專利名稱：：海藻酸-碳酸鈣雜化凝膠固定β-葡萄糖醛酸苷酶的方法
技術領域：
：本發明涉及酶的固定化技術，特別是一種海藻酸一碳酸鈣雜化凝膠固定e-葡萄糖醛酸苷酶的方法。
背景技術：
：海藻酸凝膠是一種常用的固定化酶載體。目前，海藻酸凝膠固定化酶主要采用包埋法。包埋法條件溫和，生物相容性好，有利于維持酶的結構完整性，進而提高酶的活性維持率，而且載體孔徑較大，有利于反應物和產物傳遞。海藻酸凝膠固定化酶通常存在的問題是載體的孔徑較大，酶分子容易泄漏。凝膠形成過程中存在"脫水收縮"現象，一部分酶會隨水排出載體。凝膠易溶脹，機械強度差，循環使用穩定性和儲存穩定性不高。解決問題的方法通常是利用雙功能基團交聯劑如戊二醛等進行交聯，使凝膠載體更加致密，或是利用無機粒子預吸附酶分子，然后進行包埋，制備有機一無機雜化固定化載體。中孔二氧化硅材料是固定化酶時最常用的吸附劑，但研究表明，這類中孔材料盡管具有較大的比表面積和孔體積，但是一般孔徑較小，吸附較大尺寸的酶分子效果不好。另外由于合成方法所限，一般的中孔二氧化硅均帶負電，與帶負電的酶分子存在靜電斥力，影響吸附效果。中孔碳酸鈣具有較大的孔徑且帶有正電，同時制備簡單，材料廉價易得，適合固定化以葡萄糖醛酸苷酶為代表的具有較大尺寸和負電性的酶，因此在固定化酶領域具有廣泛的應用前景。
發明內容本發明的目的在于提供一種利用海藻酸一碳酸鈣雜化凝膠固定e-葡萄糖醛酸苷酶的方法。以該方法所制得的固定p-葡萄糖醛酸苷酶雜化載體，e-葡萄糖醛酸苷酶的泄漏率低，載體溶脹度低，重復使用性好。本發明提供的一種海藻酸一碳酸鈣雜化凝膠固定p-葡萄糖醛酸苷酶的方法包括以下步驟(1)等體積等濃度的碳酸鈉溶液和氯化鈣溶液室溫下混合攪拌，靜置，碳酸鈣粉末沉淀依次用水和丙酮洗滌，空氣中自然干燥，得到微米級中孔碳酸鈣顆粒；(2)在e-葡萄糖醛酸苷酶的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tirs-HCl)緩沖液中或起水溶液中加入碳酸鈣顆粒，室溫下吸附，離心分離，得到吸附葡萄糖醛酸苷酶的碳酸鈣顆粒；(3)海藻酸鈉溶液與制得的吸附葡萄糖酸酸苷酶的碳酸鈣顆粒混合均勻，再滴加到氯化鈣溶液中，老化，得到海藻酸一碳酸鈣雜化凝膠固定葡萄糖醛酸苷酶的顆粒。本發明提供的海藻酸一碳酸鈣雜化凝膠固定e-葡萄糖酵酸苷酶的方法包括以下歩驟(1)將100ml0.33M的碳酸鈉溶液迅速倒入等體積等濃度的氯化鈣溶液，室溫下高速攪拌30s，然后停止攪拌，靜置15分鐘，將所得的碳酸鈣粉末離心，依次用去離子水和丙酮洗滌，空氣中自然干燥，得到微米級中孔碳酸鈣顆粒；(2)將e-葡萄糖醛酸苷酶溶于濃度為0.05mol/L的三羥甲基氨基甲垸-鹽酸(Tirs-HCl)緩沖液中或去離子水中，配制成濃度為0.5mg/niL的P-葡萄糖醛酸苷酶溶液，然后將15mg碳酸鈣顆粒與lml日-葡萄糖醛酸苷酶溶液混合，室溫下吸附2h,離心分離得到吸附葡萄糖醛酸苷酶的碳酸鈣顆粒；(3)將海藻酸鈉溶于去離子水制成2.0%的溶液，取5ml與按照歩驟(2)制得的吸附葡萄糖醛酸苷酶的碳酸鈣顆粒混合均勻，用注射器滴加到0.2M的氯化鈣溶液中，老化30min，得到海藻酸一碳酸鈣雜化凝膠固定P-葡萄糖醛酸苷酶的顆粒。本發明提出的制備方法的優點在于制備條件溫和，制備工藝簡單易行，所得雜化載體對酶具有很好的固定能力，固定化p-葡萄糖醛酸苷酶的泄漏率低，溶脹度低，重復使用穩定性好。圖i為實施例i制備的海藻酸一碳酸鈣雜化凝膠固定e-葡萄糖醛酸苷酶的顆粒的掃描電鏡(SEM)照片。圖2為實施例二制備的海藻酸一碳酸鈣雜化凝膠與海藻酸空白凝膠的溶脹度變化圖.圖3為實施例i制備的海藻酸一碳酸鈣雜化凝膠固定的e-葡萄糖醛酸苷酶的循環使用酶活力的變化圖。具體實施方式實施例1準確稱取e-葡萄糖醛酸苷酶2.5mg，溶解于0.05mol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖溶液中，定容至5mL，得到0.5mg/mLe-葡萄糖醛酸苷酶液。然后將15mg碳酸鈣顆粒與lml0.5mg/mLe-葡萄糖醛酸苷酶液混合，吸附2h，離心分離，獲得吸附葡萄糖醛酸苷酶的碳酸鈣顆粒。將海藻酸鈉溶于去離子水制成2.0%的溶液，取5ml海藻酸鈉溶液與15mg吸附葡萄糖醛酸苷酶的碳酸鈣顆粒混合均勻，用注射器滴加到0.2M的氯化鈣溶液中，靜置30min，得到海藻酸一碳酸鈣雜化凝膠固定e-葡萄糖醛酸苷酶的顆粒，測定氯化鈣溶液中的葡萄糖醛酸苷酶含量，得到凝膠形成過程中葡萄糖醛酸苷酶泄漏率為9.4%.將固定化葡萄糖醛酸苷酶的雜化凝膠顆粒浸泡于三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖溶液中10h，測得溶液中無葡萄糖醛酸苷酶泄漏，得到凝膠存放過程中葡萄糖醛酸苷酶的泄漏率為0。實施例2將100ml0.33M的碳酸鈉溶液迅速倒乂等體積等濃度的氯化鈣溶液，室溫下高速攪拌30s，然后停止攪拌，靜置15分鐘，離心分離后，將所得的固體碳酸鈣依次用去離子水和丙酮洗滌，空氣中自然干燥，得到微米級中孔碳酸鈣顆粒；將海藻酸鈉溶于去離子水制成2.0%的溶液，取5ml海藻酸鈉溶液與15mg碳酸鈣顆粒混合均勻，用注射器滴加到0.2M的氯化鈣溶液中，老化30min，得到海藻酸一碳酸鈣雜化凝膠顆粒。將黃芩苷和無水亞硫酸鈉溶解到0.03mol/LTris-HC1緩沖溶液中，配成黃芩苷濃度為0.09mol/L，無水亞硫酸鈉濃度為0.1%w/v的溶液，加入雜化凝膠顆粒，室溫下存放20h，稱量雜化凝膠顆粒質量變化，得到溶脹度為20%。實施例3:循環使用穩定性的測定對本發明實施例i制備的固定e-葡萄糖醛酸苷酶的雜化凝膠顆粒的循環使用穩定性進行測定將黃芩苷和無水亞硫酸鈉溶解到0.03mol/LTris-HCl緩沖溶液中，配成黃芩苷濃度為0.09mol/L，無水亞硫酸鈉濃度為0.1%w/v的溶液，加入實施例1制備的固定化13_葡萄糖酸酸苷酶的顆粒，在37'C，攪拌的條件下進行黃芩苷的轉化反應，用高效液相色譜確定黃芩素的生成量，得到固定化0-葡萄糖醛酸苷酶的酶活力，并以此酶活力為初始酶活力，定義為100%。將反應液過濾，用去離子水清洗顆粒至上清液中無黃芩苷和黃芩素。重復上述反應過程，得到第二次重復使用的固定化13-葡萄糖醛酸苷酶的酶活力，與初始活力相比，此時的相對酶活力為93%。重復分離和反應過程，得到第三次重復使用的固定化e-葡萄糖醛酸苷酶的相對酶活力為90%;第四次重復使用的固定化0-葡萄糖醛酸苷酶的相對酶活力為87%;第五次重復使用的固定化0-葡萄糖醛酸苷酶的相對酶活力為85%;第六次重復使用的固定化{3-葡萄糖醛酸苷酶的相對酶活力為80%，第七次重復使用的固定化葡萄糖醛酸苷酶的相對酶活力為80%。對比例1準確稱取e-葡萄糖醛酸苷酶2.5mg，溶解于0.05mol/L三羥甲基氨基甲垸-鹽酸(Tris-HC1)緩沖溶液中，定容至5mL，得到0.5mg/mLP-葡萄糖醛酸苷酶液。將海藻酸鈉溶于去離子水制成2.5%的溶液，取4ml海藻酸鈉溶液與lml葡萄糖醛酸苷酶溶液混合均勻，用注射器滴加到0.2M的氯化鈣溶液中，老化30min，得到固定P-葡萄糖醛酸苷酶的空白海藻酸凝膠顆粒，測定氯化鈣溶液中的葡萄糖醛酸苷酶含量，得到凝膠形成過程中葡萄糖醛酸苷酶泄漏率為21.8%.將固定化葡萄糖醛酸苷酶的雜化凝膠顆粒浸泡于三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖溶液中10h，測定溶液中葡萄糖醛酸苷酶含量,得到凝膠存放過程中葡萄糖醛酸苷酶的泄漏率為6.2%。對比例2將海藻酸鈉溶于去離子水制成2.0%的溶液，用注射器滴加到0.2M的氯化鈣溶液中，老化30min，去離子水洗滌，過濾后得到空白海藻酸凝膠顆粒。將黃芩苷和無水亞硫酸鈉溶解到0.03mol/LTris-HCl緩沖溶液中，配成黃芩苷濃度為0.09mol/L，無水亞硫酸鈉濃度為0.1%w/v的溶液，加入空白海藻酸凝膠顆粒，室溫下存放20h，稱量雜化凝膠顆粒質量變化，得到溶脹度為130%。對比例3:循環使用穩定性的測定對對比例1制備的固定e-葡萄糖醛酸苷酶的空白海藻酸凝膠顆粒的循環使用穩定性進行測定將黃芩苷和無水亞硫酸鈉溶解到0.03niol/LTris-HC1緩沖溶液中，配成黃芩苷濃度為0.09mol/L，無水亞硫酸鈉濃度為0.1%w/v的溶液，加入對比例1制備的固定化(3-葡萄糖醛酸苷酶的空白海藻酸凝膠顆粒，在37'C，攪拌的條件下進行黃芩苷的轉化反應，用高效液相色譜確定黃芩素的生成量，得到固定化P-葡萄糖醛酸苷酶的酶活力，并以此酶活力為初始酶活力，定義為100%。將反應液過濾，用去離子水清洗顆粒至上清液中無黃零苷和黃芩素。重復上述反應過程，得到第二次重復使用的固定化e-葡萄糖醛酸苷酶的酶活力，與初始活力相比，此時的相對酶活力為84%。重復分離和反應過程，得到第三次重復使用的固定化e-葡萄糖醛酸苷酶的相對酶活力為75%;第四次重復使用的固定化^-葡萄糖醛酸苷酶的相對酶活力為73%;第五次重復使用的固定化e-葡萄糖醛酸苷酶的相對酶活力為72%;第六次重復使用的固定化0-葡萄糖醛酸苷酶的相對酶活力為46%,第七次重復使用的固定化e-葡萄糖醛酸苷酶的相對酶活力為39%。表1所示為實施例1和對比例1測定的海藻酸一碳酸鈣雜化載體與空白海藻酸載體在固定化13-葡萄糖醛酸苷酶的泄漏率對比結果。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表2所示為實施例2和對比例2測定的海藻酸一碳酸鈣雜化載體與空白海藻酸載體的溶脹度對比結果。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表3所示為實施例三和對比例三測定的海藻酸一碳酸鈣雜化載體與空白海藻酸載體固定化葡萄糖醛酸苷酶的循環使用七次用于黃芩苷的轉化反應的對比結果表3<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>從對比結果可見，海藻酸-碳酸鈣雜化凝膠固定化e-葡萄糖醛酸苷酶泄漏率低，載體溶脹度低.循環七次用于黃芩苷的轉化反應時，每次反應相對酶活力均高于空白海藻酸鈣凝膠固定化{3-葡萄糖醛酸苷酶。權利要求1、一種海藻酸-碳酸鈣雜化凝膠固定β-葡萄糖醛酸苷酶的方法，其特征在于包括以下步驟(1)等體積等濃度的碳酸鈉溶液和氯化鈣溶液室溫下混合攪拌，靜置，碳酸鈣粉末沉淀依次用水和丙酮洗滌，空氣中自然干燥，得到微米級中孔碳酸鈣顆粒；(2)在β-葡萄糖醛酸苷酶的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tirs-HCl)緩沖液中或起水溶液中加入碳酸鈣顆粒，室溫下吸附，離心分離，得到吸附葡萄糖醛酸苷酶的碳酸鈣顆粒；(3)海藻酸鈉溶液與制得的吸附葡萄糖醛酸苷酶的碳酸鈣顆粒混合均勻，再滴加到氯化鈣溶液中，老化。2、一種海藻酸一碳酸鈣雜化凝膠固定e-葡萄糖醛酸苷酶的方法，其特征在于包括以下步驟(1)將100ml0.33M的碳酸鈉溶液迅速倒入等體積等濃度的氯化鈣溶液，室溫下高速攪拌30s，然后停止攪拌，靜置15分鐘，將所得的碳酸鈣粉末離心，依次用去離子水和丙酮洗滌，空氣中自然干燥，得到微米級中孔碳酸鈣顆粒；(2)將e-葡萄糖醛酸苷酶溶于濃度為0.05niol/L的三羥甲基氨基甲垸-鹽酸緩沖液中或去離子水中，配制成濃度為0.5mg/mL的葡萄糖醛酸苷酶溶液，然后將15mg碳酸鈣顆粒與lmie-葡萄糖醛酸苷酶溶液混合，室溫下吸附2h，離心分離得到吸附葡萄糖醛酸苷酶的碳酸鈣顆粒；(3)將海藻酸鈉溶于去離子水制成2.0%的溶液，取5ml與按照歩驟(2)制得的吸附葡萄糖醛酸苷酶的碳酸鈣顆粒混合均勻，用注射器滴加到0.2M的氯化鈣溶液中，老化30min。3、權利要求i或2所述的方法得到海藻酸一碳酸鈣雜化凝膠固定e-葡萄糖醛酸苷酶的顆粒。全文摘要本發明涉及一種海藻酸—碳酸鈣雜化凝膠固定β-葡萄糖醛酸苷酶的方法。碳酸鈉溶液和氯化鈣溶液室溫下混合攪拌生成碳酸鈣粉末沉淀，靜置，用水和丙酮洗滌，干燥，得到微米級中孔碳酸鈣顆粒加入到β-葡萄糖醛酸苷酶的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tirs-HCl)緩沖液中或起水溶液中吸附，離心分離，得到吸附葡萄糖醛酸苷酶的碳酸鈣顆粒與海藻酸鈉溶液混合均勻，再滴加到氯化鈣溶液中，老化。本發明制備條件溫和，制備工藝簡單易行，所得雜化載體對酶具有很好的固定能力，固定化β-葡萄糖醛酸苷酶的泄漏率低，溶脹度低，重復使用穩定性好。文檔編號C12N11/04GK101205532SQ200710060359公開日2008年6月25日申請日期2007年12月19日優先權日2007年12月19日發明者洪吳,姜忠義,張羽飛,健李,冬楊申請人:天津大學