進行微陣列檢測的方法

專利名稱：進行微陣列檢測的方法
進行微陣列檢測的方法
技術領域：
本發明涉及生物學液體中單個生物化合物的定量和/或定性分析或測 定。具體而言，本發明涉及一種用于進行微陣列檢測的改進、廉價而有效 的方法。更具體而言，本發明涉及一種方法，其用于執行來自一個微陣列 檢測中 一份或多份樣品的幾種生物化合物的差異標記。
含有一種或多種其他分子的生物樣品中的多個特異靶生物化合物(例如
但不限于DNA、 RNA或蛋白質)的存在和濃度可以通過使用所謂的微陣列 技術在單個實驗中進行測定。在該技術中， 一組特異的探針分子被固定化
在一塊固相表面的特定位點，之所以選擇其中每個特異探針分子是為了與 某個特定靶特異地相互作用。另一方面，靶生物化合物被可檢測的分子(例 如熒光團或磁珠)標記。通過將生物樣品與所述固相表面接觸，靶生物化合 物將會被固定在對應于其特異探針的位點。然后通過定位和測量結合到靶 上的可檢測分子所產生的信號強度，分別進行靶生物化合物的檢測及其在 生物樣品中濃度的測定。
例如WO03/004162公開了該方法，其中一塊表面上排列了 3種不同的 寡核苷酸DNA探針，并與3種不同的互補DNA靶的樣品庫雜交。靶以熒 光標記物(異硫氰酸熒光素)修飾以允許直接在表面上檢測。由于樣品接觸表 面，特異靶被探針從溶液中俘獲到表面，并且以落射熒光顯微鏡進行檢測。 WO03/004162公開了上述一般方法的幾種改進之處，例如使用多孔基底以 允許樣品通過流過所述基底(任選地可經反復使用抽吸系統)使樣品接觸探 針。該方法具有顯著加固雜交的優點。另外一個改進是使用了用于控制樣 品溫度的熱處理室。由于雜交是溫度依賴性的現象，溫度控制為例如核酸 分析提供了優點。
但是，該現有技術方法沒有提供方法來同時對一份以上樣品(例如健康 人血液與患病患者血液)或單次實驗中的單份生物樣品中存在的兩種不同類 型的生物化合物(例如RNA和DNA)執行微陣列技術。這些局限導致了定量 和/或定性分析或測定數種生物液中單個生物化合物和/或屬于不同類型生
物化合物的單個生物化合物所需時間大大增加，因此也大大增加了所需成 本。
因此技術領域需要一種改進的、更快速和更有效的方法來同時對一份 以上生物樣品或對單個實驗中一份生物樣品中存在的兩種或更多類型的生 物化合物執行微陣列技術。
正如本文所使用，除非另有說明，術語"類型"在應用于靶生物化合物時 系指一組分子結構相關的化合物。本發明涉及的靶生物化合物的例示性類
型包括但不限于DNA生物化合物、RNA生物化合物、多肽、酶、蛋白質 和抗體等。
正如本文所使用，除非另有說明，術語"微陣列"系指一種陣列，其中一 種包含靶生物化合物的樣品，優選為生物學液體樣品(任選地含有懸浮于其 中的少量固體或膠體顆粒)與一種在其表面上包括多個離散且隔離區域的基 底(例如膜)接觸(例如通過)，每個所述區域具有一種施加于其上的探針(例如 通過點樣)，而且之所以選擇所述每一種探針是因為其與每一類型生物化合 物中最多一個靶生物化合物結合時具有一些特異性，優選地為在嚴格性條 件下的特異性，優選地為在高度嚴格性條件下的特異性。正如技術人員所 熟知，結合條件的嚴格性涉及一系列參數，例如溫度、離子濃度和pH。
正如本文所使用，除非另有說明，術語"靶"系指固定作為分析目標或分 析點的分子化合物。它包括分子化合物，例如但不限于核酸和相關化合物(例 如DNA、 RNA、寡核苷酸或它們的類似物、PCR產物、基因組DNA、細 菌人工染色體、質粒等)、蛋白質和相關化合物(例如多肽、單克隆抗體、受 體和轉錄因子等)、抗原、配體、半抗原、糖類和相關化合物(例如多糖和寡 糖等)、細胞器、完整細胞等。
正如本文所使用，除非另有說明，術語"探針"系指被固定到基底表面上 和/或基底內并可與生物樣品中的"耙"特異地相互作用的生物物質，其被用 于檢測所述特異靶的存在。它包括分子化合物，例如但不限于核酸和相關 化合物(例如DNA、 RNA、寡核苷酸或它們的類似物、PCR產物、基因組 DNA、細菌人工染色體和質粒等)、蛋白質和相關化合物(例如多肽、單克隆 抗體、受體和轉錄因子等)、抗原、配體、半抗原、糖類和相關化合物(例如 多糖和寡糖等)、細胞器和完整細胞等。
正如本文所使用，除非另有說明，術語"標記物"系指其物理分布或/和 其發出的信號強度易于檢測到的劑，例如但不限于發光分子(例如熒光劑、 磷光劑、化學發光劑和生物發光劑等)、有色分子、反應時產生顏色的分子、 酶、磁珠、放射性同位素、可特異結合的配體和可被聲共振法檢測的微泡 等。
正如本文所使用，除非另有說明，術語"標記"系指將標記物摻入探針的 動作。
概括來說，本發明第一方面涉及一種在單個微陣列檢測中對源自一份 或多份樣品的幾種生物化合物同時進行差異標記的方法。本發明第二方面 還涉及在單個微陣列檢測中對源自一份或多份樣品的幾種生物化合物進行 差異標記的方法中使用基底，例如但不限于無機晶片或有機膜。
概況而言，本發明涉及一種對包含靶生物化合物的一份或多份樣品液 進行微陣列檢測的方法，所述方法包括用標記物標記所述靶生物化合物， 將所述樣品液與基底接觸并檢測所述基底的表面上所述標記物的存在，其 中所述方法適合于在一個微陣列中同時分析一份或多份樣品液中的一種或 多種類型的耙生物化合物，以及其中
(i) 每一所述類型的生物化合物以不同的標記物進行標記，以使屬
于不同樣品液的靶生物化合物具有不同的標記物；
(ii) 耙生物化合物類型的數量和樣品液的數量中的至少一個為至少
2，以及
(iii) 所述不同標記物在所述基底的表面上經檢測可區分開來。 本發明的一個重要特點是在單次執行所述方法中同時使用了至少兩種
不同的標記物。本發明的另外一個重要特點是通過標準的標記物檢測方法 應可區分開至少兩種不同的標記物。通過下面二者任一方法，該特點允許 實現分析方法中時間的大量節省。
-同時測定來自不同樣品的分析物(例如在一次實驗中分析血樣和痰樣 中的DNA含量)，或
-同時測定來自多個樣品的分析物的差異表達(例如在單次執行所述方 法中分析來自健康患者的血樣和來自患病患者的血樣中的DNA含量)，例 如出于比較目的，或
-同時測量或分析來自相同樣品的不同類型的靶生物化合物(例如在單
次執行所述方法中分析一份血樣中的DNA含量和RNA含量)，或
-同時測量來自不同樣品的不同類型的靶生物化合物(例如在單次實驗 中分析一份血樣和一份痰樣中的DNA含量和RNA含量)。
當樣品(優選為流體樣品)中存在的待分析耙生物化合物為分子時，例如 但不限于下列分子時，本發明的方法特別有用
-具有約5個氨基酸單位到50個氨基酸單位的寡肽，
-具有50個以上氨基酸單位的多肽，
-包括酶在內的蛋白質，
-寡核苷酸和多核苷酸，
-抗體或抗體的片段，
-RNA，以及
國DNA。
對于某些靶生物化合物，變性步驟可能是有利的，例如雙鏈DNA可以 分離成單鏈以允許單鏈DNA特異結合點樣到膜上的俘獲探針。該變性步驟 可以便利的方式進行，例如通過加熱基底(晶片或膜)或樣品或加熱二者。當 在該變性步驟中加熱樣品時，可進行一個任選的冷卻步驟以使鏈保持分離。 用于在所述方法第一步中標記所述靶生物化合物并最終允許在所述方 法的最后一步對它們進行檢測的標記物可以是發光的(例如熒光、磷光或化 學發光)、放射性的、酶的、比色的，聲的(例如微泡共振)或磁性的。可特 異結合的配體可以用于替代標記物。在最后一種情況下，所述配體將在下 一步結合一個帶標記物的相容性劑。
合適的熒光或磷光標記物為例如但不限于熒光素、Cy3、 Cy5等。 合適的化學發光標記物為例如但不限于魯米諾、賽盧姆(cyalume)等。 合適的放射性標記物為例如但不限于同位素如125I或32P。 合適的酶標記物為例如但不限于辣根過氧化物酶、P-半乳糖苷酶、熒光 素酶、堿性磷酸酶等。
合適的比色標記物為例如但不限于膠體金等。 合適的聲標記物為包括但不限于微泡等。 合適的磁珠為例如但不限于免疫磁珠(Dynabeads)等。
每一靶生物化合物可用多達約300個相同的標記物進行標記(例如在一 個最終的PCR擴增步驟中)以增加敏感性。作為一個任選步驟，沒有摻入靶 生物化合物中仍存在于樣品液中未結合的標記物可通過化學和/或物理處理 (例如化學PCR純化、透析或反相滲透)從樣品液中除去以減少后續測量中 的背景信號。
樣品液可來自工業或天然來源。適合于執行本發明所述方法的樣品液 的實例可為但不限于來自包括哺乳動物(尤其是人類)、鳥類和魚類在內的任 何動物的體液例如痰、血液、尿液、唾液、糞便或血漿。其他非限制性實 例包括來自植物、線蟲和細菌等含有生物材料的液體。對于本發明所述方 法適宜執行的唯一要求是所述生物材料以基本上為流體、優選液體、例如 合適的溶解介質中的溶液的形式存在。用于本發明所述方法中的樣品液的 體積可以取約5 nl到1 ml之間的任意值，優選地為約50 pi到400 之間 的任意值。
在許多情況下，直接將緩沖液(例如雜交緩沖液)摻入到待分析的樣品液 中或將緩沖液作為檢測單元的組成部分(例如以流體或凍干形式加入到基底 的上面或下面)是可取的，因此無需單獨的雜交緩沖液儲存區域。
探針施加(例如點樣)于其上的基底不是本發明的限制性特點，因此可以 用技術領域已經描述的任何材料制造成用于微陣列檢測的適宜基底。此類 材料的非限制性實例一般包括
-有機聚合物，例如聚酰胺同聚物或共聚物(例如尼龍)、熱塑性氟化聚 合物(例如PVDF)、聚鹵乙烯、聚砜、纖維素材料例如硝酸纖維素或醋酸纖 維素、聚烯烴或聚丙烯酰胺和
-無機材料，例如玻璃、石英、二氧化硅、其他含硅的陶瓷材料和金屬 氧化物材料例如氧化鋁等。
這些材料可以是活化的或未活化的。如果是活化的，可以通過化學或 物理處理進行活化。適宜的活化方法包括但不限于等離子、電暈、UV或火 焰處理和化學修飾。根據材料的種類，特別是有機聚合物材料的種類，適 宜的化學修飾包括但不限于引入季銨離子(例如引入到聚酰胺)、溶劑分解 (例如水解)、酰胺基衍生為脒基(例如在聚酰胺中)、羥基化、羧基化或硅垸 化。對于本發明所述方法的適宜執行不需要活化的基底材料的非限制性實
例是尼龍(聚酰胺同聚物)，特別是用于DNA或RNA分析時，這是因為它 對寡核苷酸和多核苷酸具有內在的親和力。
用于本發明所述方法的基底可以是多孔的或非多孔的。如果基底為非 多孔的，可只需將所述非多孔基底與樣品液接觸進行雜交，優選情況下利 用一些攪拌和足夠長的時間以使雜交發生(例如約4到20小時范圍內的一段 時間)。
如果基底是多孔的，優選地將所述樣品液通過所述多孔基底進行雜交。 例如可以將樣品液以單向或雙向抽吸一次或多次通過多孔基底來實現雜 交。還可以通過將多孔基底本身移動一次或多次通過樣品液以迫使樣品液 通過所述多孔基底的孔隙而實現雜交。例如，基底可以以垂直于所述基底 平面的方向相對移動到含有樣品液的室。
如果基底為多孔的，它可包括一個具有許多各種幾何形狀和大小的孔、 開口和/或通道的網絡。基底可為納米孔或微米孔，即孔、開口和/或通道的 平均大小可適宜地被包含在0.05 pm到10.0 jam之間，優選地在0.1 到 l.Opm之間，更優選地在0.3到0.6nm之間。根據所述基底的生產技術， 孔度分布可基本一致或它可具有約1.1到約4.0的多分散性。對應于孔、開 口或通道的表面可代表多孔基底上表面或下表面約1到99%之間、優選為 約10%到90%之間、更優選為約20%到80°/。之間的總表面。
基底(例如膜)的厚度不是本發明的限制性特點，它可以在約10pm到1 mm,優選為50 nm到400 pm，更優選為70 到200 之間變化。基底 (例如膜)的形狀不是本發明的限制性特點。它可以為環狀，例如具有約3到 15 mm之間的直徑，但是本發明所述方法也可應用于其他任何形狀和/或大 小的基底。
選擇適宜于本發明的探針時，應考慮到它們對靶生物化合物的親和力 或它們對所述靶生物化合物的相關修飾的親和力。例如，如果靶生物化合 物是DNA，探針可以但不限于為合成寡核苷酸、它們的類似物或特異抗體。 靶生物化合物合適修飾的一個非限制實例是生物素取代的靶生物化合物， 其中探針可具有抗生物素蛋白功能。
為了更易支持隨后的檢測和鑒定，還可以在基底的表面上點上一個或 多個另外的點(例如用于強度校正和/或位置檢測)。
點樣后，或是因為基底(如膜)內在或獲得(例如通過活化)的屬性而自發 性固定，或是通過一個附加的物理處理步驟(例如但不限于交聯，如通過干 燥、加熱或暴露在光源下)而固定，探針被固定在基底的表面上。
為了改進基底(如膜)和附著于其上的探針的保存期，在膜未使用時對其 干燥可能是有所幫助的。此后膜與樣品液接觸重新水化。
一旦將探針應用(例如通過噴墨點樣)于基底的膜表面，加入一有效量的 封閉劑以滅活基底未點樣的區域對于防止靶生物化合物或未結合標記物非 特異性地結合到未點樣區域(那將導致不需要的背景信號)以增加信噪比可 能是有所幫助的。合適的封閉物質或封閉劑的實例一般包括但不限于鮭魚 精子、脫脂牛奶或聚陰離子。
就多孔基底而言，在預先確定數量的抽吸循環后例如每一抽吸循環后， 或在預先確定數量的基底移動循環后例如每一基底移動循環后，定量測定 標記物的存在可能是有用的。該定量測定的結果結合對實際基底和/或樣品 液溫度的了解，.可允許測定靶生物化合物的一些動力學性質。將樣品液加 熱到一個確定的溫度，經給予更為嚴格的結合條件，可允許實現對結合性 質尤其是結合特異性更為精確的控制。該結合步驟也可通過加熱膜或樣品 液或二者而得到實現。在達到所需溫度后，然后將樣品液與基底接觸。
所述方法的敏感性和/或結合特異性還可通過適宜的方法而提高，這些 適宜的方法例如但不限于-
-使用適宜的溫度曲線(例如一系列的一步或多步加熱步驟，任選地在連 續加熱步驟之間具有足夠的平衡次數)，
-調整基底移動循環的數量，以及
-一個測量系列的測得標記物信號的信號后處理(例如熒光圖像的圖像 處理)，以及
-測定被俘獲的耙生物化合物最適結合或再次分離的溫度。 例如，提高溫度時，測得信號的急劇下降表明已經達到了某個俘獲探 針-靶生物化合物復合物的分離(熔解)溫度。該性質可以用于區分特異與非 特異結合。為了進一步提高特異性，測量循環在超過熔解溫度臨界值后可 繼續下去，這一次溫度持續下降以確認靶生物化合物的重新結合在適宜的 特定熔解溫度下會再次發生。
所述方法的一個任選最終步驟在于從檢測室內除去殘留樣品液以進一 步降低由未結合的標記物和/或分子引起的背景信號。
所述檢測室的幾何形狀優選地以這樣一種方式設計，使得未結合的標 記物和/或生物化合物在測量時被屏蔽于檢測系統，例如(在標記物是發光分 子的情況下)通過阻斷膜下樣品液發射出光線的光路，或通過移動膜使其接 近透光窗從而驅趕開上清。通過內置的攪拌器攪拌上清可以進一步減少背 景信號。樣品液的去除以及檢測室幾何形狀的設計確保了朝向檢測系統的 基底表面以及膜的對側具有極少量的樣品液形成的表面層。這減少了來自 未結合標記物和/或未結合生物化合物的背景信號。
基底與樣品液接觸一段合適的時間后，例如在適宜數量的通過多孔基 底的樣品抽吸循環或適宜數量的膜移動循環后，檢測和測量結合到探針上 的靶生物化合物的標記物。此外，還可在移動膜的過程中測量標記物。
觀測到的每個信號的物理位置、性質和強度可允許鑒定哪個靶生物化 合物被俘獲，鑒定該靶生物化合物源自哪個樣品和/或它屬于哪種類型的生 物化合物和分析其濃度。
在本發明所述方法的最后一步中可通過含有落射熒光顯微鏡和
CCD(電荷耦合器件)相機或任何其他種類的相機的光學裝置進行基底分析。 就熒光或磷光標記物而言，該光學裝置優選地包括一個可在其相應激發波 長處激發標記物的光源(優選為uv)。
化學發光標記物的檢測是例如通過向標記物加入適宜的反應物并借助 顯微鏡觀察其熒光而進行的。
放射性標記物的檢測是例如通過將醫用X-射線膠片直接與基底對置而 進行的，該X-射線膠片因暴露于標記物而顯影并形成對應于目的探針安放 位置的暗區。
酶標記物的檢測是例如通過向標記物加入適宜的底物并觀察該酶催化 的反應結果(例如顏色變化)而進行的。
比色標記物的檢測是例如通過向標記物加入適宜的反應物并觀察由此 形成的外觀或顏色的改變而進行的。
聲微泡標記物的檢測是例如通過將所述標記物暴露于特定頻率的聲波 并記錄由此形成的共振而進行的。
磁珠的檢測是例如通過磁性傳感器而進行的。
本發明所述方法經參照大量參數在上文得到了描述，其中每個參數都 包括優選或甚至更優選的取值或實施方式的可能選擇。應理解的是，除非 參數的一定組合另有解釋，用于這一參數的每一優選范圍或實施方式可與 用于一個或多個其他參數的每個優選范圍或實施方式隨意組合。
本發明將針對下列實施例解釋的某些工作實施方式并參照附圖中進行 描述。但這些實施例僅用于說明本發明，不應視為以任何方式限制本發明。
實施例1


圖1示出了本發明的第一工作實施方式。在圖1的左側，第一流體樣
品(12)中的耙DNA分子(ll)被第一種標記物(13)標記，以生成標記的靶 DNA分子(14)。在圖1的右側，第二流體樣品(16)中的靶DNA分子(15)被 第二種標記物(17)標記以生成標記的靶DNA分子(18)。在圖1的中部，兩 份樣品混合在一起以形成混合物(19)，該混合物然后被迫通過基底(110)。 實施例2
圖2示出了本發明的第二工作實施方式。在圖2的上方，兩種不同的 標記物(21)和(22)被摻入一份樣品(23)中兩種不同類型的靶分子(RNA分子 (24)和DNA分子(25))，以在所述樣品中生成標記的RNA分子(27)和標記的 DNA分子(26)。所述樣品然后被迫通過基底(110)。
權利要求
1、一種用于對含有靶生物化合物的一份或多份樣品液進行微陣列檢測的方法，所述方法包括以標記物標記所述靶生物化合物，將所述樣品液與基底接觸并檢測所述基底的表面上所述標記物的存在，其中所述方法適合于在一個微陣列中同時分析一份或多份樣品液中的一種或多種類型的靶生物化合物，以及其中(i)每一所述類型的生物化合物以不同的標記物進行標記，以使屬于不同樣品液的靶生物化合物具有不同的標記物，(ii)靶生物化合物類型的數量和樣品液的數量中的至少一個為至少2，以及(iii)所述不同標記物在所述基底的表面上經檢測可區分開來。
2、 如權利要求1所述的方法，其中將所述樣品液通過所述基底。
3、 如權利要求1或權利要求2所述的方法，其中所述基底是多孔基底。
4、 如權利要求1至3任一項所述的方法，其中所述基底包括聚合物。
5、 如權利要求1至4任一項所述的方法，其中所述基底包括聚酰胺同 聚物或共聚物。
6、 如權利要求5所述的方法，其中通過引入季銨、溶劑分解或將酰胺基衍生為脒基來修飾所述聚酰胺同聚物或共聚物。
7、 如權利要求1至4任一項所述的方法，其中所述基底包括纖維素材料。
8、 如權利要求1至4任一項所述的方法，其中所述基底包括熱塑性氟 化聚合物。
9、 如權利要求1至8任一項所述的方法，其中所述不同標記物包括發 光分子。
10、 如權利要求l-9任一項所述的方法,其中所述不同標記物選自磁珠、 放射性同位素、酶、有色分子和微泡。
11、 聚合物基底在進行微陣列檢測的方法中的用途，包括將一份或多 份樣品液與基底接觸，其中所述方法允許在一個微陣列中同時分析一份或 多份樣品液中的一種或多種類型的靶生物化合物，其中靶生物化合物類型 的數量和樣品液的數量中的至少一個為至少2。
全文摘要
本發明公開了一種用于對一種份多份樣品液進行微陣列檢測的方法，所述樣品液包含靶生物化合物。所述方法包括以標記物標記所述靶生物化合物的步驟。下一步驟包括將所述樣品液與基底接觸和檢測所述基底表面上所述標記物的存在。所述方法適合于在一個微陣列中同時分析一份或多份樣品液中一種或多種類型的靶生物化合物。出于這一目的，每一所述類型的生物化合物以不同的標記物進行標記，以使屬于不同樣品液的靶生物化合物具有不同的標記物。所述不同標記物在所述基底的表面上經檢測可區分開來。本發明還公開了聚合物基底在進行微陣列檢測的方法中的用途。
文檔編號C12Q1/68GK101341261SQ200680048114
公開日2009年1月7日 申請日期2006年12月11日 優先權日2005年12月21日
發明者A·博斯, G·呂德克, J·巴赫爾 申請人:皇家飛利浦電子股份有限公司