專利名稱：一種生產大片吸蟲組織蛋白酶l1的方法
技術領域：
本發明屬于生物化學領域，尤其涉及酶的生產方法，特別是一種生產
大片吸蟲組織蛋白酶L1的方法。
背景技術：
片吸蟲病是由片形科片形屬的大片吸蟲和肝片吸蟲寄生于牛羊等哺乳 動物的肝臟和膽管內而引起的一種片形吸蟲病。能引起宿主急性或慢性肝 炎和膽管炎，并伴有全身性的中毒現象和營養障礙，危害相當嚴重，特別 對幼崽和綿羊，可以引起大批死亡。在慢性病程中，使牛羊消瘦、發育障 礙，生產力下降，并成為廢物。該病在我國分布極其廣泛，給畜牧業帶來 極大綠濟損失。該病也可感染人，嚴重影響人類的身體健康，是一種重要 的人畜共患病。
現有技術中，片形吸蟲病的診斷分為臨床診斷和實驗室診斷。實驗室
診斷又可分病原檢查和免疫學檢測。病原檢査包括反復沉淀法，硝酸鉛 漂浮法和尼龍篩集卵法，以上方法的檢出率較低，而且易造成漏檢，只有 當蟲體在體內發育成熟時才能從糞便中檢出蟲卵，這時蟲體在移行時對器 官己造成損傷，這樣就延誤了有效治療時間而影響了對該病的控制。免疫
檢測方法包括血凝試驗(Indirect Haemagglutination, IHA)，酶聯免 疫吸附試驗(ELISA)，酶聯免疫印漬技術(ELIB)和斑點免疫金滲漏法 (DIGFA)等，與病原檢查相比，免疫檢測方法具有檢出率高，特異性強， 敏感性高等優點，但診斷用抗原基本上都是蟲源的，其獲取方法繁瑣且無 法標準化。這又給片形吸蟲病的確診帶來一定困難。
發明內容
本發明的目的在于提供一種生產大片吸蟲組織蛋白酶L1的方法，所述 的這種方法生產大片吸蟲組織蛋白酶L1的方法要解決現有技術中用于診 斷片形吸蟲病的抗原獲取困難的技術問題。
本發明一種生產大片吸蟲組織蛋白酶L1的方法，包括如下步驟
步驟l，根據大片吸蟲組織蛋白酶Ll基因全長mRNA序列去除信號肽序 列，設計含BamH I和Sal I酶切位點的特異性引物，用PCR從大片吸蟲 成蟲c函A文庫中擴增出如SEQ ID NO: 1所示的大片吸蟲組織蛋白酶L1基 因；
步驟2，將組織蛋白酶Ll全長基因連接到一個載體上，形成重組載 體，用BamH I和Sal I分別酶切重組載體和表達載體，對酶切產物進行 純化，然后用連接酶進行連接，形成重組質粒，將重組質粒轉化入大腸桿 菌中進行增殖，PCR鑒定正確后，測序確認；
步驟3，取鑒定正確的重組質粒轉化大腸桿菌，于含氨節的培養基培 養，一30^44'C搖菌至OD600值0.4 0.6時，加入IPTG使其終濃度為0. 8 一1.2mM，誘導表達，收集菌液，離心棄上清，備用；
步驟4，收集沉淀用尿素溶解，透析復性20—30h，濾膜過濾；
步驟5,把樣品加入預先用水洗緩沖液處理好的蛋白純化柱中，反復過 柱2—5.次，然后繼續用水洗緩沖液沖洗，最后用洗脫緩沖液洗脫蛋白，得 到大片吸蟲組織蛋白酶L1蛋白。
進一步的，所述的含BamH I I酶切位點的特異性引物為
5' -CGG GAT CCA ATG ATG ATT TGT GGC ATC A-3'，
所述的含Sal I酶切位點的特異性引物為
5' -ACG TCG ACT CAC GGA AAT CGT GCC AC-3'。進一步的，用PCR從大片吸蟲成蟲cDNA文庫中擴增出大片吸蟲組織蛋 白酶L1基因時的PCR參數為94°C、 5 min; 94°C、 30 s， 55°C、 30 s， 72°C、 2 min， 30個循環;72°C、 10 min。
進一步的，所述的重組載體為pMD18-T/FgCLl，所述的表達載體為 pGEX-4T-2。
進一步的，在所述的步驟2中，所述的大腸桿菌為DH5a 。 進一步的，在所述的步驟3中，所述的大腸桿菌為BL21。 進一步的，所述的培養基為2XYT培養基。 哮一步的，所述的大腸桿菌細胞的誘導溫度為30。C。 進一步的，本發明還提供了大腸桿菌作為表達系統用來生產大片吸蟲 組織蛋白酶L1的用途。
本發明的原理是半胱氨酸蛋白酶是一類蛋白水解酶，廣泛地存在于寄生 蟲體內，該酶涉及蟲體的毒力、對組織和細胞的侵襲力和免疫逃避等多個方面。 組織蛋白酶L1在片形吸蟲的童蟲和成蟲生長發育階段都有表達，可作為片形吸 蟲病早期診斷抗原。為了獲得高表達的組織蛋白酶L1 (FgCLl)，本發明利 用大腸桿菌表達系統生產FgCLl蛋白，為片形吸蟲病的早期診斷和防治奠 定了基礎。由于目前組織蛋白酶L1已被視為重要的診斷抗原候選抗原之 一。本發明人在研究過程中，發現選擇適當的表達載體，并利用大腸桿菌 表達系統進行表達，可以顯著提高組織蛋白酶的表達水平，利用IPTG進行 誘導蛋白表達，可進一步誘導組織蛋白酶的高表達。
本發明采用的大腸桿菌表達系統由于E.coli易于培養、成本低，表達 蛋白可大量生產，又易于純化，人們對其基因結構及表達調控原理有了較 多的了解，所以廣泛的被人們采用，通常將外源基因導入到大腸桿菌中主要用于蛋白質的大量表達，在蛋白質的純化、定位及功能分析方面有一定 的價值。
本發明和已有技術相比，其效果是積極和明顯的。本發明利用大腸桿菌
表達系統表達了大片吸蟲組織蛋白酶L1，并利用GST親和層析的方法分離純 化FgCLl，表達產量可達700mg/1，從而為片形吸蟲病免疫診斷方法提供了便 利，是一種低廉且產量高的表達FgCLl的方法，其原核表達系統快速、簡 單、低廉，有利于純化，所得產物可以應用于片形吸蟲病的免疫診斷。
圖1為大片吸蟲組織蛋白酶L1全長基因的電泳圖，其中l， 2為 FgCLl擴增產物，3位空白對照，M為DNAMarker。
圖2為pGEX/FgCLl重組質粒的雙酶切圖，其中M為DL2000, 1為PCR 產物，2為pMD18-T/FgCLl BamH I和Sal I雙酶切產物，3為pGEX/FgCLl BamH I和Sal I雙酶切的產物。
圖3為pGEX/FgCLl重組質粒構建示意圖。
圖4為F,CL1的SDS-PAGE電泳圖，其中M為蛋白Marker, 1為BL21 對照，2為未誘導的空載體，3為空載體誘導，4、 5、 6、 7、 8為FgCLl誘 導0.5、 1、 2、 3、 4h收集菌液。
圖5為純化后的FgCLl的SDS-PAGE電泳圖，其中，1為空載體誘導， 2為純化后的FgCLl融合蛋白，3為IPTG誘導pGEX-FgCLl/BL21， M為蛋白 Marker'。
圖6為純化蛋白Western blot圖，其中1， 2為純化蛋白，3為陰性 對照，M為蛋白Marker。
具體率施方式下面通過具體的實施例進一步說明本發明是如何實現的，以下說明不用于限 制本發明的保護范圍。
實施例1重組質粒的構建
1.1組織蛋白酶L1全長基因的克隆
根據Gram等在GeneBank發表的大片吸蟲組織蛋白酶Ll基因全長mRNA序 列，序列號是AF125566，設計一對含BamH I和Sal I酶切位點的特異性引物，
CAT1為5' -CGG GAT CCA ATG ATG ATT TGT GGC ATC A-3'
CAT2為5' -ACG TCG ACT CAC GGA AAT CGT GCC AC-3'
通過CAT1和CAT2從大片吸蟲cDNA文庫中擴增FgCLl基因序列。PCR參數 為94°C 5 min; 94°C 30 s， 55°C 30 s, 72°C 2 min， 30個循環；72°C. 10 min。袖PCR產物利用通過TA克隆連接到pMD18-T Vector上，PCR鑒定正確后 測序(如圖l所示)。
1. 2 pGEX-FgCLl的構建
如圖2、圖3所示，用BamH I和Sal I分別酶切重組載體pMD18-T/FgCLl 和表達載體pGEX - 4T-2， 37。C水浴過夜后終止反應，用DNA膠回收試劑盒(購 自TaKaRa公司)回收FgCLl相應條帶和pGEX-4T-2，純化后的酶切產物用T4連 接酶進行連接，16。C連接過夜，形成重組質粒pGEX-FgCLl。
1. 3重組質粒的鑒定
將重組產物轉化入感受態大腸桿菌DH5 a中，挑取氨芐抗性克隆 (100ug/ml)，接種于LB培養基，37'C振蕩培養過夜，提取重組質粒，經PCR 鑒定正確后測序。
結果，測序證明并未發生移碼突變。 1.4重組質粒的轉化
取鑒定正確的重組質粒lul轉化《coh' BL21 (DE3)中表達。實施例2細胞培養與蛋白誘導表達
挑取單克隆于含氨芐的2XYT培養基培養，37。C搖菌至0D值約0. 4、. 6 時，加入IPTG使其終濃度為lmM，繼續搖菌4h，每小時收集lmL菌液，12000 r/min離心2 min。
誘導表達后蛋白電泳表明，在61KD位置有表達，見圖4。
實施例3分離純化
按上述方法對陽性克隆進行大量誘導表達后用溶菌酶加超聲裂解菌體，經 8M尿素溶解，離心后將上清轉移至透析袋，復性液中4。C透析24 h， 0.22um濾 膜過濾。然后參照High-Affinity GST Resin說明書進行融合蛋白的純化。把樣 品加入預先用Washing buffer處理好的蛋白純化柱中，反復過柱3次，然后繼 續用Washing buffer沖洗，后用Elution buffer洗脫蛋白，見圖5。
實施例4;表達產物的生物特性鑒定
4. 1分子量測定
將收集的細胞沉淀加入1XSDS-PAGE電泳上樣緩沖液振蕩至細菌沉淀物完全 溶解，100 。C水浴5 min， 12000 r/min離心2 min，取上清進行SDS-PAGE電 泳。分離膠和積層膠的濃度分別為12%和5%，加樣20uL、電壓條件分別為 130V和80V，以低分子量標準蛋白作對照。考馬斯亮蘭染色lh，脫色液脫色數 次拍照。
4. 2抗原性檢測
將收集的蛋白進行SDS-PAGE電泳后，100Vlh轉移至硝酸纖維素膜(NC) 上，5。/。脫脂奶粉封閉液中孵育2h，與l: 200自然感染大片吸蟲牛血清(畜禽寄 生蟲病防治技術研究室采集)反應lh， PBST洗脫三次，每次10min，再與羊抗牛 IgG-服P 1:5000室溫作用lh。 PBST洗漆三次后，置于底物溶液中顯色。
Western blot顯示61KD的蛋白能與自然感染大片吸蟲牛血清結合，證明 61KD蛋白的確是組織蛋白酶L1，結果見圖6。本發明組織蛋白酶Ll在大腸桿菌中的表達產量可達700mg/ral，并且有融合 標簽，這就大大簡化了純化過程，給實踐應用帶來很大便利。
本發明利用大腸桿菌表達大片吸蟲組織蛋白酶L1，包涵體經尿素變性，復 性后經GST親和層析分離純化。這是一種低廉且高產的表達FgCLl的方法，為產 業化生產奠定了基礎。且大腸桿菌表達系統使用最早也研究最多，并且其遺傳背 景相對比較清楚，大腸桿菌表達系統操作簡便、廉價、使用安全、周期短等優 點。由于Acoh'易于培養、成本低，表達蛋白可大量生產，又易于純化，人們 對其基因結構及表達調控原理有了較多的了解。
應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本 發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的 范圍。序列表
〈110〉中國農業科學院上海獸醫研究所
<120〉 一種生產大片吸蟲組織蛋白酶L1的方法 <160> 1
<170〉 Patentln version 3. 1
〈210〉 1
<211> 933
<212> DNA
〈213〉 FgCLl
<400> 1
aatgatgatt tgtggcatca atggaagcga atgtacaata aagaatacaa tggggctgac 60 gatgaacaca gacgaaatat ttgggaagag aatgtgaaac atatccaaga acataaccta 120 cgtcactatc tcggcttcgc cacctacaca ttgggattga accaattcac tgatatgaca 180 ttcgaggaat tcaaggccaa atatctaaca gaaatgccac gcgcgtccga tatactctca 240 cacggtatcc cgtatgaggc gaacaatcgt gccgtacccg acaaaattga ctggcgtgaa 300 tctggttatg tgacggaggt gaaagatcag ggaaattgtg gttcatgttg ggcattctca 360 acaaccggta ctatggaagg acagtatatg aaaaacgaaa gaactagtat ttcattctct 420 gagcaacaac tggtcgattg tagcggtcct tgggg貓ta tgggttgcat gggcggattg 480atggaaaatg cttacgaata tttgaaacaa tttggattgg aaaccgaatc ctcttatccg 540
tacacggctg tggaaggtca gtgtcgatac aataggcagt tgggagttgc caaagtgacg 600
gactactata ctgtgcattc tggtagtgag gtagaattga aaaatctagt cggtgccgaa 660
ggacctgctg cggtcgctgt ggatgtggaa tctgacttca tgatgtacag tggtggtatt 720
tatcagagcc gaacttgttc atcgcttcgt gtgaatcatg cagtcttggc tgtcggttat 780
ggaacacaga gtggtactga ctattggatt gtgaaaaata gttggggatc gtcctggggt 840
gagcgtggtt acattcgaat ggttaggaac cgaggtaaca tgtgtggaat tgcttcgctg 900
gccagtctcc cgatggtggc acgatttccg tga 93權利要求
1.一種生產大片吸蟲組織蛋白酶L1的方法，其特征在于所述的方法包括如下步驟步驟1，根據大片吸蟲組織蛋白酶L1基因全長mRNA序列去除信號肽序列，設計含BamH I和Sal I酶切位點的特異性引物，用PCR從大片吸蟲成蟲cDNA文庫中擴增出如SEQ ID NO1所示的大片吸蟲組織蛋白酶L1基因；步驟2，將組織蛋白酶L1全長基因連接到一個載體上，形成重組載體，用BamH I和Sal I分別酶切重組載體和表達載體，對酶切產物進行純化，然后用連接酶進行連接，形成重組質粒，將重組質粒轉化入大腸桿菌中進行增殖，PCR鑒定正確后，測序確認；步驟3，取鑒定正確的重組質粒轉化大腸桿菌，于含氨芐的培養基培養，30～44℃搖菌至OD600值0.4~0.6時，加入IPTG使其終濃度為0.8-1.2mM，誘導表達，收集菌液，離心棄上清，備用；步驟4，收集沉淀用尿素溶解，透析復性20-30h，濾膜過濾；步驟5，把樣品加入預先用水洗緩沖液處理好的蛋白純化柱中，反復過柱2-5次，然后繼續用水洗緩沖液沖洗，最后用洗脫緩沖液洗脫蛋白，得到大片吸蟲組織蛋白酶L1蛋白。
2. 如權利要求1所述的生產大片吸蟲組織蛋白酶L1的方法，其特征在 于所述的含BamH I I酶切位點的特異性引物為5"-CGG GAT CCA ATG ATG ATT TGT GGC ATC A-3'，所述的含Sal I酶切位點的特異性引物為5' -ACG TCG ACT CAC GGA AAT CGT GCC AC-3'。
3. 如權利要求1所述的生產大片吸蟲組織蛋白酶Ll的方法，其特征在于PCR參數為94°C、 5 min; 94°C、 30 s， 55°C、 30 s， 72°C、 2 min， 30個循環;72°C、 10 min。
4. 如權利要求1所述的生產大片吸蟲組織蛋白酶L1的方法，其特征在 于所述的重組載體為pMD18-T/FgCLl，所述的表達載體為pGEX-4T-2。
5. 如權利要求1所述的生產大片吸蟲組織蛋白酶U的方法，其特征在 于在步驟2中，所述的大腸桿菌為DH5a 。
6. 如權利要求1所述的生產大片吸蟲組織蛋白酶L1的方法，其特征在 于在步驟3中，所述的大腸桿菌為BL21。
7. 如權利要求1所述的生產大片吸蟲組織蛋白酶L1的方法，其特征在 于所述的培養基為2XYT培養基。
8. 如權利要求1所述的生產大片吸蟲組織蛋白酶L1的方法，其特征在 于所述的大腸桿菌細胞的誘導溫度為3(TC。
9. 大腸桿菌作為表達系統用來生產大片吸蟲組織蛋白酶Ll的用途。
全文摘要
本發明公開了一種生產大片吸蟲組織蛋白酶L1的方法，包括一個用PCR從大片吸蟲成蟲cDNA文庫中擴增出大片吸蟲組織蛋白酶L1基因的過程，一個構建含有組織蛋白酶L1全長基因的重組質粒的過程，一個將重組質粒轉化入大腸桿菌中進行增殖的過程，一個誘導表達含有正確的重組質粒轉化的大腸桿菌的過程，然后收集菌液，透析、過濾，最后將樣品加入預先用水洗緩沖液處理好的蛋白純化柱中，用水洗緩沖液沖洗，用洗脫緩沖液洗脫蛋白，得到大片吸蟲組織蛋白酶L1蛋白。本發明的方法是一種低廉且產量高的表達組織蛋白酶L1的方法。本發明中組織蛋白酶L1在大腸桿菌中的表達量可達700mg/L，且易于純化，便于投入實踐應用中。
文檔編號C12N15/57GK101294154SQ20071003998
公開日2008年10月29日 申請日期2007年4月25日 優先權日2007年4月25日
發明者何國聲, 程 龐, 徐梅倩, 杰 曹, 朱順海, 李家誠, 米榮升, 趙其平, 敏 郭, 高興春, 燕 黃 申請人:中國農業科學院上海獸醫研究所