專利名稱：遺傳改良大豆品系gts40－3－2檢測用標準質粒分子及其構建方法
技術領域：
本發明涉及的是一種生物工程技術領域的質粒分子，具體來說，涉及一種遺傳改良大豆品系GTS40-3-2檢測用標準質粒分子及其構建方法。
背景技術：
基因工程技術的出現和應用為農業、醫學等領域開辟了一個全新的發展時代。1994年，Calgene公司利用基因工程技術研制的遺傳改良番茄品系“FLAVR SAVR”在美國首次被批準進入商業化生產。到2006年，全球遺傳改良作物種植面積已達1億多公頃。與此同時，大量的遺傳改良農產品涌入我國市場。我國農業轉基因生物安全管理辦公室于2004和2005年分別為境外18種遺傳改良作物頒發了安全生產許可證，以用于進口加工原料，其中包括遺傳改良大豆品系GTS-40-3-2。隨著遺傳改良作物的廣泛種植，其安全性問題引起了全球公眾的普遍重視，國際組織和國家紛紛制定相應的安全管理法規，加強遺傳改良作物的規范管理，并對遺傳改良植物及其產品實施標識制度。
為了應對遺傳改良作物管理相關的法律法規和制度，建立高效、快速、特異的檢測技術十分必要，它是各國際組織和國家管理遺傳改良作物的有力技術支撐。基于核酸的聚合酶鏈反應(PCR)檢測技術因具有高靈敏度和特異性強的優點，已成為目前最重要、應用最廣泛的遺傳改良作物及其產品檢測技術。PCR檢測方法建立的主要依據是特異性的擴增遺傳改良植物的外源基因片段。針對擴增的外源DNA片段差異，PCR檢測策略可以分為四種，即通用元件篩選PCR檢測、基因特異性PCR檢測、構建特異性PCR檢測和品系特異性PCR檢測。品系特異性PCR檢測是通過檢測外源插入載體與植物基因組的連接區序列實現的。由于每個遺傳改良作物品系，都具有特異的外源插入載體與植物基因組的連接區序列，并且連接區序列是單拷貝的，因此品系特異性檢測方法具有較篩選、基因特異性和構建特異性PCR檢測方法更高的特異性和準確性，能夠特異的檢測專一的遺傳改良作物品系。目前品系特異性PCR檢測方法已成為各國研究的重點。
在實際檢測中，標準物質十分重要。然而，由于專利權和現有技術的限制，遺傳改良作物標準物質的獲得相對較難，其缺乏已成為檢測方法建立和應用的瓶頸，阻礙了轉基因產品標識制度的順利實施。并且，現有的標準物質都是利用遺傳改良作物材料研制生產的，其難于保存，材料來源也比較有限，到目前為止僅得到十幾種遺傳改良作物的標準物質。
經對現有技術的文獻檢索發現，日本科學家Hino等在《Journal of AOACInternational》(國際官方農業化學家協會雜志)2002年第85卷第1077-1089頁上發表的“Novel Reference Molecules for Quantitation of GeneticallyModified Maize and Soybean(用于遺傳改良玉米和大豆定量檢測的新型標準分子)”，該文中提出利用質粒標準分子代替標準物質用于遺傳改良作物檢測的理念和方法，并構建了含有外源檢測目的片段和內源標準基因的質粒分子，成功的用于遺傳改良大豆和玉米的檢測。經驗證標準質粒分子是很好的標準物質替代物，具有基因組制備容易、擴增效率高和穩定性好的優點。然而，其不足之處在于該質粒分子是針對外源目的基因片段構建的，只能用于遺傳改良作物的基因特異性檢測，與檢測方法發展的趨勢相脫節，因此不能滿足轉基因產品標識制度的要求。
發明內容
本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種遺傳改良大豆品系GTS40-3-2品系特異性檢測用標準質粒分子及構建方法，使其可以代替遺傳改良大豆品系GTS40-3-2的陽性標準物質用于遺傳改良大豆品系特異性的定性、定量PCR檢測。根據遺傳改良大豆品系GTS40-3-2的品系特異性序列和內標準基因序列，利用重疊PCR反應的原理設計特異PCR引物，經過PCR擴增獲得遺傳改良大豆品系GTS40-3-2的品系特異性序列和內標準基因Lectin一段序列的重組DNA片段。利用分子克隆技術將重組DNA片段克隆到pMD18-T載體中，獲得新的質粒分子pMD-RRS。本發明構建的標準質粒分子可代替遺傳改良大豆品系GTS40-3-2原有的陽性標準物質，用于定性和定量PCR檢測，徹底解決遺傳改良大豆品系GTS40-3-2檢測中標準物質缺乏的難題。
本發明是通過以下技術方案實現的，本發明所述標準質粒分子，以替代遺傳改良大豆品系GTS40-3-2的陽性標準物質，用于定性和定量PCR檢測。該標準質粒分子同時含有遺傳改良大豆品系GTS40-3-2的品系特異性序列和內標準基因Lectin的一段序列。
本發明所述標準質粒分子pMD-RRS構建方法，包括如下步驟①利用GenBank等數據庫進行生物信息學分析，獲得大豆內標準基因Lectin、遺傳改良大豆品系GTS40-3-2的品系特異性序列。
所述的大豆內標準基因Lectin，指的是大豆凝集素基因，其在大豆基因組中高度保守，具有種間特異性、種內非特異性和單拷貝數的特點。
所述的遺傳改良大豆品系GTS40-3-2的品系特異性序列，指的是遺傳改良大豆品系GTS40-3-2外源插入載體與大豆基因組鄰接區的DNA序列。
②設計PCR特異性引物。
所述的PCR特異性引物，指的是長度為28±10nt的寡核苷酸鏈，其與大豆Lectin基因或者遺傳改良大豆品系GTS40-3-2的品系特異性序列完全相同或者互補。
③特異性擴增大豆內標準基因Lectin和遺傳改良大豆品系GTS40-3-2的品系特異性序列。
所述的特異性擴增，指的是利用設計的PCR引物特異性擴增內標準基因Lectin的一段序列和遺傳改良大豆品系GTS40-3-2的品系特異性序列。
④大豆內標準基因Lectin和遺傳改良大豆品系GTS40-3-2品系特異性序列的拼接。
所述的拼接，指的是利用重疊PCR技術將大豆內標準基因Lectin和遺傳改良大豆品系GTS40-3-2品系特異性序列兩個獨立的DNA片段連接融合成一個重組的新DNA片段。
⑤含有新的重組DNA片段的質粒分子克隆。
所述的分子克隆，指的是將上述得到的重組特異性DNA片段按照設計的限制性內切酶酶切位點連接到質粒載體pMD18-T上，獲得標準質粒分子pMD-RRS。
⑥標準質粒分子pMD-RRS的定性和定量PCR檢測方法驗證。
所述的定性PCR檢測方法驗證，是指用于標準質粒分子pMD-RRS構建的品系特異性片段只能在遺傳改良大豆品系GTS40-3-2基因組DNA中擴增獲得，而不能在其他大豆品系，和其他遺傳改良作物基因組中擴增得到。
所述的定量PCR檢測方法驗證，是指檢測標準質粒分子pMD-RRS在進行定量PCR分析時的特異性、靈敏度、重復性和重演性等特性，以鑒定該標準分子替代遺傳改良大豆品系GTS40-3-2陽性標準物質的能力，以及實際應用于定量PCR檢測遺傳改良大豆品系GTS40-3-2的測定有效性。
本發明的有益效果在于，利用重疊PCR和分子亞克隆的方法首次構建了含有大豆內標準基因Lectin特異性序列和遺傳改良大豆品系GTS40-3-2品系特異性序列的標準質粒分子pMD-RRS。本發明中明確提出此標準分子可以代替遺傳改良大豆品系GTS40-3-2的陽性標準物質用于該品系特異性定量PCR檢測，很好的解決了該品系檢測過程中陽性標準物質缺乏的問題。此標準質粒分子pMD-RRS對實際樣品分析的結果比較準確，檢測結果的偏差在ISO遺傳改良食品檢測標準允許的0-0.25范圍內。因此，本發明中構建的標準質粒分子完全適用于對遺傳改良大豆品系GTS40-3-2樣品及其加工產品中的遺傳改良成分進行定量分析。
圖1為本發明構建的標準質粒分子pMD-RRS的示意圖譜。
具體實施例方式
下面對本發明的實施例作詳細說明本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施例。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件操作，如可參照Sambrook等編著分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1標準分子的構建一、實驗試劑限制性內切酶Nco I、Xba I，以及限制性內切酶對應緩沖液購自上海皓嘉科技發展有限公司；pMD18-T載體，T4DNA連接酶及其緩沖液購自上海皓嘉科技發展有限公司；dNTPs、Taq DNA聚合酶及其緩沖液、DL2000 Marker購自大連寶生物工程有限公司；TaqMan探針及引物由上海博亞生物工程有限公司合成。
其它生化試劑均為進口分裝或國產分析純。
二、實驗儀器DY-501型核酸電泳儀(上海精密科學儀器有限公司)PTC-100型PCR擴增儀(MJ Research Inc.)DNA電泳分析系統，包括暗箱、數碼照相機、計算機、掃描儀、噴墨打印機、光敏打印機、Tanon UV-2000紫外分析儀、Gis凝膠圖像分析軟件(上海天能公司)其他儀器包括離心機，恒溫水浴鍋，培養箱，天平等。
三、試驗方法和過程1、在GenBank中搜索大豆內標準基因Lectin；通過查閱遺傳改良作物的相關資料，獲得遺傳改良大豆品系GTS40-3-2外源插入載體在遺傳改良作物中的具體插入方式和拷貝數，并查閱外源插入載體中主要元件的序列信息。
2、構建標準質粒分子pMD-RRS的PCR引物序列設計根據獲得的遺傳改良大豆品系GTS40-3-2的外源插入載體旁鄰基因序列，利用軟件Primer 5.0設計兩對定性PCR引物，一對用于擴增遺傳改良大豆品系GTS40-3-2的外源插入載體與大豆基因組鄰接區特異性序列，兩條引物一條位于大豆基因組上，另一條位于遺傳改良大豆品系GTS40-3-2的外源插入載體上；另一對引物用于擴增大豆內標準基因特異性序列。具體的引物序列見表1。
表1.構建標準質粒分子pMD-RRS的PCR引物序列
3、遺傳改良大豆品系GTS40-3-2內源標準基因序列和品系特異性序列的擴增根據表1的引物，以遺傳改良大豆品系GTS40-3-2基因組DNA為模板，對大豆內標準基因Lectin和品系特異性序列進行PCR擴增(反應體系和條件見表2、3)，得到大豆內標準基因的一段378bp片段和一個349bp的外源插入載體旁鄰基因序列片段。對擴增得到的條帶進行回收純化，通過測序分析表明獲得的序列與目的擴增片段序列一致。
表2.構建標準質粒分子pMD-RRS的PCR擴增體系
表3.構建標準質粒分子pMD-RRS的PCR擴增條件
4、利用重疊PCR方法對上述兩個片段進行連接用上述PCR得到的內源標準基因和品系特異性序列為模板，以Lectin基因的上游引物和品系特異性序列的下游引物作為重疊PCR的引物對，進行PCR擴增，實現兩個片段的重組拼接。
5、重組DNA片段克隆進入pMD18-T載體利用分子克隆的方法將上述連接獲得的重組片段連接到質粒載體pMD18-T上，連接反應體系見表4。42℃ 90秒熱激轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，得到質粒分子。
表4.目的DNA片段連接反應體系
構建的標準質粒分子pMD-RRS的簡要圖譜如附圖1所示。圖中pMD-18T表示構建標準質粒分子的載體；Xba I表示該位點含有限制性內切酶Xba I的酶切位點；Nco I表示該位點含有限制性內切酶Nco I的酶切位點；“Lectin”表示大豆內源標準基因Lectin的一段特異性序列；“品系特異性序列”表示遺傳改良大豆品系GTS40-3-2外源插入載體與大豆基因組鄰接區的一段DNA序列；兩段序列實現拼接后，通過重組序列兩端的Xba I和Nco I限制性內切酶酶切位點連接到pMD-18T載體上，構成標準質粒分子pMD-RRS。
實施例2構建的質粒標準分子在實際檢測中的應用一、實驗材料遺傳改良大豆品系GTS40-3-2。
常規大豆品種。
其他遺傳改良作物品系油菜GT73、棉花MON531、棉花MON1445、玉米GA21、華番一號番茄、玉米NK603品系。
二、酶與試劑植物基因組DNA提取及純化采用上海市農業科學院和上海出入境檢驗檢疫局聯合研制的食品DNA抽提試劑盒。
質粒基因組DNA提取及純化采用捷瑞生物工程(上海)有限公司研制的質粒小量制備試劑盒。
pMD18-T載體，T4DNA連接酶及其緩沖液購自上海皓嘉科技發展有限公司；dNTPs、Taq DNA聚合酶及其緩沖液、DL2000 Marker購自大連寶生物工程有限公司；TaqMan探針及引物由上海博亞生物工程有限公司合成。
其它生化試劑均為進口分裝或國產分析純。
三、實驗儀器DY-501型核酸電泳儀(上海精密科學儀器有限公司)PTC-100型PCR擴增儀(MJ Research Inc.)BECKMAN公司的DUR 640核酸和蛋白分析儀DNA電泳分析系統，包括暗箱、數碼照相機、計算機、掃描儀、Tanon UV-2000紫外分析儀、Gis凝膠圖像分析軟件(上海天能公司)其他儀器包括離心機，恒溫水浴鍋，培養箱，天平等。
四、實驗方法與過程1、基因組DNA提取與檢測1)植物基因組DNA提取a、取適量大豆樣品，加入液氮于研缽中研磨成粉末，稱取約70-100mg磨碎的樣品轉入1.5ml離心管中；b、視材料量的多少，加入600-700μl已預熱的Buffer A，輕輕混勻后，65℃水浴保溫1小時，期間間或振蕩混勻；c、在管中加入等體積酚/氯仿(600-700μl)溶液，上下顛倒充分混勻，常溫靜置抽提10分鐘；d、12000rpm離心10分鐘，吸取上清到一新離心管中；e、加入與上清等體積的異丙醇(約600μl)，混勻，常溫放置10分鐘后，12000rpm離心10分鐘，去上清，保留沉淀；f、在沉淀中加入60μl TE，37℃放置2分鐘后用槍頭將其充分混勻，于37℃放置約1小時；g、取出后補加140μl TE，再加入200μl酚/氯仿，混勻，靜置片刻；h、12000rpm離心5分鐘，取上清(約180μl)，加入1/10體積3M NaAc和2倍體積無水乙醇，-20℃放置30分鐘；i、12000rpm離心10分鐘，去上清，加入75％乙醇200μl，12000rpm離心5分鐘，棄上清，沉淀于室溫下晾干，后溶于50μl無菌ddH2O中。
2)質粒基因組DNA提取a、將37℃過夜1-2ml菌培養物于6000rpm離心1分鐘，徹底棄上清；b、加入菌液0.25倍體積的預冷STE溶液，將菌體重新充分懸浮，后6000rpm離心1分鐘，徹底棄上清；c、加入100μl Solution I，用槍頭或振蕩器充分懸浮細菌；d、加入200μl Solution II，立即上下顛倒溫和混勻，室溫放置2分鐘，使細菌充分裂解；e、加入350μl Solution III，立即上下顛倒數次，使之充分混勻、中和，室溫放置2分鐘后13000rpm離心5分鐘；f、將上清轉移到套放于2ml收集管內的GenClean柱中，于室溫8000rpm離心15秒；g、取出GenClean柱，倒掉收集管中廢液，將GenClean柱重新放回收集管中，加入500μl Wash Solution，于室溫10000rpm離心30秒；h、重復步驟g，用Wash Solution洗1-2次；i、棄廢液，于12000rpm室溫離心1分鐘，以徹底去除Wash Solution；j、將GenClean柱放入干凈1.5ml離心管中，打開管蓋室溫放置5分鐘使殘余的乙醇揮發，后在結合柱膜中央加入50μl Elution Buffer，37℃放置2分鐘；k、于室溫12000rpm離心2分鐘洗脫膜上的DNA。
3)DNA檢測取3μl提取的DNA樣品，用1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據其亮度和擴散程度判斷DNA的質量。
利用紫外分光光度法測定所提DNA的濃度與純度。
2、遺傳改良大豆品系GTS40-3-2品系特異性定量PCR引物的特異性分析優化遺傳改良大豆品系GTS40-3-2品系特異性PCR檢測體系及反應條件，并分別以其他遺傳改良植物為檢測模板定性擴增遺傳改良大豆品系GTS40-3-2品系特異性的目的片段，確定針對遺傳改良大豆品系GTS40-3-2設計的定量PCR引物特異性。
3、標準質粒分子pMD-RRS用于定量PCR檢測的檢測極限(LOD)和定量極限(LOQ)優化遺傳改良大豆品系GTS40-3-2品系特異性定量PCR檢測體系及反應條件，分別以不同濃度的標準質粒分子基因組DNA樣品(如2×109copies/μl、2×108copies/μl、2×107copies/μl、2×106copies/μl、2×105copies/μl、2×104copies/μl、2×103copies/μl、2×102copies/μl、2×101copies/μl和2×100copies/μl)作為標準品測試建立的定量PCR檢測方法的LOD和LOQ。每個反應重復三次，根據定量PCR擴增的標準曲線與擴增熒光信號間的線性關系，確定利用構建的標準質粒分子pMD-RRS代替陽性標準物質時，遺傳改良大豆品系GTS40-3-2品系特異性定量PCR檢測方法的LOD和LOQ。
4、標準質粒分子pMD-RRS定量PCR檢測體系的重復性和重演性優化遺傳改良大豆品系GTS40-3-2品系特異性定量PCR檢測體系及反應條件，分別以不同濃度標準質粒分子pMD-RRS基因組DNA樣品(2×106copies/μl、2×105copies/μl、2×104copies/μl、2×103copies/μl、2×102copies/μl和2×101copies/μl)進行重復性和復現性測試，每個反應重復三次。根據定量PCR擴增的標準曲線，確定根據標準質粒分子pMD-RRS建立的遺傳改良大豆品系GTS40-3-2品系特異性定量PCR反應的可重復性和重演性。
5、標準質粒分子pMD-RRS定量PCR檢測校正系數測定在利用標準分子進行定量分析時，必須考慮質粒DNA和大豆基因組DNA在PCR反應中的效率差異，這一差異可以通過校正系數(Coefficient Values，CVs)進行校正。CVs值的測定方法是用標準質粒分子建立定量PCR檢測體系，對純合的遺傳改良大豆品系GTS40-3-2標準陽性材料進行定量分析，通過比較定量分析的結果計算標準質粒分子pMD-RRS的校正系數CVs。CVs值可通過公式1計算得到。在獲得CVs值后，通過公式2可以分析獲得待測遺傳改良樣品中遺傳改良成分的含量。
公式1CVs＝純合的遺傳改良植物外源檢測目的基因拷貝數/純合的遺傳改良植物內源基因拷貝數公式2遺傳改良成分含量％＝(樣品外源檢測目的基因拷貝數×100)/(樣品內源基因拷貝數×CVs)6、應用標準質粒分子對實際遺傳改良大豆品系GTS40-3-2樣品的定量分析根據測定的標準質粒分子pMD-RRS的校正系數和繪制的遺傳改良大豆品系GTS40-3-2品系特異性定量PCR標準曲線，分別對4個遺傳改良大豆品系GTS40-3-2混合樣品(遺傳改良成分含量分別為0.5％、1.0％、3.0％和5.0％)進行分析，確定構建的遺傳改良大豆品系GTS40-3-2標準質粒分子是否可以有效地應用于實際遺傳改良大豆品系GTS40-3-2樣品的定量檢測。
五、實驗結果1、遺傳改良大豆品系GTS40-3-2品系特異性PCR檢測體系及反應條件經過優化，遺傳改良大豆品系GTS40-3-2的品系特異性PCR檢測體系和PCR擴增條件分別見表5和表6。
表5.遺傳改良大豆品系GTS40-3-2的品系特異性PCR檢測體系
表6.遺傳改良大豆品系GTS40-3-2的品系特異性定性PCR擴增條件
2、遺傳改良大豆品系GTS40-3-2品系特異性定量PCR引物的特異性分析根據表1中的引物序列，對遺傳改良大豆品系GTS40-3-2及其它遺傳改良作物如GT73油菜和MON531棉花等基因組樣品進行定性PCR擴增。結果表明，只有在遺傳改良大豆品系GTS40-3-2中，擴增得到了大小為85bp的目的片段條帶，而在其它遺傳改良作物中沒有檢測到該條帶。因此，本發明設計的GTS40-3-2大豆品系的定量PCR引物具有高度特異性。
3、遺傳改良大豆品系GTS40-3-2品系特異性定量PCR檢測體系的優化和建立根據定量PCR反應體系的優化方法，尋找最適宜的遺傳改良大豆品系GTS40-3-2品系特異性定量PCR引物和探針的濃度，保證定量PCR的反應效率達到90％以上。經過優化，當引物和探針的終濃度為400nM和200nM時，PCR擴增曲線的效率最高，熒光信號最強。因此該濃度用于建立遺傳改良大豆品系的定量PCR反應體系，其它成分量詳見表7，PCR擴增條件見表8。
表7.遺傳改良大豆品系GTS40-3-2的品系特異性定量PCR檢測體系
表8.遺傳改良大豆品系GTS40-3-2品系特異性定量PCR檢測擴增條件
4、標準質粒分子pMD-RRS進行定量PCR檢測的檢測極限(LOD)和定量極限(LOQ)利用優化好的遺傳改良大豆品系GTS40-3-2品系特異性定量PCR反應體系，分別以不同濃度的標準質粒分子基因組DNA樣品(如2×109copies/μl、2×108copies/μl、2×107copies/μl、2×106copies/μl、2×105copies/μl、2×104copies/μl、2×103copies/μl、2×102copies/μl、2×101copies/μl和2×100copies/μl)作為標準樣品測試本發明建立的定量PCR檢測體系的LOD和LOQ。經過3次重復實驗確定該體系的LOD為2個拷貝，LOQ為20個拷貝。說明構建的pMD-RRS標準質粒分子可以代替遺傳改良大豆品系GTS40-3-2陽性標準品定量檢測遺傳改良大豆品系GTS40-3-2及其加工產品遺傳改良成分含量。
以濃度為2×109copies/μl、2×108copies/μl、2×107copies/μl、2×106copies/μl、2×105copies/μl、2×104copies/μl、2×103copies/μl、2×102copies/μl、2×101copies/μl和2×100copies/μl的pMD-RRS大豆標準質粒分子基因組DNA樣品為標準品繪制遺傳改良大豆品系GTS40-3-2品系特異性定量PCR標準曲線。根據定量標準曲線及該體系的LOD和LOQ結果可以認為，本發明通過構建的標準質粒分子建立的遺傳改良大豆品系GTS40-3-2品系特異性定量PCR檢測系統具有很高的準確性和靈敏度，完全可以用于遺傳改良大豆品系GTS40-3-2及其加工產品的實際檢測。
5、利用標準質粒分子pMD-RRS建立的定量PCR檢測體系的重復性和重演性測定在優化的遺傳改良大豆品系特異性定量PCR反應條件下，分別以不同濃度標準質粒分子pMD-RRS基因組DNA樣品(2×106copies/μl、2×105copies/μl、2×104copies/μl、2×103copies/μl、2×102copies/μl和2×101copies/μl)進行重復性和可復現性的測試，3個平行反應間和3次不同重復實驗間獲得的Ct值標準偏差基本上都小于0.2，說明根據構建的pMD-RRS標準質粒分子建立的遺傳改良大豆品系GTS40-3-2品系特異性定量PCR反應的重復性和重演性好，可以用于實際遺傳改良大豆品系GTS40-3-2樣品的進一步定量分析。
6、利用大豆標準質粒分子pMD-RRS建立的定量PCR檢測體系校正系數測定用標準質粒分子pMD-RRS代替遺傳改良大豆品系GTS40-3-2陽性標準品用于定量PCR檢測時，通過標準質粒分子建立了定量PCR檢測方法，對純合的遺傳改良大豆品系GTS40-3-2標準陽性材料進行定量分析，通過比較定量分析的結果計算標準質粒分子pMD-RRS的校正系數，為0.92，見表9。
表9.標準質粒分子pMD-RRS用于定量PCR分析的校正系數測定
7、應用pMD-RRS標準質粒分子對實際遺傳改良大豆品系GTS40-3-2樣品的定量分析根據測定的標準質粒分子pMD-RRS的校正系數和繪制的遺傳改良大豆品系GTS40-3-2品系特異性定量PCR標準曲線，分別對4個遺傳改良大豆品系GTS40-3-2混合樣品(遺傳改良成分含量分別為0.5％、1.0％、3.0％和5.0％)進行了分析，定量分析結果顯示4個遺傳改良大豆品系GTS40-3-2混合樣品的含量分別為0.429％、1.168％、3.327％和5.246％，與真實值的偏差分別為14.2％、16.8％、10.9％和4.92％，定量結果的標準偏差在0.12-0.18范圍內(具體數據見表10)。檢測結果表明利用標準質粒分子pMD-RRS對實際樣品分析的結果比較準確，檢測結果的偏差在ISO轉基因食品檢測標準允許的0-0.25范圍內，表明本發明構建的遺傳改良大豆品系GTS40-3-2標準質粒分子pMD-RRS完全可以代替該品系的陽性標準品，構建的標準質粒分子完全適用于遺傳改良大豆品系GTS40-3-2樣品的品系特異性定量PCR分析和檢測。
表10.遺傳改良大豆品系GTS40-3-2樣品的定量分析結果
權利要求
1.一種遺傳改良大豆品系GTS40-3-2檢測用標準質粒分子，其特征在于，含有遺傳改良大豆品系GTS40-3-2的品系特異性序列和大豆內標準基因Lectin的特異性片段。
2.根據權利要求1所述的遺傳改良大豆品系GTS40-3-2檢測用標準質粒分子，其特征是，所述的大豆內標準基因Lectin，指的是大豆凝集素基因。
3.根據權利要求1所述的遺傳改良大豆品系GTS40-3-2檢測用標準質粒分子，其特征是，所述的遺傳改良大豆品系GTS40-3-2的品系特異性序列，指的是遺傳改良大豆品系GTS40-3-2外源插入載體與大豆基因組鄰接區的DNA序列。
4.一種如權利要求1所述的遺傳改良大豆品系GTS40-3-2檢測用標準質粒分子的構建方法，其特征在于，包括如下步驟①利用數據庫進行生物信息學分析，獲得大豆內標準基因Lectin、遺傳改良大豆品系GTS40-3-2的品系特異性序列；②設計PCR特異性引物；③特異性擴增大豆內標準基因Lectin和遺傳改良大豆品系GTS40-3-2的品系特異性序列；④大豆內標準基因Lectin和遺傳改良大豆品系GTS40-3-2品系特異性序列的拼接；⑤含有新的重組DNA片段的質粒分子克隆，得到標準質粒分子pMD-RRS。
5.根據權利要求4所述的遺傳改良大豆品系GTS40-3-2檢測用標準質粒分子的構建方法，其特征是，所述的大豆內標準基因Lectin，指的是大豆凝集素基因，其在大豆基因組中高度保守，具有種間特異性、種內非特異性和單拷貝數的特點；所述的遺傳改良大豆品系GTS40-3-2的品系特異性序列，指的是遺傳改良大豆品系GTS40-3-2外源插入載體與大豆基因組鄰接區的一段DNA序列。
6.根據權利要求4所述的遺傳改良大豆品系GTS40-3-2檢測用標準質粒分子的構建方法，其特征是，所述的PCR特異性引物，指的是長度為28±10nt的寡核苷酸鏈，其與大豆Lectin基因或者遺傳改良大豆品系GTS40-3-2的品系特異性序列完全相同或者互補。
7.根據權利要求4所述的遺傳改良大豆品系GTS40-3-2檢測用標準質粒分子的構建方法，其特征是，所述的特異性擴增，指的是利用設計的PCR引物特異性擴增內標準基因Lectin的一段序列和遺傳改良大豆品系GTS40-3-2的品系特異性序列。
8.根據權利要求4所述的遺傳改良大豆品系GTS40-3-2檢測用標準質粒分子的構建方法，其特征是，所述的拼接，指的是利用重疊PCR技術將大豆內標準基因Lectin和遺傳改良大豆品系GTS40-3-2品系特異性序列兩個獨立的DNA片段連接融合成一個重組的新DNA片段。
9.根據權利要求4所述的遺傳改良大豆品系GTS40-3-2檢測用標準質粒分子的構建方法，其特征是，所述的分子克隆，指的是將上述得到的重組特異性DNA片段按照設計的限制性內切酶酶切位點連接到質粒載體pMD18-T上，獲得標準質粒分子pMD-RRS。
全文摘要
一種遺傳改良大豆品系GTS40－3－2檢測用標準質粒分子及其構建方法，所述標準質粒分子包含遺傳改良大豆品系GTS40－3－2的品系特異性片段和大豆內標準基因Lectin特異性片段；通過對遺傳改良大豆品系GTS40－3－2的外源插入載體旁鄰基因序列分析，設計品系特異性PCR引物擴增獲得遺傳改良大豆品系GTS40－3－2的品系特異性片段，以及大豆內標準基因特異性序列；通過分子克隆的方法構建到一個質粒分子中而成的人工重組質粒分子pMD－RRS。本發明中構建的標準質粒分子完全可以代替遺傳改良大豆品系GTS40－3－2陽性標準品，該標準質粒分子完全適用于對遺傳改良大豆品系GTS40－3－2樣品的品系特異性定量PCR分析和檢測。
文檔編號C12N15/29GK101063171SQ20071004112
公開日2007年10月31日 申請日期2007年5月24日 優先權日2007年5月24日
發明者張大兵, 楊立桃, 張海波, 李想, 郭金超 申請人:上海交通大學