蝦類抗菌肽基因在益生菌中的重組表達和應用的制作方法

專利名稱：蝦類抗菌肽基因在益生菌中的重組表達和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物基因重組工程，具體涉及蝦類抗菌肽基因在益生菌中的重 組表達和應用。
背景技術：
自20世紀40年代抗生素被批準用作詞料添加劑后，為畜牧業發展起了巨 大的推動作用，但隨著飼用抗生素的普及應用，其副作用逐漸突出。 一是病菌 產生耐藥性問題；二是濫用抗生素不但加大了詞料成本，而且引起動物免疫機 能下降，體內菌群失調、發生內源性感染或二重感染，死亡增多；三是畜禽產 品中的藥物殘留問題，而且給生態環境造成毒性。為避免飼用抗生素長期使用 造成全球環境污染并直接危害人類的健康，歐盟1999年1月起通過立法禁止 抗生素作促生長劑使用，今后的發展趨勢是盡量不使用抗生素。因此，尋求飼 用抗生素的替代物已成為世界各國專家研究的熱點。近年來，飼用抗生素替代 品的研究主要有益生素、寡聚糖、抗菌肽等。
抗菌肽是先天性免疫的分子受動器，是生物體內誘導產生的一種具有強抗 菌作用的多肽類物質，它廣泛存在于多種生物體內，是生物體對外界病原物侵 染而產生的一系列免疫反應的產物。抗菌肽分子量小，性能穩定，通常它們含 有15 —45個氨基酸殘基，凈電荷為正。CecroPins類型的不含半胱氨酸線 性肽是最早發現的，來源于昆蟲。現己發現抗菌肽、蛋白有800個以上，來源 于動物、植物領域。抗菌肽具有較強的廣譜抗菌能力，大多數對革蘭氏陽性菌 有較強的殺滅作用，有些則對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均起作用，對某些 真菌、原生動物，尤其對耐藥性細菌有殺滅作用，有些甚至對原蟲、腫瘤也有 作用。
抗菌肽有不同于抗生素的獨特抗菌機理，與酶或受體等蛋白因子無關，抗 菌肽主要作用靶點是細菌的膜，通過物理化學機制使膜的通透性增大，而且殺 傷過程比細菌生長的速度快，通過破壞其屏障而達到殺傷細胞的效果。與抗生素不同，抗菌肽是生物體自身具有的物質，它不產生耐藥性，也不 存在毒副作用，更不存在藥物殘留問題。人們發現許多傳統的抗生素，特別是 青霉素，能夠誘導耐藥菌株的產生。抗菌肽具有良好的抗菌選擇性和獨特的抗 菌模式，而且不會誘導產生耐藥菌株，容易被降解，不易在微生物體內富集， 因此，被認為能夠成為替代抗生素的首選藥物。
自1981年Steiner等首次從蠶蛹中誘導分離得到抗菌肽后，許多抗菌肽 相繼被分離、純化，其氨基酸一級結構和基因序列得到確定。 一般把抗菌肽分 為4禾中類型殺菌月太類(cecropins)、防御素(defensins)、娃皮素(magainin)、 蜂毒素(melittin)。蝦類抗菌肽研究是近幾年才開始的，目前已對凡納對蝦的 陽離子抗菌肽(penaeidins家族)進行了系統地研究，至少發現5個亞類；戴 斯特謬克司一卡森等又在凡納對蝦(Litopenaeus vannamei)和南美白對蝦 (Litopenaeus stylirostris)中發現了抗真菌活性的3種陰離子抗菌肽。王金 星等公開了中國對蝦抗菌肽基因(Ch-penaeidin)與克隆技術 (CNZL， 02109931. 6)，中國對奸的重組表達與應用(CN， 03112294. 9)。與其它 種類相比，來源于魚、蝦、蟹等水生動物體內的抗菌肽殺菌作用更強，溶血效 應小，種類多樣化，顯示出比其它種類更具優勢的應用前景。 但是目前，尚未有將抗菌肽基因轉入益生菌中。
益生菌是指一類活的、有益菌補充物，又稱活菌制劑或微生態制劑。對益 生菌的研究不斷有新的發現，益生菌的定義也有不同的概念。Fuller認為"益生 菌是一種活的微生物飼料添加劑，通過改善腸道的微生物平衡而有益于動物"。 該定義起初用于陸生動物和人類。對水生動物而言，動物與其周圍的水環境不 斷地進行相互作用，有證據表明，水環境中的細菌對魚體腸道的微生物組成有 影響。腸道中出現的微生物似乎是來自環境和餌料并能在腸道生存和繁殖的那 些屬。Gatesoupe給益生菌下的定義為"有助于增進動物健康進入其胃腸道并保 存活力的微生物細胞"。而在某種程度上水環境中的微生物還可生活于養殖動 物的鰓或皮膚上。Gram去掉對腸道的限制，將益生菌的定義擴展為"一種活的 微生物添加劑，通過改善動物的微生物平衡而對其產生有利的影響"。水生動物 往往產卵于水中，使其周圍水中的細菌能在卵表面定居，而且剛孵化的幼體或 新出生的動物腸道系統發育并不完全，其腸道、皮膚和鰓上沒有微生物群落。由于水生幼體早期階段的主要微生物群落部分地取決于飼育它們的水，故水
中細菌的性質尤為重要。因此，erschuere等將益生菌的定義進一步擴展為"一 種活的微生物添加劑，通過改善與動物相關的或其周圍的微生物群落，確保增 加飼料的利用或增強其營養價值，增強動物對疾病的應答或改善其周圍環境的 水質而有益于動物"。可以看出，益生菌的概念只是微生態環境中的生理性菌群 到生態環境中微生物優勢菌群的變遷。

發明內容
本發明所要解決的技術問題第一方面針對現有技術的空缺，利用克隆到的 蝦類抗菌肽基因，構建原核及真核益生菌的表達載體，提供蝦類抗菌肽基因在 益生菌中的重組和表達。
本發明所要解決的技術問題第二方面在于提供了重組有上述蝦類抗菌肽
基因的益生菌的應用，主要是用做水產養殖的詞料，特別是蝦用飼料。即將一
種或多種重組益生菌菌株分別用適宜培養基培養，得到的發酵液可制備成各種
劑型，如口服劑、凍干粉等，混合入蝦類飼料，獲得既能取代飼用抗生素、又
能調節養殖水體的微生態環境的新型綠色水產養殖詞料，達到提高水質，健康
養殖、穩產高產的目的。
作為本發明第一方面的蟲下類抗菌肽在益生菌中的重組表達，包括蝦類抗菌
肽基因的克隆，蝦類抗菌肽基因的重組載體的構建，抗菌肽基因重組載體的轉
化與篩選，發酵培養表達抗菌肽的工程菌，表達產物的鑒定、純化。
其中，所述的重組載體的構建是根據已克隆到的蝦類抗菌肽cDNA序列，
利用特異引物在其兩端加入兩個不同的限制性內切酶酶切位點，PCR擴增抗菌
肽基因；將其克隆到益生菌表達載體上，所述的表達載體包括pPIC系列或pLA
系列；
所述轉化與篩選是將上述構建得到的載體分別轉化獲得工程菌株，篩選出 所需的重組工程菌，所述的轉化方式為電轉法；
所述表達產物的鑒定、純化是采用誘導劑誘導工程菌株的表達，破細胞收 集上清液，分泌型表達的細胞直接收集上清液，釆用超率和層析等方法純化抗 菌肽，并測定其抗菌譜。上述的誘導劑是原核表達的誘導劑為異丙基-P-D-硫代半乳糖苷，真核表達的誘導劑是甲醇。所述特異性引物包含，但不限于下列-Pen4F 5'ATCATATGAGCAGCGGTTACACGCG 3'Pen4R 5， CCAAGCTTCTATCCTCTGTGACAACA 3'Pen5F 5'ATCATATGCGTCTCGTGGTCTGCCTG 3'Pen5R 5, CCAAGCTTTCAACCATATGTTTGCTTTGC 3'Pen2F 5'ATCATATGCCTGTGTCCGCCATGCGTC 3'Pen2R 5'CCAAGCTTCTTGGCAGACCAGGGCGAA 3'上述的蝦類抗菌肽是草蝦抗菌肽。用于轉化益生菌的載體質粒，含有如pG+Host、 pJIM2481、 Tn916、 Tn917、 Tn919中一種轉座子。上述的構建重組載體步驟，還包括構建抗菌肽基因串聯多聚體，以,提高抗 菌肽的表達量。上述的益生菌為細菌、真菌和微藻等生物。其中，所述的細菌，包括如光 合細菌、硝化細菌、硫化細菌、雙歧桿菌、乳球菌、乳桿菌、芽孢桿菌、腸球 菌、鏈球菌。其中，乳球菌優選為乳酸乳球菌(Lactococcus lactis);乳桿 菌優選為干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)，或米酒乳桿菌(Lactobacillus sake)。所述的真菌為酵母菌，優選為釀酒酵母。 本發明的優點與獨特性在于1) 采用益生菌自身表達載體，可以穩定高效表達外源基因。2) 所用的益生菌自身安全，不產生內外毒素，同時對機體健康有促進作 用；益生菌分泌溶菌酶、過氧化氫等代謝產物，抑制有害細菌在腸黏膜的附著 與繁殖，平衡動物消化道內的微生物群；益生菌協助機體消除毒素及代謝產物; 剌激機體免疫系統，提高干擾素和巨噬細胞的活性，促進抗體的產生，提高免 疫力和抗病能力；益生菌還能調節水產培養中的水質環境等。3) 轉抗菌肽基因的益生菌可以采用活菌制劑形式，作為綠色飼料添加劑 直接使用，不需經過蛋白純化等，生產工藝簡單，成本低，并起到益生菌和抗7菌肽兩種飼用抗生素替代品的綜合效果。
4) 重組益生菌可以在機體內不斷繁殖，在一定時期內持續表達并提供給 機體抗菌肽，具有很好的特異性和有效性。
5) 轉抗菌肽基因的益生菌還能以烘干粉形式加入詞料，飼料中同時含有 大量抗菌肽、酵母多糖、核苷酸等多種活性成分，起到協同促進生長和增強免 疫力的效果。


圖1是本發明的蝦類抗菌肽基因在益生菌中的重組和表達流程圖。 圖2是草蟲下RNA抽提電泳圖，其中的黑色條帶為提取的草蝦RNA。 圖3是PCR擴增目標基因PEN-4電泳圖(目標基因約200bp)。 圖4是pPIC-PEN4-l菌落PCR鑒定目標克隆(l陰性對照，2陽性對照3.
4. 5. 7. 8 pMD-18T-PEN4-1菌落#1， #2， #3， #4, tt5 6. DNA Marker)。
圖5酵母菌37。C表達的PEN4-1 (主要以包涵體形式存在1包涵體，2表達上清液,3
誘導后，4誘導前，5蛋白Marker)。
具體實施例方式
為使本發明實現的技術手段、創作特征、達成目的與功效易于明白了解， 下面結合具體實施方式
，進一步闡述本發明。
本發明的蝦類抗菌肽基因在益生菌中的重組表達和應用，具體是對草蝦的 抗菌肽基因進行克隆，并在益生菌中進行表達，獲得新型的表達蝦類抗菌肽的 重組益生菌，并在此基礎上開發新型養殖蝦用綠色飼料。
具體包括如下步驟
①利用已有的抗菌肽基因cDNA序列，利用特異性引物在其兩端引入適當
的酶切位點，PCR擴增抗菌肽基因；②構建帶有抗菌肽基因的益生菌重組表達
載體，將其克隆到益生菌表達載體上，然后轉入益生菌中，獲得穩定表達蝦類
抗菌肽基因的重組益生菌菌株；③構建抗菌肽基因串聯多聚體；④將重組表 達載體轉入益生菌中，獲得表達抗菌肽的工程菌；⑤發酵培養表達抗菌肽的 工程菌；⑥純化分離得到抗菌肽；⑦抗菌肽抗菌活性測定；⑧新型養殖蝦用綠色飼料的制備。益生菌主要包括細菌、真菌和微藻等生物。其中，所述的細菌，包括如光 合細菌、硝化細菌、硫化細菌、雙歧桿菌、乳球菌、乳桿菌、芽孢桿菌、腸球菌、鏈球菌。其中，乳球菌優選為乳酸乳球菌(Lactococcus lactis);乳桿 菌優選為干酪乳桿菌(Lactobacillus casei),或米酒乳桿菌(Lactobacillus sake)。參考南美白對蟲下(Litopenaeus vannamei)禾口 Litopenaeus setiferus的 penaeidin-4基因序列設計引物，在兩端引入不同的限制性內切酶位點，亞克 隆到克隆載體和表達載體。用于轉化益生菌的載體質粒，含有下列調控因子 復制起始子、啟動子、信號肽、編碼蝦類抗菌肽的基因序列、轉錄終止子。這里通過構建含有強啟動子及信號肽等元件的表達質粒，并將表達質粒中 含目的基因的表達元件部分酶切、連接等方法克隆到乳酸菌等益生菌的整合質 粒中，如pG+Host、 pJIM2481、 Tn916、 Tn917、 Tn919等轉座子上，從而整合 到益生菌染色體中，構建可持續、穩定表達抗菌肽基因的重組乳酸菌菌株。酵母表達體系最大的優點是屬于真核生物表達系統，能進行蛋白質修飾作 用，而且酵母為單細胞生物，生長速度快，便于進行分子生物學操作。本發明 中優選采用釀酒酵母。在酵母中表達并分泌外源基因需下列組件酵母識別的強啟動子、信號肽 序列、轉錄終止信號，翻譯終止密碼子，合適的表達框架等。本發明采用AOX1 基因啟動序列和轉錄終止序列。并插入a因子分泌信號肽和抗菌肽基因，構建 可在酵母中分泌表達抗菌肽的表達載體。含有抗菌肽基因或串聯抗菌肽基因片段的相應表達載體，通過電轉化的方 法，分別轉入酵母、雙歧桿菌、乳桿菌、乳球菌和芽孢桿菌等益生菌中，游離 存在或整合到染色體上，得到能穩定表達具有生物學活性的抗菌肽的重組益生 菌株。實施例1含草蝦抗菌肽基因的大腸桿菌pET28a表達載體的構建 1)草蝦cDNA文庫的建立取20只草奸，勻槳，用抽提液(4M硫氰酸胍，25mM擰檬酸鈉，0. 5% lauryl sarcosinate, 0.1M巰基乙醇)提取，用胍鹽-酚-氯仿法提取總RNA，構建總cDNA文庫。2)用PCR方法克隆草蟲下penaeidin-4基因根據Litopenaeus vannamei禾卩Litopenaeus setiferus的Penaeidin-4的基因序 列，設計特異性引物Pen4MFl/Pen4MRl，引物兩端加Nde I和Hind III酶切 位點，擴增penaeidin-4基因，引物序列為Pen4MFl5， ATCATATGAGCAGCGGTTACACGCG 3， Pen4MRl5' CCAAGCTTCTATCCTCTGTGACAACA 3' PCR反應體積50ul，擴增條件94°C 2min;94。C 30s，51。C 45s, 72°C 45s 共30循環；72°C 10min。經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測到大約的擴增產物。用膠 純化試劑盒純化所得的產物，與T-載體pMD18T連接，獲得含目的基因的克 隆載體pMD-Pen4。3 )重組表達載體pET-pen4的構建與篩選載體pET28a和pMD-Pen4分別用Nde I/Hind III 37*€酶切3h，分別回收載 體和目的片段，兩者于16""C連接過夜。轉化E. coli DH5 a ，以Pen4MF/Pen4MR 為引物PCR篩選陽性克隆，提取陽性菌株質粒，測序，測序正確的質粒轉化 E.coliBL21，篩選陽性克隆。4)表達菌的誘導表達挑取pET-Pen4-BL21單菌落于5mlLB/Kan培養液中，37 "過夜培養，次日取lml過夜培養物接種于100ml LB/Kan培養液中37°〇培養 至OD600為0.6-0.8，加入IPTG至終濃度lmM進行誘導，37"C繼續培養5h 或25。C培養過夜。5000rpm離心10min收集菌體，加入5mlTE、洗滌、重懸， 并超聲破碎細胞，12000rpm離心10min，分別收集上清和沉淀。用16. 5%的 Tricine膠分離鑒定抗菌肽Pen4的表達狀況(如表達與否，在細胞中表達的位 置等)。平板生長抑制法檢測Pen-4活性實施例2含草蝦抗菌肽基因的在酵母菌中的重組與表達 1)草蟲下cDNA文庫的建立取20只草蝦，勻漿，用抽提液(4M硫氰酸胍，25mM檸檬酸鈉，0.5% lauryl sarcosinate， 0.1M巰基乙醇)提取，用胍鹽-酚-氯仿法提取總RNA，構建總cDNA 文庫；2)用PCR方法克隆草蝦penaeidin-4基因根據Litopenaeus vannamei禾口 Litopenaeus setiferus的Penaeidin-4的基因序 列，設計特異性弓I物Pen4MF2/Pen4MR2 ，弓I物兩端加EcoR I和Not I酶切位 點，擴增penaeidin-4基因，引物序列為Pen4MF25， ATGGATCCATGAGCAGCGGTTACACGCG 3， Pen4MR25' CCAAGCTTCTATCCTCTGTGACAACA 3' PCR反應體積50ul，擴增條件94。C 2min;94。C 30s, 51°C 45s, 72°C 45s 共30循環；72°C 10min。經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測到大約的擴增產物。用膠 純化試劑盒純化所得的產物，與T-載體pMD18T連接，獲得含目的基因的克 隆載體pMD-Pen4-2。3) 重組表達載體pPIC-pen4的構建與篩選載體pPIC9K和pMD-Pen4分別用EcoR INot I 37。C酶切3h以上，分別回 收載體和目的片段，兩者于16'C連接過夜，轉化E.coliDH5a感受態細胞,在 含氨芐青霉素(100ug/ml)的固體LB培養的平皿中37 "C倒置培養過夜。以 Pen4MF2/Pen4MR2為引物，經菌落PCR篩選陽性克隆。擴大培養，提取陽性 重組質粒pPIC-pen4，測序驗證重組質粒中Penaeidin-4的基因序列的正確性。4) Penaeidin-4基因的酵母工程菌的篩選將測序正確的質粒pPIC-pen4和pPIC9K空質粒分別用Sal I酶切、酚-酚/ 氯仿-氯仿三步抽提去除蛋白，乙醇沉淀，電轉化酵母GS115感受態細胞。涂 布在不含His的MD平皿上，收集長出的His+菌落，再在含有不同濃度G418 的YPD梯度平皿中進行梯度篩選。挑去單菌落溶于10ul水中，沸水浴煮5min， 冰浴5min，在煮5分鐘。室溫下離心，取2ul為模板，PCR鑒定。上游引物 為載體上5，-AOXl primer,下游引物為Penaeidin-4的基因引物Pen4MR2，得到的陽性克隆進行下一步的表達研究。5) Penaeidin-4基因的酵母工程菌的誘導表達分取pPIC-pen4/GS 115、 pPIC9K/GS 115單克隆菌接種于5ml YPD液體培養基中，28°C 200-250rPm培養24h后，將菌液轉接到BMGY中放大培養，28 °C 200-250rpm培養至0D-2-6， 5000rpm離心取沉淀(菌體)，換用1/5體積 含0. 5%甲醇的BMMY誘導表達。每個24h取5ml菌液，12000rpm離心收集上清， -20'C保存，并補加甲醇至終濃度0.5%繼續誘導， 一直誘導4-6天。每天所得 的上清液濃縮、透析后用16.5y。的Tricine膠分離鑒定。 6)表達產物的抗菌活性測定
將處于對數生長期的大腸桿菌DH5 a懸浮液(OD二O. 2-0. 4)20ul與固體培 養基PBM(poor broth medium: 1% agar, 1% trypton， 0. 5% NaCl) 15ml在50 "C左右混合均勻，倒入預先擺好小鐵環的無菌培養皿中，待其凝固后，取出小鐵 環，于孔中加入待測樣品液,37"C倒置培養過夜，觀察形成的抑菌圈情況。
實施例3
含草蝦抗菌肽基因在乳酸菌中的重組與表達 ' 用以pMD-Pen4位模板，兩端分別為Sac I和Kpn I酶切位點的penaeidin國4 基因特異引物Pen4MF3/Pen4MR3， PCR擴增penaeidin-4基因。 引物序列為
Pen4MF35' ATGAGCTCATGAGCAGCGGTTACACGCG 3'
Pen4MR35' CCGGTACCCTATCCTCTGTGACAACA 3'
PCR反應體積50ul，擴增條件94°C 2min;94。C 30s, 51°C 45s, 72°C 45s 共30循環；72°C 10min。
經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測到大約的擴增產物。用膠純化試劑盒純化所得 的產物，與T-載體pMD18T連接，獲得含目的基因的克隆載體pMD-Pen4-3。
采用Kpn I / Sac I雙酶切pMD-Pen4-3及乳酸菌表達質粒pMG36e，利用 膠回收試劑盒分別回收目標基因片段和載體片段，按片段載體=3: l的比例 用T4 DNA連接酶在16"C連接過夜。
取2ul連接產物用電穿孔法轉化乳酸乳球菌LM0230，脈沖參數為1. 25 KV/cm， 25uF和200 Q。恢復培養基用SGM17MC。對初步篩選的陽性菌進行質 粒抽提，PCR和測序鑒定。
將鑒定為陽性的重組質粒載體在乳酸菌中表達，接種于MG17中，30'C培養過夜，收集菌體，加等量上樣緩沖液IO(TC作用10 min，離心后取上清用16. 5% 的Tricine膠分離鑒定。
實施例4
將實施例1-3的表達產物制備成凍干粉，用做水產養殖的飼料，特別是蝦 用飼料。
以上顯示和描述了本發明的基本原理、主要特征和本發明的優點。本行 業的技術人員應該了解，本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書 中描述的只是說明本發明的原理，在不脫離本發明精神和范圍的前提下本發明 還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發明范圍內。本 發明要求保護范圍由所附的權利要求書及其等同物界定。
權利要求
1、蝦類抗菌肽在益生菌中的重組表達，包括蝦類抗菌肽基因的克隆，蝦類抗菌肽基因的重組載體的構建，抗菌肽基因重組載體的轉化與篩選，發酵培養表達抗菌肽的工程菌，表達產物的鑒定、純化；其中所述的重組載體的構建是根據已克隆到的蝦類抗菌肽cDNA序列，利用特異引物在其兩端加入兩個不同的限制性內切酶的酶切位點，PCR擴增抗菌肽基因；將其克隆到益生菌表達載體上，所述的表達載體包括pPIC系列或pLA系列；所述的轉化與篩選是將上述構建得到的載體分別轉化獲得工程菌株，篩選出所需的重組工程菌；所述的表達產物的鑒定、純化是采用誘導劑誘導工程菌株，破細胞收集上清液，分泌型表達的細胞直接收集上清液，采用超濾、層析等方法純化抗菌肽，并測定其抗菌譜。
2、 如權利要求l所述的蝦類抗菌肽在益生菌中的重組表達，其特征在于， 上述的蝦類抗菌肽是草蝦抗菌肽。
3、 如權利要求1或2所述的蝦類抗菌肽在益生菌中的重組表達，其特征在 于，用于轉化益生菌的載體質粒，含有如pG+Host、 pJIM2481、 Tn916、 Tn917、 Tn919中一種轉座子。
4、 如權利要求3所述的蝦類rt菌肽在益生菌中的重組表達，其特征在于， 上述的構建重組載體步驟，還包括構建抗菌肽基因串聯多聚體。
5、 如權利要求l所述的蝦類抗菌肽在益生菌中的重組表達，其特征在于， 所述的益生菌為細菌、真菌和微藻。
6、 如權利要求5所述的蝦類抗菌肽在益生菌中的重組表達，其特征在于， 所述的細菌，包括如光合細菌、硝化細菌、硫化細菌、雙歧桿菌、乳球菌、乳 桿菌、芽孢桿菌、腸球菌、鏈球菌。
7、 如權利要求6所述的蝦類抗菌肽在益生菌中的重組表達，其特征在于， 乳球菌優選為乳酸乳球菌，乳桿菌優選為干酪乳桿菌，或米酒乳桿菌；所述的 真菌為酵母菌。
8、 如權利要求7所述的蝦類抗菌肽在益生菌中的重組表達，其特征在于， 所述的酵母菌優選為釀酒酵母。
9、 如權利要求l一8任一項所述的蝦類抗菌肽基因在益生菌中的重組表達 產物用于水產養殖業飼料。
10、 如權利要求l一8任一項所述的蝦類抗菌肽基因在益生菌中的重組表達 產物用于蝦類的養殖飼料。
全文摘要
本發明的提供了蝦類抗菌肽在益生菌中的重組表達及應用，包括蝦類抗菌肽基因的克隆，蝦類抗菌肽基因的重組載體的構建，抗菌肽基因重組載體的轉化與篩選，發酵培養表達抗菌肽的工程菌，表達產物的鑒定、純化。本發明還提供了重組有上述蝦類抗菌肽基因的益生菌的應用，用于水產養殖的飼料，優選為蝦用飼料。重組益生菌可以在機體內不斷繁殖，在一定時期內持續表達并提供給機體抗菌肽，具有很好的特異性和有效性。
文檔編號C12N15/09GK101314772SQ20071004133
公開日2008年12月3日 申請日期2007年5月28日 優先權日2007年5月28日
發明者帆 江, 范立強, 袁勤生 申請人:上海漢德食品有限公司