月7日
發明者王懷林 申請人:王懷林