提高利福霉素產量的方法

專利名稱：提高利福霉素產量的方法
技術領域：
本發明涉及利用控制細菌的雙組份調節系統尤其是其中的"mr￡禾n/或 基因或與其高度同源的基因的方法來提高抗生素及其它有用的次生代謝 產物的產量的方法。具體而言，本發明涉及地中海擬無枝菌酸菌(^^C0/W0/W'5 mec/^A7wze/)，及使用該菌生產利福霉素的方法。
背景技術：
雙組份調節系統(two-component systems)是細菌細胞中的一種重要的信 號傳導調節系統，它由感應蛋白質(sensor kinase)和應答調節蛋白質(response regulator)組成(Parkinson JS禾卩Kofoid EC. Communication modules in bacterial signaling proteins. Annu Rev Genet. 1992; 26:71-112)。細菌首先感受到外界信號 的刺激，在ATP存在的情況下，感應蛋白質的組氨酸位點進行自磷酸化，然后 再將組氨酸上的高能磷酸基團轉移到應答調節蛋白的天冬氨酸殘基上。磷酸化 的應答調節蛋白質便起始或關閉其下游調控靶點基因的轉錄(A皿M. Stock, Victoria L. Robinson禾卩Paul N. Goudreau. Two-component signal transduction. Annu. Rev. Biochem. 2000; 69:183-215)。與抗生素代謝相關的典型的雙組份系 統有q/^7/a々02、o^ /c""和W"7/aZ)"2等。在變鉛青鏈霉菌中，AfsQl/afsQ2 可以刺激生成放線菌紫紅素和靈菌紅素等(IshizukaH, Horinouchi S， Kieser HM， Hopwood DA禾口 Beppu T. A putative two-component regulatory system involved in secondarymetabolismin5Y/-，ow_yces spp. JBacteriol. 1992 Dec;174(23):7585-94)，而ct^ /cwtf雙組分系統則負調控放線菌紫紅素(Act) 的產生(Chang HM, Chen MY, Shieh YT, Bibb MJ和Chen CW. The cutRS signal transduction system of》e/7fo，ces1 //v/(ia w represses the biosynthesis of the polyketide antibiotic acti歸hodin. Mol Microbiol, 1996 Sept.; 21(5):1075-85)。 雙組份系統通過調節抗生素專一調節基因的表達來影響天藍色鏈
霉菌抗生素的產生，參與了全局性調控，"6^47或基因的中斷導致抗生 素放線紫紅素(Act)和靈菌紅素(Red)的過早產生，因此WW7/WW2負調控 抗生素的次生代謝(Brian P, Riggle PJ, Santos RA和Champness WC. Global negative regulation of 5Yr，omjces coe//co/or antibiotic synthesis mediated by an afc^4-encoded putative signal transduction system. J Bacteriol. 1996 Jun;178(ll):3221-31)。利福霉素是安莎類抗生素(Ansamycins)的一個亞群，可以特異性地抑制 依賴于DNA的RNA聚合酶的活性，使病菌不能正常地合成RNA產物，從而 達到抑菌目的，在臨床上被廣泛地用于治療由分枝桿菌(M少co^"eWwm)、肺炎 球菌(P"e"mococc"力及其他革蘭氏陽性菌引起的各種感染(Lal, R.和Lai, S.， Recent trends in rifamycin research. BioEssays 1994， 16: 211-216)。在我國目前重 點防治的三類傳染病中的兩類結核病以及由艾滋病引發的多種并發癥的治療中，利福霉素類藥物都是一線用藥。目前，工廠中主要生產利福霉素B或SV，然后再在此基礎上合成利福平、利福噴丁等。地中海擬無枝菌酸菌在工業上被用于生產利福霉素。地中海擬無枝菌酸菌04m_yco/ato; 5& me&terrawe/)是一種革蘭氏陽性菌。1957年，地中海擬無枝菌 酸菌被從法國St. Raphael附近的土樣中分離出來。最先，地中海擬無枝菌酸菌 豐皮鑒定為Streptomyces mediterranei(Margalith, P.,禾Q G. Beretta. Rifomycin. XI. Taxonomic study on 5^*eptom_yce m /"en-awd nov. sp. Mycopathol. Mycol. Appl. 1960,13:321-330)。后來，Thiemann等人根據細胞壁的化學成分將它重新侖名 為7VocflWa med"em 諮'(J. E. Thiemann, G. Zucco禾口 G. Pelizza. A proposal for the transfer of Sf廠eptomyces med/'te廣廠ane/ margalith and beretta 1960 to the genus A/oca廠d/a as A/oca廠d/a mecy/te/ranea (margalith and beretta) Comb. Nov, Arch. Microbiol. 1969， 67:147-155)。到八十年代中期，Lwchevalier 等人根據其細胞壁的組成缺乏分枝酸以及對M c^^'a和i /zo&coccw的噬菌體 不敏感等特征又將其歸為擬無枝菌酸菌C4m3;co/atojM&) (Lechavalier, MP, Prauser, H., Labeda, DP 禾0 Ruan， JS. Two new genera of A^ocaWq/o環 actinomycetes: Jmyco/ato gen. nov. and顛ycotoo戸's gen. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 1986， 36: 29—37)。
地中海擬無枝菌酸菌(J/n少co/ato/w" me^'/^ra"e/) U-32是利福霉素SV的產 生菌。倪榴英等(1984，利福霉素合成與谷氨酰胺合成酶活力的正相關性，微 生物學報，24 (3) :217 2231)對地中海擬無枝菌酸菌U-32合成利福霉素SV 的代謝過程進行了深入的生理生化研究。現階段，主要利用物理或化學方法對工業生產菌株進行誘變，通過對誘變 的菌株進行篩選來獲得高產菌株。這些方法的工作量大，成本高，成功率低， 而且得到的高產菌株往往不穩定，很容易發生回復突變。因此，通過新的方法 來提高生產菌株的次生代謝物產量對于節約成本、增強產品的競爭力有著重要 的意義。發明內容本發明一方面涉及一種制備抗生素或其它有用次生代謝物產量進一步提 高的菌株的方法，該方法包括對該菌株的原始菌株中的包含和amfc￡ 基因或與其高度同源的基因的雙組份調節系統進行操作，使所述禾[l/或 "m/c五基因或與其高度同源的基因失活，得到突變的菌株，該突變菌株即為抗 生素或其它有用次生代謝物產量進一步提高的菌株。在一個優選實施例中，所述方法還包括步驟培養所述突變菌株，測定其 產生抗生素的能力，篩選出抗生素產量進一步提高的菌株。在一個優選實施例中，所述菌株是選自地中海擬無枝菌酸菌(^^co/a/o/w^ meAYemme/)或具有相似代謝調控機制并包含am^和/或flmy^基因或與其高 度同源的基因的雙組份調節系統的微生物菌株。在一個優選實施例中，將所述cm^和/或aw^:基因或與其高度同源的基 因敲除，得到突變的菌株。在另一優選實施例中，所述抗生素是利福霉素。在更優選的實施例中，所 述菌株是地中海擬無枝菌酸菌"/^cotoo; ^ mW"m"a"eO ，所述利福霉素是利福霉素sv。本發明另一方面涉及一種采用本發明所述的方法制得的菌株，它選自地中海擬無枝菌酸菌Um_yco/a^w" we必mwi"')或具有相似代謝調控機制并包含 "mr五和/或"^t五基因或與其高度同源的基因的雙組份調節系統的微生物菌株，
其中，該菌株包含一雙組份調節系統，該調節系統中的am/^基因和/或am^￡ 基因或與其高度同源的基因已失活。在一優選實施例中，該菌株是地中海擬無枝菌酸菌"m;;cotoo;7^s wefi^erra"")的菌株，其雙組份調控系統中的cwirE基因和/或am々五基因已失活。本發明又一方面還涉及一種生產抗生素的方法，該方法包括(a) 培養采用本發明方法獲得的菌株；和(b) 從培養基中收集所述菌株產生的抗生素。 在一優選實施例中，所述抗生素是利福霉素。在更優選的實施例中，該利福霉素是利福霉素SV。在另一優選實施例中，所述菌株為地中海擬無枝菌酸菌。 本發明還涉及一種DNA分子，它含有SEQIDNO: 1所示第456-1139位和/或第1 178-2533位核苷酸序列，以及該DNA分子在制備抗生素產量進一步提高的菌株和提高抗生素產量當中的用途。


圖l顯示點雜交從地中海擬無枝菌酸菌U-32中篩選陽性克隆子。圖1A表 示第一輪篩選U-32混合文庫，得到編號為2、 10、 21和63四個陽性雜交點； 圖1B顯示對第一輪篩選得到的第63號混合質粒進行第二輪篩選，得到編號為 50的重組體克隆。圖1B中"positive control"指陽性對照。圖2顯示地中海擬無枝菌酸菌U-32總DNA和質粒pLR6350分別經Sacl 和Sg/II酶切與探針雜交后所得結果，左圖為電泳后EB染色圖片，右圖為轉膜 后Southern雜交圖片。其中，編號"1"為入DNA/歷^in標記物，編號"2" 為pLR6350ASacI;編號"3"為U-32總DNAASacI。圖3A和3B顯示amr五和a/wA五基因核苷酸全序列和相應的氨基酸序列， 其中下劃線標注的是awW基因和am^基因可能的RBS位點。圖4A和4B顯示AmrE和AmkE與同源蛋白氨基酸序列的比較。其中圖 4A中的比較序列分別來自地中海擬無枝菌酸菌U-32 (AmrE)、》^畫yc^ coe//co/or(AfsQl， BAA01502)、 Afyco6a"e r/訓rt/6e/"cw/腦's (MtrA, AAK47686)、
大腸桿菌￡^cAen!.c/n<3 (OmpRl, NP—417864)、 萬ac/腸s由z7/s (PhoP，CAA47908)。圖4B中比較的序列分別來自地中海擬無枝菌酸菌U-32 (AmkE)、 5Vr"omyces coe"co/or (AfsQ2 BAA01503)、 Myco6a"e"'應勵erci"cw/s (MtrB， AAB07807)、大腸桿菌(E腿，P0AEJ4)、 ^"'腸( PhoR, P23545)。圖5顯示PCR驗證amW和amA五中斷突變株所得結果，其中使用驗證引 物AmE-cf和AmE-ca擴增。圖6顯示U32、 U32-101和U32-107在種子硝酸鹽培養基中發酵5天的利 福霉素SV的產量。圖7顯示U32、 U32-101在發酵培養基中發酵5天的利福霉素SV的產量。圖8顯示U32-109、 U32-110在種子硝酸鹽培養基中發酵5天的利福霉素 SV的產量。
具體實施方式
本發明一方面涉及一種通過調控細菌菌株中的雙組份調節系統來提高該 菌株生產次生代謝物產物產量的方法，該方法包括破壞該菌株的雙組份調節系 統，使其失活，獲得突變的菌株，利用該突變的菌株生產次生代謝物，實現產 量的提高。本發明尤其涉及通過調控地中海擬無枝菌酸菌的雙組份調節系統來提高 利福霉素的產量的方法。該雙組份調節系統包含amr五和a^^基因，破壞其中 任一基因或兩者，所獲得的菌株都能大大提高利福霉素的產量。本發明還涉及通過控制具有相似代謝調控機制及包含所述flm^和amA￡ 基因或與其高度同源的基因的微生物菌株的雙組份調節系統來提高相關次生 代謝物產量的方法。相似代謝調控機制指其調控次生代謝的機制與地中海擬無 枝菌酸菌中"mr五/am^^雙組份調節系統的調控機制相同或相類似，因而可以通 過失活其中一個基因或兩個基因來提高次生代謝物的產量。"高度同源"在本文中指其蛋白質序列與AmrE或AmkE蛋白質的序列相 比，具有至少40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 85%、 90%、 95%、 98%或以 上的序列相同性，并且都應該含有保守的功能結構域。可采用本領域己知的工 具和方法來測定序列相同性，例如，利用NCBI網站上的BLAST工具(例如，
bl2seq)進行兩條蛋白質序列的比對。"/nr五和^^五基因是本發明人在對地中海擬無枝菌酸菌的基因組DNA進 行研究的過程中發現的兩個基因。利用OmpR家族蛋白保守氨基酸序列設計得 到簡并PCR引物，以地中海擬無枝菌酸菌U-32總染色體DNA為模板，擴增 得到一段390bp的DNA片段。以該DNA片段為探針，篩選U-32的基因文庫， 對獲得的陽性克隆子進行酶切和Southern雜交分析，并測定了約3.2kb的片段。 對測得的DNA序列進行分析的結果表明，序列中存在兩個閱讀框，本發明人 分別將其命名為AmrE和AmkE(SEQ ID NO: 1)。通過與已知蛋白進行同源比 較，預測AmrE和AmkE的產物分別屬于雙組份調控蛋白系統中的應答調節蛋 白和感應組氨酸激酶，并包含保守的氨基酸或氨基酸序列及一致的功能區。分別對U32中flm^基因和amyt五基因進行了基因阻斷，使其失活，發現 基因中斷突變株的利福霉素SV的產量相對于野生型U32均有較大幅度的提 高。進一步將此雙組份在U32中進行了過量表達，發現過表達菌株的利福霉素 SV的產量相對于轉了空質粒的U32對照有大幅度的降低。由此推斷^m^和 amA:五這對雙組份調控系統在U32中負調控利福霉素SV的產生。通過將AmrE蛋白質序列與GenBank數據比較發現，許多物種的微生物也 含有同源性很高的調控蛋白，其中多為雙組份中的應答調節蛋白，如 ZP_00574191 (氟蘭克氏菌屬，Fra"h'a^. EANlpec) ， NP—824658 (除蟲鏈霉 菌，S^e/^omjces avemn'"7/s MA-4680) ， CAB89435(天藍色鏈霉菌，S^eptom"vc^ coe//co/w A3(2)) ， CAB90924 (&r印tow^c^ coe//co/or A3(2))等等(序列數 據來自GenBank)。根據序列的相似性可以推斷這些與ArmE有著高度同源 性的應答調節蛋白也和微生物次生代謝的調控有著非常密切的關系。同時，已知的研究結果表明許多微生物的次生代謝的調控是相似的。例如， 焦瑞身等人發現在培養基中添加0.8X的KN03可以使力復霉素SV的產量提高 1.7倍以上(焦瑞身，陳聿美，吳夢淦和顧薇玲，地中海諾卡氏菌(7VoozW/a mefi^ermwe/)合成力復霉素代謝調節的研究I.硝酸鹽對地中海諾卡氏菌合成 力復霉素SV的促進作用，植物生理學報，1979,5 (4) : 395 — 402)，之后又 發現硝酸鹽對林可霉素的生物合成也有很大的促進作用(焦瑞身等，硝酸鹽、 鎂鹽對林可霉素生物合成的促進作用，生物化學雜志，1997, 13(6): 709-714)。 此外，在利福霉素B (El-Tayeb, O.M.l， Salama， A.A.2, Hussein, M.M.M.2和 El-Sedawy， H.F. Optimization of industrial production of rifamycin B by J考co/afo/w/s me<i"eiT(3"eZ. I. The role of colony morphology and nitrogen sources in productivity. African Journal of Biotechnology. 2004, 3(5): 266-272.)、歹'J維杜 霉素(周曉云和王慧中，列維杜霉素產生菌M814產生列維杜霉素的研究.浙江 工業大學學報.1995， 23 ( 1) : 68-72)、阿扎霉素B (江曙和黃為一，吸水鏈 霉菌NND-52-C菌株產阿扎霉素B發酵條件的優化，生物加工過程，2004， 2 (1 ) : 53-57)等抗生素的生物合成過程中，硝酸鹽的添加也可以大幅度提高 抗生素的產量。預計地中海擬無枝菌酸菌^m"五/a^tf這對雙組份系統的調控方 式在這些具有相似次生代謝調控機制的微生物中也是保守的。因此，對于和地中海擬無枝菌酸菌有著相同或相似的次生代謝調控機制及 包含與amr￡/am/:￡雙組份高度同源的基因的微生物，可通過中斷與"/rn^禾口/ 或amfc￡同源的基因來提高菌體次生代謝物的產量。在本發明中，"失活"，包括將基因完全敲除而使得該基因完全不具備活 性，也包括對該基因進行突變，從而使得該基因活性與原始菌株或未發生突變 時相比下降至少30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%或更多。突變可以是使 該基因缺失、突變或插入一些核苷酸，例如缺失95%、 90%、 80%、 70%、 60 %、 50%、 40%、 30%、 20%或其間任意比例的核苷酸，使得該基因活性下降 至少30%以上；而突變則包括使該基因中的部分核苷酸(如1一100個、1一50 個、l一20個等等)發生突變，從而使得其活性下降30%或更多；插入則包括 插入1一100個或更多、l一50個、l一20個等核苷酸，同時使得該突變基因活 性下降30%或更多。當然，上述突變并不局限于所列出的內容，可采用本領域 已知的其它方法來使所述基因失活。本發明所用"原始菌株"指其包含"wnE和/或am;t五基因或與其高度同源 的基因的雙組份調節系統未被操作，所述amr五和/或^wA:五基因或與其高度同 源的基因未失活的菌株，它可以是天然的菌株，也可以是目前工業或實驗室中 使用的菌株。可采用本領域現有技術已知的方法將相關基因敲除或使其發生突變。例 如，可利用DNA同源重組的方法，構建相關基因中斷載體，將目的基因敲除 (丁曉明等，利用同源重組建立地中海擬無枝菌酸菌U32染色體的基因置換/ 中斷系統，生物工程學報，2002， 18 (4) : 431-437)。也可采用本領域現有技術己知的方法來判斷突變的基因是否失活，例如用 Southern雜交或用PCR擴增的方法來檢驗目的基因是否突變；利用檢測突變株 的表型變化(如，利福霉素SV的產量變化)的方法或通過相關生理生化實驗 來判斷突變的基因是否失活。本領域技術人員可采用現有技術公開的知識篩選失活菌株。例如在構建中 斷載體的時候引入抗性基因，用中斷載體中斷相關基因。利用含有抗性的培養 基來篩選基因失活菌株，并用上述驗證基因失活的方法對所篩選的菌株進行驗 證。測定菌株生產抗生素的能力的方法也是本領域周知的，例如，對利復霉素 SV的測定，可以用抑菌圈實驗法測定生物效價(焦瑞身、陳聿美、吳夢淦、 顧薇玲，地中海諾卡氏菌(Nocardia mediterranei)合成力復霉素代謝調節的研究 I.硝酸鹽對地中海諾卡氏菌合成力復霉素SV的促進作用，植物生理學報，1979， 5(4): 395 —402)或采用文獻(Wang W, Zhang W， Chen H, Chiao J, Zhao G, Jiang W. Molecular and biochemical characterization of a novel two-component signal transduction system, awM- ■"， involved in rifamycin SV production in Jmyco/Wo;w& meaf"e/ra"d U32. Arch. Microbiol 2002， 178: 376-386)所述白勺方 法測定其化學效價。本發明另一方面還涉及一種新穎的菌株，該菌株含有一雙組份調節系統， 該調節系統中的一個或兩個基因已失活，其中，該基因為"mW基因、am^^基 因或與其高度同源的基因。該菌株可以是選自地中海擬無枝菌酸菌 (爿myco/ato/w^ me^Ye^Twie/)或具有相似代謝調控機制及包含amrE禾。am&￡基因或與其高度同源的基因的雙組份調節系統的微生物菌株。本發明另一方面 還涉及提高次生代謝物產量的方法，該方法包括培養本發明的菌株，然后從培 養基中收集所產生的次生代謝物。次生代謝物可以是抗生素等，優選是利福霉 素。可在本領域常規使用的條件下培養本發明的菌株。例如，地中海擬無枝桿 菌酸可在26°C—3(TC用本氏固體或液體培養基培養(Wang W, Zhang W， Chen H， Chiao J, Zhao G, Jiang W, Molecular and biochemical characterization of anovel two-component signal transduction system, amn^- a/nL4, involved in rifamycin SV production in爿myco/a/o戸's mec /^ra腦'U32. Arch. Microbiol 2002,178:376-386)。地中海擬無枝菌酸菌發酵的方法參照文獻(焦瑞身、陳 聿美、吳夢淦、顧薇玲，地中海諾卡氏菌(iVocaWZa me(^erra"e/)合成力復霉素 代謝調節的研究I.硝酸鹽對地中海諾卡氏菌合成力復霉素SV的促進作用，植 物生理學報，1979， 5 (4) : 395 — 402)。收集的方法也是本領域所周知的， 例如用濾紙過濾發酵液收集發酵產物。本發明還涉及一種含有所述amr五基因和/或om&五基因或與其高度同源的 基因的DNA序列。所述高度同源指同源基因在蛋白質水平上應該含有保守的 功能結構域，并且還應具有至少40。/。、 50%、 60%、 70%、 80%、 85%、 90%、 95%、 98%或以上的序列相同性。以下將以實施例的方式闡述本發明。應理解， 本發明不僅僅限于以下具體實施例。本領域技術人員可對本發明做出適當的修 改、變動，這些修改和變動都在本發明的范圍之內。在本發明中，涉及DNA 的操作可參考《分子克隆實驗指南》(第三版)；涉及染色體總DNA的提取 可參考文獻(D. A. Hopwood, M. J. Bibb, K. F. Chater " a/. Genetic Manipulation of iSWepfowjces. A Laboratory Manual. England : John Innes Foundation Press, 1985.);地中海擬無枝菌酸菌U-32基因組cosmid文庫用cosmid載體pLAFR3 (Staskawicz B, Dahlbeck D， Keen N, Napoli C (1987) Molecular characterization of cloned avirulence genes from race 0 and race 1 of尸sewi/函owa51 ,/rtgae pv. Glycinea. J Bacteriol 169:5789-5794)構建，其構建過程參見文獻(Zhang W, Li L, Jiang W, Zhao G, Yang Y, Chiao J (2000). A novel transmembrane serine/threonine protein kinase gene from a rifamycin SV-producing y4myco/(3/o戸.s mec/z'^r匿/ U32. Eur J Biochem 267:3744-3752) 。 DNA的測序方法為本領域常 規的方法，也可由商業公司提供測試；發酵的方法可參見文獻(焦瑞身、陳聿 美、吳夢淦、顧薇玲，地中海諾卡氏菌(A^caW/G w^/"e廳a"e/)合成力復霉素代 謝調節的研究I.硝酸鹽對地中海諾卡氏菌合成力復霉素SV的促進作用，植物 生理學報，1979， 5 (4) : 395 — 402);而利福霉素SV化學效價的測定方法 可參見文獻(Wang W, Zhang W， Chen H， Chiao J, Zhao G， Jiang W. Molecular and biochemical characterization of a novel two-component signal transductionsystem, aw/vi- am￡4, involved in rifamycin SV production in J附yco/(3to戸j me^e/r證〖U32. Arch. Microbiol 2002, 178: 376-386)。在實驗中使用到的地中海擬無枝菌酸菌U32為植物生理生態研究所分子微 生物實驗室保藏(李果龍、楊蘊劉、焦瑞身，地中海擬無枝菌酸菌U-32硝酸 還原酶的基因克隆，生物工程學報，1994， 10 (3) : 200-205;和Zhang W， Yang L, Jiang W， Zhao G, Yang Y, Chiao J. Molecular analysis and heterologous expression of the gene encoding methylmalonyl-coenzyme A mutase from rifamycin SV-producing strain med"en-awd U32. Appl BiochemBiotechnol. 1999 Dec;82(3):209-25)。地中海擬無枝菌酸菌U32的培養用本氏 培養基(Wang W, Zhang W， Chen H， Chiao J, Zhao G, Jiang W. Molecular and biochemical characterization of a novel two-component signal transduction system, a鮮v4- am^4, involved in rifamycin SV production in爿，co/a鄉5/5 met/"erra"e/ U32. Arch. Microbiol 2002, 178: 376-386)、大腸桿菌培養用LB培養基。地中 海擬無枝菌酸菌發酵所用的種子培養基、發酵培養基的配方見(焦瑞身、陳聿 美、吳夢淦、顧薇玲，地中海諾卡氏菌(iVocaWz'a me^^ra"e/)合成力復霉素代 謝調節的研究I.硝酸鹽對地中海諾卡氏菌合成力復霉素SV的促進作用，植物 生理學報，1979， 5 (4) : 395 — 402);種子硝酸鹽培養基是在種子培養基中 添加KN03至終濃度為0.8%。培養基中所添加抗生素的終濃度為氨芐青霉素 100pg/ml，卡那霉素50 (ig/ml,阿伯拉(aparamycin) 30嗎/ml，紅霉素200 ng/ml。 實驗中使用到的限制性內切酶、T4 DNA連接酶、RNase A、 Taq酶、Klenow 酶、lkb DNA ladder為MBI公司產品，高保真DNA聚合酶KOD-plus為T0Y0B0 公司產品，[a-32P]-dCTP為北京亞輝生物公司產品，尼龍膜(Hybond N+)為 Amersham公司產品。實施例l:克隆雙組份系統所需DNA探針的制備在目前已知的應答調節蛋白質中，OmpR (大腸桿菌DNA結合蛋白)是研 究很深入的細菌調控蛋白(Parkinson JS和Kofoid EC. Communication modules in bacterial signaling proteins. Annu Rev Genet. 1992; 26:71-112)，通過X-射線晶體 衍射得到的三維結構表明，它的C-末端具有非常典型的oc-螺旋-環-a-螺旋的 DNA結合區域。OmpR類蛋白通過與基因的啟動子區的結合，增強RNA聚合 酶的轉錄功能，從而達到調控相應基因轉錄的作用。根據OmpR類家族蛋白的 保守性氨基酸序列(近N端為GLEVGADD，近C端為TVRGVGY) (Wray LV Jr， Fisher SH. The SV/-，om_yces coe/Zco/or g/wi gene encodes a protein similar to other bacterial response regulators. Gene. 1993 Aug 16;130(l):145-50)， 設計并合 成了兩條PCR引物AmE-DPN(SEQ ID NO: 3)和AmE-DPC(SEQ ID NO: 4)。 以地中海擬無枝菌酸菌U-32的總DNA為模板擴增得到的約400bp DNA產物 與pGEM-T載體(Promega)連接。測序結果(SEQ ID NO: 2)表明，克隆得到的 DNA序列編碼的氨基酸序列與OmpR家族蛋白具有較高的同源性，包含OmpR 家族蛋白C端的HLHDNA結合區，以及幾段保守的氨基酸序列，證明該DNA 片段可以作為在地中海擬無枝菌酸菌U-32中篩選應答調節蛋白的探針。實施例2:從地中海擬無枝菌酸菌U-32基因組文庫中篩選amr￡和基因由于大腸桿菌DH5ct (Gibco-BRL)中存在OmpR類蛋白基因，使用細菌 菌落原位雜交難以篩到正確的陽性克隆，所以采用斑點DNA雜交方法來篩選。 將46 — 50個菌落分為一組提取混合質粒，共提取了 80組混合質粒(相當于3800 個重組質粒)。利用96孔斑點雜交加樣器，將變性后的混合質粒點到尼龍膜 上，然后與實施例1制得的DNA探針雜交。選擇嚴格的洗膜條件，結果在膜 上得到4個陽性雜交點，編號分別為2、 20、 21、 63 (見圖1A)，提取相對于 63號的50個菌落的質粒，進行第二輪雜交篩選，得到編號為50的重組體克隆 (見圖1B)，其重組質粒命名為pLR6350。進一步的DNA分子雜交表明，經 相同的限制性內切酶切后的pLR6350與U-32的染色體總DNA有相同的雜交 帶，證明pLR6350中的外源片段確實來源于U-32 (見圖2)。實施例3:地中海擬無枝菌酸菌U-32amW和amfc&基因序列測序及分析 質粒pLR6350分別用5g/n，雄，H，尸WI，屈ol酶進行酶切、電泳、 Southern轉移，與實施例1制得的DNA探針進行雜交，結果表明萬g/H， 5Y"I， Sacl， Pwl， Z/zoI酶切分別產生2.5kb， 12kb， 2.0kb， 1.2kb和4.6kb的單一雜
交帶。分別將2.5kb的Sg/II酶切片段和2.0kb的尸WI酶切片段克隆到 pBlueScriptII KS載體(Stratagene)的5amHI和Pwl位點，得到質粒pKS2.5B 和pKS2.0P。對質粒pKS2.5B和pKS2.0P進行測序共得到3238bp的DNA序列(見圖3)。序列分析表明，在已經測序的3.2kb的DNA片斷上，存在兩個緊密連鎖的 完整閱讀框架(ORF)。ORFl從第456位的ATG起始，終止于第1139位的TGA， 全長684bp，編碼一個228個氨基酸的蛋白質(AmrE)， (G+C)百分含量為73.3 %，符合放線菌DNA的G + C百分含量較高的特點，密碼子第三位堿基為G 或C的含量為92% ，符合放線菌基因的密碼子偏好性特點。在447 451bp處， 存在一個可能的核糖體結合位點(RBS): GGAGC。蛋白質序列與GenBank數據 比較結果表明，它與雙組份調控系統中典型的應答調節蛋白有很高的相似性。 AmrE中Asp-14、 Asp-57和Lys-107在其他同類蛋白中也是高度保守的，其中 Asp-57是磷酸化位點。在AmrE蛋白的C末端，具有典型的DNA結合區域 (HLH)(見圖4A)。ORF2從第1178位的GTG起始，終止于2533位的TGA，全長1356bp， 編碼一個452個氨基酸的蛋白質(AmkE)， (G + C)百分含量為75.9%，符合放線 菌DNA的G + C百分含量較高的特點，密碼子第三位堿基為G或C的含量為 94.2%，符合放線菌基因密碼子偏好性特點。在1167 1171bp處，存在一個可 能的RBS位點GGATC。蛋白質序列與GenBank數據比較結果表明，它與雙 組份調控系統中典型的組氨酸蛋白質激酶有很高的相似性。 一級結構預測表 明，AmkE的N-末端同源性比較差，而其C-末端與許多組氨酸蛋白質激酶一樣， 具有十分保守的幾個結構域(見圖4B): H、 N、 Gl、 F禾BG2區，其中H區含有 組氨酸殘基，是自我磷酸化位點；G1和G2區富含甘氨酸殘基，是核苷酸結合 區域。AmkE的N-末端有兩個典型的疏水區，可能是跨膜區。實施例4:對U-32 amnE和amfcE雙組份基因功能的研究 對U-32中amr五基因和am^g基因的中斷為了進一步研究和"m^ 這對雙組份基因在地中海擬無枝菌酸菌 U-32中的功能，我們用同源重組的方法分別對amr五和amyt五進行了基因中斷。
以U32總染色體為模板，以AmE-bf (SEQ IDNO: 5) 、 AmE-ba ( SEQ ID NO: 6)為引物，用高保真DNA聚合酶KOD-plus (ToyoBo)擴增得到約2.9kb 的DNA片段。將得到的片段克隆到pMD18-T (TakaRa)的五coRV位點，得到 質粒pAmr-l。將質粒pAmr-l用^oI酶切并用Klenow酶補平，再與從質粒 pBCAm (丁曉明等，利用同源重組建立地中海擬無枝菌酸菌U32染色體的基 因置換/中斷系統.生物工程學報，2002， 18 (4) : 431-437)上用S;nal酶切下 含有阿伯拉抗性基因的1.5kb DNA片段相連接，得到，A五基因的中斷質粒 pAmr-2。將質粒pAmr-l用酶切，再與從質粒pBCAm上用SamHI酶切 下含有阿伯拉抗性基因的1.5kb DNA片段相連接，得到^w^基因的中斷質粒 pAmr-3 。按照文獻(丁曉明等，利用同源重組建立地中海擬無枝菌酸菌U32染色體 的基因置換/中斷系統，生物工程學報，2002， 18 (4) : 431-437)中所描述方 法制備U32菌體的電擊感受態。將flm^五基因的中斷質粒pAmr-2于沸水中加 熱10分鐘充分變性后立即插在冰上，然后電擊轉化U32感受態，并于本氏添 加阿伯拉抗性的平板上篩選轉化子。在28X:下，經過4一5天的培養，平板上 將長出awA^基因中斷的突變株。用amr五基因的中斷質粒pAmr-3中斷amrf 基因的方法與中斷cz^t五的方法相同。在用來構建中斷載體的2.9kb DNA片斷外面設計一對驗證引物AmE-cf (SEQIDNO:7)和AmE-ca (SEQIDNO:8)，對可能的突變株進行PCR驗 證，并將U32菌株作為負對照一同進行PCR擴增。驗證的結果表明aw五和的突變株均可以擴增出一條約4.5kb的條 帶，而對照U32擴增出了一條約3.0kb的條帶(見圖5)，證明了amr五基因和 am&E基因分別得到了成功的中斷，得到了地中海擬無枝菌酸菌U-32 ^nW突 變株U32-101及地中海擬無枝菌酸菌U-32 amA￡突變株U32-107。用地中海擬無枝菌酸菌U32作為對照，以藤黃八疊球菌(5*wa>za /We") 為指示菌做了抑菌圈實驗。結果發現無論是在本氏培養基上，還是在本氏添加 0.8。/。KN03的培養基上，flwW突變株(U32-101)與amfcf突變株(U32-107) 的抑菌圈直徑均比對照U32大出許多，而U32-101與U32-107兩株菌的抑菌直 徑差不多。)與am/t五突變株(U32-107)，使用種子硝 酸鹽培養基進行了發酵實驗。經過5天的發酵，U32-101的利福霉素SV的產 量為368±61， U32-107的利福霉素SV的產量為302±67，對照U32的利福霉 素SV的產量為132±23 (見圖6)。發酵的結果顯示，U32-101和U32-107的 利福霉素SV的產量相對于對照U32均有大幅度的增加，其中U32-101的利福 霉素SV的產量稍高。選擇U32與U32-101進一步用發酵培養基發酵，經過5天的發酵，U32的 利福霉素SV的產量為1424± 187，U32-101的利福霉素SV的產量為2062±250 (見圖7)。"mdg和am^:五雙組份系統在U32中過量表達質豐立pULVK2A( Kumar CV, Coque JJ, Martin JF. Efficient Transformationand Promoter-Probe Cloning Vectors. Appl Environ Microbiol. 1994 Nov;60(ll):4086-4093)是常用的能夠在U32中復制并穩定存在的質粒。在 pULVK2A質粒的基礎上構建了含有紅霉素抗性基因的pDXM4質粒。以U32 總染色體為模板，以AmE-bf與AmE-ba為引物，用高保真KOD-plus DNA聚 合酶擴增出含有完整的am^和flm/t五基因及其啟動子區域的DNA片段。將此 2.9kb的DNA片段克隆到pDXM4質粒載體的￡coRV位點，得到過量表達載體 pVK2.9AmE。使用地中海擬無枝菌酸菌U32制作電擊感受態。分別將pDXM4、 pVK2.9AmE轉化U32感受態，在28。C培養，于本氏添加紅霉素的平板上篩選 轉化子。經過7天左右的培養，平板上可以看到轉化子。抽提轉化子中的質粒 并驗證，把正確的轉化子分別命名為U32-109和U32-110。對U32-109和U32-110進行發酵，方法同前，除了在培養基中添加紅霉素。 經過5天的發酵，在種子硝酸鹽培養基中，U32-109的利福霉素SV的產量為 257±39， U32-110的利福霉素SV的產量為15±10 (見圖8)。由于添加了紅 霉素的原因，在實驗的條件下，U32-109與U32-110在發酵培養基中均不能檢 測到利福霉素SV的產生。
amrE基因中斷的突變株U32-101的利福霉素SV的產量相對U32有較大 幅度的提高。當在U32中過量表達flmr五和am^:五雙組份系統時，過表達菌株 U32-110的利福霉素SV的產量相對于對照菌株U32-109有較大幅度的降低。 從基因中斷和過表達兩方面的數據可以得出結論^m^和^^t五雙組份基因負 調控地中海擬無枝菌酸菌U-32產生利福霉素SV。
序列表<110〉中國科學院上海生命科學研究院 <120〉提高利福霉素產量的方法<130> 065775<160〉 8<170〉 Patentln version 3.3<210> 1<211〉 3238<212> DNA<213> 地中海擬無枝菌酸菌(Amycolatopsis mediterranei)<400〉 1CtgC3g犯gCgggLtC犯CggCggCCCCg3ggtcgccggttcggtcgccaacctcaaggcg60cgggccc鄉accagcgcgcCgCCgggC3CgaggaccgcgcgaeLgaagctcgacgaccgc120gccaccaagcgCC鄉gCMgctcggcgagCtg￡L3C￡LCggccaagcagaagctcgacgcg180ttcgcgtccgcgcactgcaagccggccaagtgsggggcgcg柳gtcgcggcggcggtcg240gggccgccgcggtcatcgcgctcggctgctcggcgtgccgCgaCEL3CCtgatgggttcgc300cctccggggacgcgcccgcgccgtcgtcggtgtcgtcgtcggagctgagcgggEttCg3gt360cgacactgagicggcatcgagtcggacatgaacagcggitggctcgccctgaccggctagcg420tctcccctctg咖acggcgg柳cgggagC3ggC3tggggtcaccggggcgcggtctcg480tcctcgtggtgccgcgatcgCCgELgCtggCggcgctctacctcaagcgtg540acggcttcggtgtgcacgtcgaggccgacggcggccgggcCCtgg2LCgCCgtccggcgcc600tC33gCCggtggcgatcgtgctcgacatcgg3CtgtCCggaatggacggcatcgagatct660gcaaggcgttgcgcgcggccggggactggacgccggtgctgttcgtcaccgcccgcgacg720acg3gctcgsccggctgctgggcctgg柳tcggcgcggacgactacctcaccMgccgt780tcagcccgcgcgagctggcggctcgggtccggacggtgctgcgccgggccgccggggtgg840cgccggccgcgg卿cgttcgccgtgggcggcgcgcgcgtcgacgtgctttcccggcggg900cgtgggcgggtg3CgCCg3gcgtccacggsgttcgacctcctcacgcacc960tgctccggcaCCCggggC3ggtgcUtcgcgcgaccagctgctgagtgccgtgtggggct1020acgccgcggcggcgggcacgcgcscggtggacgtccacgtggctc,tgcgcgcg肌ac1080tcggcgcgtcgagtccgattcggacggtgcggggcstcgggtscgcggcggstccgtcgt1140g3兆ttCCgggggacgctggccgggcggatC3CgCtggtgtgcctggccgtcgcgggcat1200cgcggtgatctggtcgcctcccggctgatcCgg3CC3CggCggac犯cgt1260gctgcagtcgacgctggccgcgcaggccgacgtcgtcgcgtcgcaattggELCg犯aCggg1320CatCggC￡L￡LCcggctgggcgtcggc卿gtggccgacgtggtgcgcggccagggcatctc1380ggtggtggtccgccgcgcaggcgggc鄉cgctcggggscggcgtcgcggtccaggccgc1440cgggaagctcgggctggaccgcaaccactcggggcgcgtc3CggtggCggggtcgcsgto1500cctggtcgagscgcgggtggtgggcgcscgcggagcggcgttcgcgctggtcctgcccgc1560gcgcaacgcacaagcg3cgca^cgggcsctggtgcgcaacatcttgctggcgctcgggat1620cgggctgctggtggcggccctggcgggcttcgtctcgggccggctgctgggccgtccgct1680gcgccgggccgcgctggccgcgggatcgctgcgggcgggacgtcgcgscgtgcgggtgcc1740ggtgC3ggggccccgcgaggtggcggaggtggccgggtcgctgaactcgctggCCg￡LCgC1800gctggccgtc柳gaggcgcggcagcgggagttcctgctgtcggtgtcgcacgagctgcg1860gscgccgctgaccgccgtgacgggcttcgccgaggcgatcgcggacggcgtcgccacggg1920gccggacgccgtccgggccgggc,cgatccagcgcgaggcggtgcggctcg辜ggct1980ggtcac,cctgctggagctggcccgcctgggCgCgg￡LCgagttccggctggacatcgc2040ggtgCtggBCctggctgcgttggtccgcgactgtgcggaggtgtggcagctgcggtgcgg2100ccggg鄉scgtccggctctcggtncggctcctgccgggccggttccggtgctggcgga2160cgcgcggcggctgcaccaggtggtcgacggcttggcggagaacgccctgcgcgtcacgcc2220cgcgggggccccgatggtgttctcgctgtcggtgtccgattcggcggcttcgctggcggt2280ccgcgacggcggcccgggcctggcgccggaggactacccggtggcgttcg￡LgCg8ggggt2340cctgaacgcccgctaccgcgaccgccgtccggtcggctcgggcatcggcctggccctggt2400ccacgccctggtcaxccgggttgggcgggacattgacggccggcccggcccccg犯ggcgg2460cgcggcgttc3CgatC3Cgttcccgctggccgcgtcgaxggccacggtcccgccccccgc2520cgctgacctgggctgacgaccgccggcgagctgaaccggcgatctcgcacggccgaccgc2580accggcgtccacggccactcgtccgtaacttggtgtccccgatccgcgacagaaacgctg2640gsgtgstgcgtttcaaccctgcgatggtgttc犯ggtcgscagcatccggcgaaccg犯t2700ttccatgcacg獄ggtgtgacgggagtgcgcggaacgaggacggcacga2760cgsctcggagaatgcgggtttcg￡igcggga>cagcgacctggtccgggcctELCg^CgSgg2820aaxgtcgatcggcgaactcgccgagcggaccggcttgagct8cacgtggstgcgcagscg2880gttg3tC犯Cgccggggcggagctccggccccggccggtcgcgaaggcctgcccggtgcc2940gatcgagcagctggcggacgagtaccgcgccggcgccsgcattctccagctcgcca柳c3000gcacggcctcgggtccgcgsactgctgctcgatcacgaagtgccattgcg3060cccctcgactcgcgccatacccgaaacctgsctcgattgtggcccaggtc￡LCCg￡Lttttt3120 ttcctcctgt gcagttgcac gggagtgttc gtgctttcga gtggaaattc ccgtgctcat 3180 cgcggagcga gcccgatcgg ccggtagaca g卿agttcg ggacttgcgg gggagatc 3238<210〉 2<211> 382<212〉 DNA〈213> 人工序列<220><221> misc—feature 〈223〉 探針序列<400> 2gcctgg卿tcggcgcggacgactacctcaccaagccgttcagcccgcgcg辜tggcgg60ctcgggtccggscggtgctgcgccgggccgccggggtggcgccggccgcgg柳cgttcg120ccgtgggcggcgcgcgcgtcgacgtgctttcccggcgggcgtgggcgggtgacgccg卿180tagtgctgacgtCgg3gttcgaccttctcacgcacctgctccggcacCCggggC3gg240tgctttcgcgcgaccagctgctgsgtgccgtgtggggctacgccgcggcggcgggcscgc300gC3Cggtgg已cgtccacgtggctcagctgcgcgcga33ctcggcgcgtcgagtccgsttc360ggetcggtgcggggcatcggg382<210> 3<211> 26<212> DNA<213〉 人工序列<220〉<221〉 misc_feature <223> 引物<400> 3aagaattcga ggtgggcgcs gacgac 26<210〉 4 <211> 25 <212〉 DNA 〈213〉人工序列<220><221〉 misc一feature <223〉 引物〈400〉 4atctagagta gccgacgccs cgcac 25<210> 5<211> 18<212> DNA〈213> 人工序列〈220〉〈221> misc一feature <223> 引物<400> 5tgaacacggc caagcaga 化〈210> 6<211〉 18<212> DNA<213〉 人工序列<220〉<221〉 misc—feature <223〉 引物<400> 6gccacaatcg agtcaggt 18<210> 7<211> 18<212〉 DNA<213〉 人工序列<220>〈221> misc—feature〈223〉 引物<400> 7tgcagaagcg gatcaacg<210〉 8<211〉 18<212> DNA<213> 人工序列<220〉<221〉 misc_feature<223〉 引物<400〉 8tgcaactgca caggagga
權利要求
1.一種制備抗生素或其它有用次生代謝物產量進一步提高的菌株的方法，該方法包括對所述菌株的原始菌株中的包含amrE和amkE基因或與其高度同源的基因的雙組份調節系統進行操作，使所述amrE和/或amkE基因或與其高度同源的基因失活，得到突變的菌株，該突變菌株即為抗生素或其它有用次生代謝物產量進一步提高的菌株。
2. 如權利要求l所述的方法，其特征在于，所述方法還包括步驟培養所述 突變菌株，測定其產生抗生素的能力，篩選出抗生素產量進一步提高的菌株。
3. 如權利要求l所述的方法，其特征在于，所述菌株是選自地中海擬無枝菌 酸菌U，co/afo;w& me^emmd)或具有相似代謝調控機制并包含"臟￡禾口/或 amA五基因或與其高度同源的基因的雙組份調節系統的微生物菌株。
4. 如權利要求l所述的方法，其特征在于，將所述rnn^和/或amA^基因 或與其高度同源的基因敲除，得到突變的菌株。
5. —種采用權利要求l所述的方法制得的菌株，它選自地中海擬無枝菌酸 菌(J，co/^o戸^度^emme/)或具有相似代謝調控機制并包含謹W和/或 基因或與其高度同源的基因的雙組份調節系統的微生物菌株，其中，該菌株包含一 雙組份調節系統，該調節系統中的amr五基因和/或am&五基因或與其高度同源的基 因已失活。
6. 如權利要求5所述的菌株，其特征在于，所述菌株是地中海擬無枝菌酸 菌(ylm3/c0/ato戸's med"e ra^)的菌株。
7. —種生產抗生素的方法，其特征在于，所述方法包括(a) 培養權利要求5所述的菌株；和(b) 從培養物中收集所述菌株產生的抗生素。
8. 如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述抗生素是利福霉素。
9. 如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述菌株為地中海擬無枝菌酸菌。
10. —種DNA分子，它含有SEQ ID NO: 1所示第456-1139位和/或第 1178-2533位核苷酸序列。
全文摘要
本發明涉及控制細菌的雙組份調節系統尤其是其中的amrE和/或amkE基因或與其高度同源的基因的方法來提高抗生素及其它有用的次生代謝產物的產量的方法。
文檔編號C12N1/21GK101153274SQ20061011675
公開日2008年4月2日 申請日期2006年9月29日 優先權日2006年9月29日
發明者丁曉明, 姜衛紅, 崔明學, 晟 楊, 楊蘊劉, 焦瑞身, 金 王, 穎 王, 趙國屏, 邵志會 申請人:中國科學院上海生命科學研究院