基于日本血吸蟲尾蚴期基因的環介導等溫擴增法的制作方法

本發明屬于日本血吸蟲尾蚴期編碼蛋白基因檢測技術領域，具體涉及基于日本血吸蟲尾蚴期基因的環介導等溫擴增法。

背景技術：

日本血吸蟲是一種重要的人獸共患性疾病，是全球最嚴重的公共衛生問題之一，主要流行于熱帶和亞熱帶的76個國家及地區，全球血吸蟲感染人數超2億人，6億人口受其感染威脅。全國共有453個血吸蟲病流行縣(市、區)，總人口2.52億人；共有29980個流行村，總人口6861.30萬人。全國453個流行縣(市、區)中，343個(占75.72％)達到血吸蟲病傳播阻斷標準；110個(占24.28％)達到傳播控制標準。2015年全國推算血吸蟲病77194例，現存晚期血吸蟲病人30843例。

日本血吸蟲病的診斷包括病原學、免疫學和分子生物學三大方法，而檢測日本血吸蟲的特異的DNA片段與病原學檢測具有同樣的確診價值。病原體基因組學給病原體分子生物學檢測帶來了新的工作方法和思路。日本血吸蟲全基因組測序已經完成，蛋白編碼基因13469個，對尾蚴蛋白質組的比較分析，共鑒定出1181個蛋白，將有力地促進與這一重要傳染病相關的診斷、治療和預防的研究。

傳統的血吸蟲病原學檢測方法包括改良加藤法、尼龍袋集卵法、毛蚴孵化法與直腸鏡活組織檢查法，雖然都是可以確診的方法，但是由于受到諸多因素的限制，比較耗時費力、且存在一定的漏檢率。免疫學方法包括能夠檢測抗體的環卵沉淀試驗、IHA、ELISA、免疫印記技術、IFT、乳膠凝集試驗和快速試紙條等方法，雖然具有操作簡單、出結果快和經濟等優點，但不能區分是現癥患者還是既往感染，針對循環抗原的檢測方法雖然能夠區分現癥感染還是既往感染，但由于其在體液中的含量通常都很低，一般難以檢出，其敏感性還需進一步加強。

目前，作為一種高效的檢測方法，環介導等溫擴增技術(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)不依賴任何專業儀器設備就能實現現場高效快速檢測，能避免傳統分子生物學方法對于溫度循環等條件的特殊要求所帶來的不便，具備實用性、高效性和簡便性的特點，其使用價值和現場應用價值越來越明顯，有望成為較適用于血吸蟲現場調查的簡易技術方法。

LAMP方法在寄生蟲病的研究與應用主要集中在蠕蟲和原蟲等方面，國內外研究人員已對弓形蟲、牛帶絳蟲、細粒棘球絳蟲等寄生蟲單基因的LAMP檢測做了相關研究，建立LAMP方法，結果顯示均有很好的特異性和敏感性。但作為日本血吸蟲，還沒有相關的報道，并且現有的檢測方法相對復雜。

技術實現要素：

本發明的目的是：旨在提供基于日本血吸蟲尾蚴期基因的環介導等溫擴增法，用來解決現有對日本血吸蟲檢測不準確，且檢測特異性和敏感性不高的問題。

為實現上述技術目的，本發明采用的技術方案如下：

基于日本血吸蟲尾蚴期基因的環介導等溫擴增法，包括以下步驟：

步驟一，日本血吸蟲動物模型建立及血吸蟲樣本收集：

A.感染性釘螺經超純水孵育，肉眼觀察水面有尾蚴逸出，接種環接尾蚴置于玻片，解剖鏡下觀察尾蚴活力，確定尾蚴活動良好，取昆明小鼠10只，腹部剪毛至裸皮膚，取蓋玻片置于載玻片上，接種環接30±5只尾蚴于蓋玻片，棉球擦拭小鼠皮膚，將載有尾蚴的載玻片貼于小鼠腹部皮膚約30sec～5min，建立小鼠感染血吸蟲模型；

B.感染40～50天后，斷頸處死小鼠，解剖觀察肝脾病理變化，收集日本血吸蟲成蟲，收集病變肝臟及結腸，置于EP管并在-20℃下保存備用；

步驟二，模板DNA制備：收集釘螺孵育后的超純水，轉至離心管中，在1000～5000r/min條件下離心5～20min，棄上層清液，沉淀用血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒提取尾蚴基因組DNA，感染性釘螺碾碎，收集螺肉及內臟，用軟體動物基因組DNA提取試劑盒提取釘螺基因組DNA，提取后的尾蚴基因組DNA和釘螺基因組DNA均置于-20℃備用；

步驟三，候選基因確定：選擇日本血吸蟲尾蚴期若干個預測蛋白基因作為目的基因；

步驟四，LAMP引物設計與合成：依據Protein ID，在NCBI網站中搜索、下載并保存步驟三中選擇的日本血吸蟲尾蚴期的預測蛋白核酸序列的TXT文本，利用DNAStar軟件，將核酸序列格式另存為Seq，應用軟件http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html在線設計LAMP引物；上傳核酸序列，設置參數為默認值(Automatic Judgment)，設計引物(Primer design)，如若未有引物自動生成，則修改參數值中的長度和Tm值，再次生成LAMP引物；

步驟五，LAMP引物配置(常溫下配置)：

A.引物儲存液配置，將步驟四得到的含有LAMP引物干粉的1.5ml離心管放入離心機，在12000～16000r/min的條件下離心1～10min，根據引物干粉物質的量溶解干粉，配置內引物(FIP/BIP)母液和外引物(F3/B3)母液，配置的母液室溫放置數分鐘后渦旋儀100～300r/min震蕩混勻，隨后放入離心機，進行離心；

B.引物工作液PM配置：取步驟五A得到的FIP和BIP各4μl、F3和B3各1μl，然后加入10μl超純水制備成20μl工作液備用；

步驟六，尾蚴期及感染性釘螺基因組DNA的LAMP檢測：

尾蚴期和感染性釘螺基因組25μl LAMP反應體系：12.5μl 2×RM反應液，1μl步驟四得到的引物工作液PM，1μl步驟二得到的DNA模板，1μl Bst DNA Polymerase，加超純水至25μl，混勻后加20μl密封液再次離心，最后將1μl顯色液滴在PCR管蓋中間，蓋緊管蓋，PCR儀內反應，終止反應后顛倒PCR管數次，使顯色液和反應混合液充分混勻，短暫離心后觀察反應液顏色變化，若呈現綠色則為陽性(有核酸擴增)，呈現棕紅色則為陰性(無核酸擴增)。

作為優選的，所述步驟二中沉淀用血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒為離心柱型，這樣的設計，可以更方便、快速、準確的提取沉淀的DNA。

作為優選的，所述步驟三中選擇日本血吸蟲尾蚴期16個預測蛋白基因作為目的基因，這樣的設計，對日本血吸蟲尾蚴期編碼蛋白基因檢測更加準確。

作為優選的，所述預測蛋白基因包括被膜抗原、鈣離子結合蛋白、尿嘧啶核苷磷酸化酶、多巴胺脫羧酶等的編碼基因和編碼數個假定蛋白的基因，這樣的設計，可以全方位的檢測日本血吸蟲尾蚴期編碼蛋白基因，減少誤判。

作為優選的，所述預測蛋白基因分別為：AY813605.1、AY814178.1、AY815661.1、FN314484.1、CNUS0000038.1、CNUS0000099824.1、CNUS0000102858.1、CNUS0000103096.1、CNUS0000103598.1、CNUS0000103614.1、CNUS0000105310.1、CNUS0000105798.1、CNUS0000106268.1、CNUS0000106483.1、CNUS0000107348.1、CNUS0000107429.1，這樣的設計，選擇的基因具有代表性，對日本血吸蟲尾蚴期編碼蛋白基因的檢測更加準確。

作為優選的，所述步驟五A中內引物(FIP/BIP)母液濃度為200pmol/μl，這樣的設計，可以使對日本血吸蟲尾蚴期編碼蛋白基因檢測更精確。

作為優選的，所述步驟五A中外引物(F3/B3)母液濃度為100pmol/μl，這樣的設計，可以使對日本血吸蟲尾蚴期編碼蛋白基因檢測更精確。

作為優選的，所述步驟五A中配置好的母液室溫放置3至10min，然后震蕩混勻后12000至16000r/min的條件下離心30sec至1min，這樣的設計，可以使得到母液的純度更高，減小母液不純對檢測結果的影響。

作為優選的，所述步驟六中PCR儀內反應溫度為60℃～65℃，這樣的設計，能夠使檢測效果更明顯。

作為優選的，所述步驟六中PCR儀內反應時間為0～90min，這樣的設計，可以減少反應不充分對檢測結果的影響。

本發明的有益效果：

采用本發明能夠有效快速的檢測日本血吸蟲尾蚴期編碼蛋白基因，能夠為早期的血吸蟲預警提供技術支持；且能夠用于日本血吸蟲疫區水樣本及釘螺樣本的流行病學調查。

附圖說明

本發明可以通過附圖給出的非限定性實施例進一步說明；

圖1為本發明基于日本血吸蟲尾蚴期基因的環介導等溫擴增法實施例的檢測結果示意圖；

圖2為本發明基于日本血吸蟲尾蚴期基因的環介導等溫擴增法實施例中感染性釘螺期編碼蛋白基因的LAMP檢測結果示意圖。

具體實施方式

為了使本領域的技術人員可以更好地理解本發明，下面結合附圖和實施例對本發明技術方案進一步說明。

實施例

步驟一，日本血吸蟲動物模型建立及血吸蟲樣本收集：

A.感染性釘螺經超純水孵育，肉眼觀察水面有尾蚴逸出，接種環接尾蚴置于玻片，解剖鏡下觀察尾蚴活力，確定尾蚴活動良好，取昆明小鼠10只，腹部剪毛至裸皮膚，取蓋玻片置于載玻片上，接種環接30±5只尾蚴于蓋玻片，棉球擦拭小鼠皮膚，將載有尾蚴的載玻片貼于小鼠腹部皮膚約1min，建立小鼠感染血吸蟲模型；

B.感染45天后，斷頸處死小鼠，解剖觀察肝脾病理變化，收集日本血吸蟲成蟲，收集病變肝臟及結腸，置于EP管并在-20℃下保存備用；

步驟二，模板DNA制備：收集釘螺孵育后的超純水，轉至離心管中，在3000r/min條件下離心10min，棄上層清液，沉淀用血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒提取尾蚴基因組DNA，感染性釘螺碾碎，收集螺肉及內臟，用軟體動物基因組DNA提取試劑盒提取釘螺基因組DNA，提取后的尾蚴基因組DNA和釘螺基因組DNA均置于-20℃備用；

步驟三，候選基因確定：選擇日本血吸蟲尾蚴期16個預測蛋白基因作為目的基因，包括被膜抗原、鈣離子結合蛋白、尿嘧啶核苷磷酸化酶、多巴胺脫羧酶等的編碼基因和編碼數個假定蛋白的基因，候選基因見表1；

步驟四，LAMP引物設計與合成：依據Protein ID，在NCBI網站中搜索、下載并保存步驟三中選擇的日本血吸蟲尾蚴期的預測蛋白核酸序列的TXT文本，利用DNAStar軟件，將核酸序列格式另存為Seq，應用軟件http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html在線設計LAMP引物；上傳核酸序列，設置參數為默認值(Automatic Judgment)，設計引物(Primer design)，如若未有引物自動生成，則修改參數值中的長度和Tm值，再次生成LAMP引物，候選基因所篩選的LAMP引物見表1；

表1日本血吸蟲尾蚴期編碼蛋白基因LAMP引物

步驟五，LAMP引物配置：

A.引物儲存液配置，將步驟四得到的含有LAMP引物干粉的1.5ml離心管放入離心機，，在12000r/min的條件下離心1min，根據引物干粉物質的量溶解干粉，配置內引物(FIP/BIP)母液且其濃度為200pmol/μl和外引物(F3/B3)母液且其濃度為100pmol/μl，將配置好的母液室溫下放置5min，配置的母液室溫放置數分鐘后渦旋儀100～300r/min震蕩混勻，震蕩混勻后在12000r/min下離心1min。

B.引物工作液PM配置：取步驟五A得到的FIP和BIP各4μl、F3和B3各1μl，然后加入10μl超純水制備成20μl工作液備用；

步驟六，尾蚴期及感染性釘螺基因組DNA的LAMP檢測

尾蚴期和感染性釘螺基因組25μl LAMP反應體系：12.5μl 2×RM反應液，1μl步驟四得到的引物工作液PM，1μl步驟二得到的DNA模板，1μl Bst DNA Polymerase，加超純水至25μl，混勻后加20μl密封液再次離心，最后將1μl顯色液滴在PCR管蓋中間，蓋緊管蓋，PCR儀內在63℃下反應60min，，終止反應后顛倒PCR管數次，使顯色液和反應混合液充分混勻，短暫離心后觀察反應液顏色變化，若呈現綠色則為陽性(有核酸擴增)，呈現棕紅色則為陰性(無核酸擴增)。

根據設計的LAMP引物序列尾蚴期DNA的LAMP檢測見圖1；

圖1中，1～16、N、P分別為AY813605.1、AY814178.1、AY815661.1、FN314484.1、Sjp_0029100、Sjp_0047050、Sjp_0079350、Sjp_008184、Sjp_0087160、Sjp_0087340、Sjp_0105400、Sjp_0110590、Sjp_0115600、Sjp_0118170、Sjp_0130580、Sjp_0131430基因、陰性對照和陽性對照；

根據圖1可以看出，尾蚴期DNA的LAMP檢測結果顯示：Sjp_0079350、Sjp_0087160、Sjp_0087340、Sjp_0110590、Sjp_0115600、Sjp_0118170、Sjp_0130580、Sjp_0131430等8個編碼蛋白基因的檢測管顯色反應為綠色，判斷為陽性；其余8個基因檢測顯色反應為棕紅色，判斷為陰性。

根據設計的LAMP引物序列感染性釘螺期DNA的LAMP檢測見圖2；

圖2中，1～16、N、P分別為AY813605.1、AY814178.1、AY815661.1、FN314484.1、Sjp_0029100、Sjp_0047050、Sjp_0079350、Sjp_008184、Sjp_0087160、Sjp_0087340、Sjp_0105400、Sjp_0110590、Sjp_0115600、Sjp_0118170、Sjp_0130580、Sjp_0131430蛋白、陰性對照和陽性對照；

根據圖2可以看出，感染性釘螺期DNA的LAMP檢測結果顯示：Sjp_0029100、Sjp_0079350、Sjp_0087160、Sjp_0087340、Sjp_0110590、Sjp_0115600、Sjp_0118170、Sjp_0131430等8個基因的檢測管顯色反應為綠色，判斷為陽性；其余8個基因檢測顯色反應為棕紅色，判斷為陰性.

由圖1和圖2可以看出，日本血吸蟲尾蚴作為感染期，分布于水體及感染性釘螺體內，采用LAMP方法檢測16組尾蚴基因組及16組釘螺基因組DNA編碼蛋白基因，顯示有7個蛋白基因Sjp_0079350、Sjp_0087160、Sjp_0087340、Sjp_0110590、Sjp_0115600、Sjp_0118170、Sjp_0131430檢測都為陽性，具有很好的檢測一致性，提示該7個基因具備潛在LAMP檢測靶基因的應用價值，能夠有效的用于日本血吸蟲疫區水樣本及釘螺樣本的流行病學調查。

上述實施例僅示例性說明本發明的原理及其功效，而非用于限制本發明。任何熟悉此技術的人士皆可在不違背本發明的精神及范疇下，對上述實施例進行修飾或改變。因此，凡所屬技術領域中具有通常知識者在未脫離本發明所揭示的精神與技術思想下所完成的一切等效修飾或改變，仍應由本發明的權利要求所涵蓋。