一種香草酸甲酯的制備方法

專利名稱：一種香草酸甲酯的制備方法
技術領域：
本發明涉及微生物技術領域，具體涉及一種用麥角菌(Clavicepssp.) CGMCC N.o.3997制備香草酸甲酯的方法。
背景技術：
香草酸酯類，如香草酸甲酯及香草酸乙酯，是一類用途十分廣泛的香料，不 僅可作為香水，護膚護發，化妝品，理發用品，空氣清新劑，止汗露以及房屋 除臭劑等化工產品的添加劑，還可用作許多食品調味劑，用于食品、煙草、調 味品和日化香精中，是很好的定香劑。
香草酸甲酯還是合成很多藥物的原料，合成許多化工產品的原料和前體物質。
目前，絕大多數的香草酸甲酯來源于化學合成，少量取自植物，香草酸甲酯 也是許多葡萄酒的主要揮發性香味成分，其來源是釀酒酵母或其它細菌將葡萄 中含有的香草酸甲酯葡萄糖苷類物質水解，并釋放出來。
香草酲是香草酸甲酯化學合成的重要前體。市場上供應的香草醛有兩種:(l) 化學合成的香草醛，世界年銷量超過10,000噸，主要以愈創木酚和木質素為原 料合成，其市場價格較低。(2)天然香草醛，是指由動植物材料經物理(包括蒸餾、 萃取)方法、酶法或微生物方法得到的。從植物中提取的天然香草醛主要來自天 然香子蘭花莢的醇提物，這種來源的天然香草醛價格遠遠高于合成產品的價格 (曾有報道稱達300倍之多)。天然香草酸的價格昂貴， 一方面是由于香子蘭花 莢的來源非常有限，受產地、天然因素的影響，培育、收獲和處理勞動強度大， 成本高昂，特別是香子蘭種植過程中需要對花朵進行人工授粉，難以大規模種 植。另一原因是人們對天然香味物質的青睞有加。
天然香草醛的市場需求日益增長，作為一種安全、可靠的香料和原料藥中間 體，其越來越受到重視。
目前使用的香草酸甲酯與香草醛的情況十分相似，大多數來源于化學合成； 而來自于植物根莖的天然香草酸甲酯由于來源困難、提取耗費成本高、消耗大， 因而代價十分昂貴。若能通過微生物發酵來工業化制備，由于在原材料來源、 成本、產能、生態、環保效益等諸多方面顯示出極大優勢，必將成為一大突破 亮點。來自于微生物制備的香草酸甲酯有望替代昂貴的植物來源產物或化學合 成產物而成為安全的天然綠色產品。

發明內容
本發明所要解決的技術問題就是用微生物培養的方法，即香草酸甲酯可從麥
角菌(Clavkepssp.) CGMCC No.3997經培養、發酵、純化提取而得。本發明將 菌種在培養基上分別進行斜面培養、種子培養以及發酵培養，再分離純化得到 產物香草酸甲酯。本發明的方法開創了用麥角菌或同類菌種甚至用生物方法制 備香草酸甲酯的先河。 一種的制備方法，其特征在于是
培養基
1. 斜面培養基(PDA) (%):馬鈴薯提取物20，葡萄糖2，瓊脂2， pH6.0。
2. 種子培養基(％):葡萄糖10 ，檸檬酸1 ，酵母膏0.01， KH2PO4 0.05， MgS04'7H20 0.03 ， KCI0.03 ， FeS04'7H20 0.0007 ， ZnS04.7H20 0.0006 ，氨 水調pH至5.0。
3. 采用的發酵培養基含有蔗糖l%-30%，擰檬酸0.1%-3.0%,酵母粉 0-0.5%或蛋白胨0-0.1%，無機鹽包括KH2P04， MgS04， KC1， FeS04, ZnS04
等少量。
經試驗比較較優的發酵培養基含有蔗糖1%-10%，擰檬酸0.1%-0.5%，酵
母粉0.01%-0.1%或蛋白胨0.01%-0.1%， KH2PO4 0.05%， MgS04 7H2O0.05%， KC1 0.012%, FeS04 7H:20 0.0007%， ZnS04 7H20 0.0006%。
培養條件
采用二級發酵，冷凍管保藏的菌種接種到斜面培養基，于25'C培養，斜面孢 子成熟后，制備孢子懸液，以孢子懸液接種種子培養基，在搖床上25。C培養4-5 天后，轉接到發酵培養基。發酵培養條件為pH5-7，溫度22-28'C，發酵周期 5-12天。較優發酵培養條件為pH5.0-6.0，溫度23-26。C，發酵周期8-10天。
產物的分離純化
取發酵液離心，取出菌絲體以丙酮浸泡。浸泡液經減壓濃縮后溶解在丙酮 石油醚(10 : 1)中，拌入適量硅膠(200 300.目)混合均勻，適當千燥后將硅
膠裝入己用石油醚丙酮(ioo : l)預先平衡好的硅膠柱中，用石油醚丙酮 (io: l)系統恒定洗脫，分部收集，TLC跟蹤檢測各流出部分，收集合并含 目標產物的部分，減壓濃縮蒸干，得到香草酸甲酯粗品I。
離心獲取的發酵上清液用乙酸乙酯萃取，分出萃取相減壓濃縮。將濃縮液直 接上硅膠層析柱，以石油醚丙酮(50 : i)，石油醚丙酮(io : i)以及石油醚 丙酮(9 : 1)進行梯度洗脫:，分部收集，TLC跟蹤檢測各流出部分，收集合并含
目標產物的部分，減壓濃縮蒸干，得到香草酸甲酯粗品II。
將粗品i和ii合并，得到粗品m。將粗品ni加入已用石油醚丙酮noo: i)
預先平衡好的硅膠柱(40xl.5cm)中進行第二次梯度洗脫，洗脫系統為石油醚 丙酮(ioo : i)，石油醚丙酮(50 : i)，石油醚丙酮(40 : i);分部收集，tlc 跟蹤檢測各流出部分，合并含目標產物的部分，濃縮后得到黃色油狀物質，經
hplc分析，其純度在95%以上。
將上述制備物溶解于少量丙酮，在甲醇中結晶，得白色粉末狀晶體，經HPLC 分析，其純度達98%以上。
分析檢測方法
hplc (定性和定量)
色譜柱ZORBAx80AExtend-C18 (4.6x250mm， 5pm)，流動相，甲醇:水= 60:40，流速1.0ml/min，進樣量5(il，檢測波長254nm。
tlc (定性)
采用Merck硅膠層析板GF254，展開體系如下
石油醚:丙酮=5:2 RfK)..5
氯仿:甲醇=9:1 Rf=0.46 產物的理化性質
項目 性質描述
外觀白色粉末狀結晶
溶解性易溶于乙醇或丙酮等有機溶劑，難溶于甲醇，
不溶于水
熔點rc)64 70
質譜183.09 CM+H)， 205.07(M+Na)
ESI-MS(m/z)
分子量182
分子式C9腦04
UV ;axeth咖乂nm)220、 265、 295
產物化學結構的確證:
根據理化性質、紫外、質譜、氫譜和碳譜以及碳氫相關譜的綜合分析，并參 照文獻報道數據進行對比，確定所得到的物質為香草酸甲酯。結構如下


圖l.為精制后樣品的HPLC圖譜。
具體實施例方式
以下是本發明的實施例，但本發明的內容并不局限于此。 實施例1 搖瓶發酵
取冷凍管保藏的麥角菌CGMCC No.3997菌種接種到斜面培養基，于25°C 培養，斜面孢子成熟后，制備孢子懸液。以孢子懸液接種種子培養基，在搖床 上25'C培養4天，將種子培養液以10%接種量轉種到搖瓶發酵培養基。發酵培 養基配方為(％):蔗糖IO，檸檬酸O.l，蛋白胨0.02， KH2P04 0.05, MgS(V7H20 0.05， KC1 0.012， FeS04.7H20 0.0001， ZnS04'7H20 0.0006;氨水調pH至5.8; 發酵溫度26"C，發酵周期9天。
實施例2 搖瓶發酵
同實施例1獲取種子培養液后，以10%接種量轉種到搖瓶發酵培養基。發 酵培養基配方為(％):蔗糖3，檸檬酸0.3，蛋白胨0.08， KH2P04 0.05, MgSO4'7H2O0.05， 〈C1 0.012， FeS04.7H20 0.0001 ， ZnS04'7H20 0.0006;氨水 調pH至5.^發酵溫奪24^，發酵周期8天。
搖瓶發酵
同實施例1獲取種子培養液后，以10%接種量轉種到搖瓶發酵培養基。發 酵培養基配方為(％):蔗糖2，檸檬酸0.4，酵母粉0.01, KH2P04 0.05， MgSO4'7H2〇0.05， KC1 0.012， FeS04.7H20 0.0001 ， ZnS04.7H20 0.0006;氨水 調pH至6.0;發酵M度23。C,發酵周期10天。
實施例4 玻璃發酵罐發酵
同以上實施例獲取種子培養液后，以10q/。接種量轉種到裝有4L發酵培養基 的10L玻璃發酵罐中。發酵培養基配方為(X):蔗糖5，擰檬酸0.5，酵母粉0.06， KH2PO4 0.05， MgSO4'7H2O0.05， KC1 0.012, FeS04.7H20 0.0001 ， ZnS04.7H20 0.0006;氨水調pH至5.5;發酵溫度25。C，發酵周期8天。
實施例5 產物的粗制
如實施例4方法發酵收集發酵液。兩罐合并得發酵液約7L，離心后取出菌 絲體約600g,以600ml丙酮浸泡。浸泡液經減壓濃縮后溶解在20ml丙酮石油 醚(10 : 1)中，拌入25g硅膠(200 300目)混合均勻，適當干燥后將硅膠裝
入已用石油醚丙酮(ioo : i)預先平衡好的硅膠柱中，用石油醚丙酮(io : i) 系統恒定洗脫，分部收集，tlc跟蹤檢測各流出部分，收集合并含目標產物的 部分，減壓濃縮蒸干，得到香草酸甲酯粗品I 。
離心獲取的發酵上清液用等量乙酸乙酯萃取，分出萃取相減壓濃縮。將濃 縮液直接上硅膠層析柱，以石油醚丙酮(50 : i)，石油醚丙酮(io : i)以及石 油醚丙酮(9 : l)進行梯度洗脫，分部收集，TLC跟蹤檢測各流出部分，收集合 并含目標產物的部分，減壓濃縮蒸干，得到香草酸甲酯粗品II。
將粗品i和n合并，得到粗品m。將粗品m加入已用石油醚:丙酮(ioo: i)
預先平衡好的硅膠柱(40xl.5cm)中進行第二次梯度洗脫，洗脫系統依次為石
油醚丙酮(ioo : i)，石油醚丙酮(50 : 1)，石油醚丙酮(40 : i);分部收集, tlc跟蹤檢測各流出部分，，合并含目標產物的部分，濃縮后得到黃色油狀物質，
經HPLC分析，其純度在95%以上。
實施例6 產物的精制
將實施例5所述制備物溶解于少量丙酮，在甲醇中結晶，干燥后得白色粉 末狀晶體約230mg，經HPLC分析，其純度達98%以上。
權利要求
1.一種香草酸甲酯的制備方法，其特征在于是從麥角菌(Claviceps sp.)CGMCCNo.3997經培養、發酵、純化提取而得。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于采用的發酵培養基含有蔗糖 1%-30%，檸檬酸0.1%-3.0%，酵母粉0-0.5%或蛋白胨0-0.1%，無機鹽包 括少量KH2P04， MgS04, KC1， FeS04， ZnS04等，發酵培養條件為pH5-7，溫度22-28 ，發酵周期6-14天。
3. 根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于發酵培養基含有蔗糖1%-10%，檸檬酸0.1%-0.5%，酵母粉0.01%-0.1%或蛋白胨0.01%-0.1%， KH2P04 0.05%， MgSO4-7H2O0.05%， KC1 0.012%， FeS04-7H20 0細7%， ZnS04-7H20 0.0006%，發酵培養條件為pH5.0-6.0，溫度23-26 ，發酵周期8-10天。
全文摘要
本發明涉及一種通過培養麥角菌CGMCC No.3997菌株制備香草酸甲酯的微生物方法，即在含有可利用的碳源和氮源以及無機鹽的營養培養基上分別對CGMCC No.3997菌株進行斜面培養、種子培養以及發酵培養，獲得的發酵液中生成有香草酸甲酯產物，從培養液中分離、純化得到高純度的香草酸甲酯。本發明開創了用麥角菌或同類菌種甚至用生物方法制備香草酸甲酯的先河，具有多方面的優勢。
文檔編號C12P7/62GK101200736SQ20061014727
公開日2008年6月18日 申請日期2006年12月14日 優先權日2006年12月14日
發明者楊志鈞, 羅敏玉, 許向前, 陳代杰 申請人:宋征宇