專利名稱：：肉色曲霉生產濃縮堿性脂肪酶的方法
技術領域：
：本發明涉及生物
技術領域：
，尤其是一種肉色曲霉生產濃縮堿性脂肪酶的方法。
背景技術：
：堿性脂肪酶是一種新型洗滌劑用酶，主要用途是作為洗滌劑的新酶種。它的特性能分解衣物油污成甘油二脂、甘油單脂及脂肪酸等較易溶于水的物質，從而顯著提高洗衣粉的洗滌效果，尤其是去除黃斑的效果。我們常用各種含酶洗衣粉，其中的酶制劑主要有堿性蛋白酶和堿性脂肪酶。堿性蛋白酶用于分解蛋白質類污物，如汗漬、血漬等。堿性脂肪酶則主要作用于脂肪酸及其酯類污物，也就是我們通常所指的油污類。酶作為一種生物制劑，無毒并能完全生物降解，對環境的生態平衡起良性的作用。目前，國內外報道的微生物脂肪酶產生菌己多達65個屬，其中細菌28個屬；絲狀真菌23個屬；酵母菌10個屬；放線菌4個屬。絲狀真菌在細胞外分泌酶，是一種優異的脂肪酶產生菌種。但是國內未見有通過肉色曲霉菌種生產脂肪酶的報道。
發明內容本發明的目的是提供一種肉色曲霉生產濃縮堿性脂肪酶的方法。本發明實現目的的技術方案是一種肉色曲霉生產濃縮堿性脂肪酶的方法，其生產方法的步驟是(1).在種子培養基上制備肉色曲霉菌種；(2).肉色曲霉菌種在發酵培養基上制備發酵液，紙板過濾形成過濾酶液；(3).過濾酶液脫色，經紙板精濾形成脫色過濾酶液；(4).脫色過濾酶液進行超濾濃縮，即得到濃縮堿性脂肪酶。而且，所述的種子培養基為土豆斜面培養基，肉色曲霉菌種的制備方法是菌株肉色曲霉在土豆斜面培養基上2729。C溫度條件下培養7296小時；而且，所述的發酵培養基的構成及其重量百分比分別為黃豆粉2;玉米粉l;糊精l;檸檬酸鈉O.1;N線0.5;K2HP040.5;FeS040.006;大豆油0.20.5;蔗糖1;NH4N030.5;培養基的pH=8.0，培養溫度為2837°C，培養時間為9597h，酶活為10.2114.18U/ml。而且，所述的過濾酶液脫色采用中顆粒活性炭，加入量為0.51.0%，脫色時間為2030min。而且，所述的脫色過濾酶液進行超濾濃縮采用醋酸纖維膜，操作溫度為1020°C，壓力為0.050.1Mpa。而且，所述的肉色曲霉菌種在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，其保藏編號為CGMCCNo.3.3919。本發明的優點和積極效果是本發明的菌株采用肉色曲霉"印er^77"scs273e"s人經過斜面培養、發酵培養及提取工藝獲得濃縮酶，并對該脂肪酶進行酶學性質研究。用本發明菌株肉色曲霉生產脂肪酶的最適pH值為10.0，最適溫度為3(TC，pH和熱穩定性好，可抗表面活性劑和漂白劑，能夠成為一種新型的應用于常溫和低溫洗滌劑的酶制劑。圖l為本發明的PH值對酶活性影響的曲線圖；圖2為本發明溫度對酶活性影響的曲線圖。具體實施方式下面結合實施例，對本發明進一步說明；下述實施例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實施例來限定本發明的保護范圍。本發明所使用的肉色曲霉菌種是中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏的一種肉色曲霉，保藏編號為CGMCCNo.3.3919。一種肉色曲霉生產濃縮堿性脂肪酶的方法，其生產方法的步驟是(1).在種子培養基上制備肉色曲霉菌種，以下提供三個實例a..種子培養基采用土豆斜面培養基PDA+2y。的蔗糖；培養條件28°C溫度下培養72小時。b.種子培養基采用土豆斜面培養基PDA+29&的蔗糖；培養條件28'C溫度下培養84小時。c.種子培養基采用土豆斜面培養基PDA+2W的蔗糖；培養條件28°C溫度下培養96小時。(2).肉色曲霉菌種在發酵培養基上制備發酵液，經紙板過濾形成過濾酶液，以下提供三個實例a.發酵培養基(％):黃豆粉2;玉米粉1;糊精1;檸檬酸鈉0.1;NaN030.5;K2HP040.5;FeS040.006;大豆油0.5(mL);蔗糖1;NH4N030.5;pH8.0。接種與培養條件孢子懸浮液的濃度為6.2X106，接種量10e/ml，培養37°C，培養時間為96h，測得的酶活為10.21U/ml。4b.發酵培養基(％):黃豆粉2;玉米粉l;糊精l;擰檬酸鈉0.1;NaN030.5;K2HP040.5;FeS040.006;大豆油0.5(mL);蔗糖1;NH4N030.5;pH8.0。接種與培養條件孢子懸浮液的濃度為6.2X106，接種量10e/ml，培養溫度28°C，培養時間為96h，測得的酶活為12.68U/ml。C.發酵培養基(％):黃豆粉2;玉米粉1;糊精1;檸檬酸鈉0.1;NaNO30.5;K2HP040.5;FeS040.006;大豆油0.5(mL);蔗糖1;NH4N030.5;pH8.0。接種與培養條件孢子懸浮液的濃度為6.2X106，接種量10e/ml，培養溫度30°C，培養時間為96h，測得的酶活為14.18U/ml。(3).過濾酶液脫色，紙板精濾形成脫色過濾酶液，以下提供三個實例a.過濾酶液經紙板精濾后加入中顆粒活性炭進行脫色處理，加入量為0.5%，脫色30min，觀察脫色過濾酶液外觀，測定酶活力。b.過濾酶液經紙板精濾后加入中顆粒活性炭進行脫色處理，加入量為0.5%，脫色20min，觀察脫色過濾酶液外觀，測定酶活力。c.過濾酶液經紙板精濾后加入中顆粒活性炭進行脫色處理，加入量為1.0%，脫色30min，觀察脫色過濾酶液外觀，測定酶活力。結論采用P/。中顆粒活性炭進行脫色處理30min后，脫色過濾液顏色由深褐色變為金黃色，脫色效果最為明顯，，酶活收率為92.4%，達到了所需的最佳脫色效果。(4).脫色過濾酶液進行超濾濃縮，即得到濃縮堿性脂肪酶，以下提供四個實例:a.將脫色過濾酶液進行超濾濃縮，采用醋酸纖維膜，超濾溫度20'C，操作壓力0.05MP，超濾2小時后，測定濃縮酶液酶活力以及濃縮倍數。b.將脫色過濾酶液進行超濾濃縮，采用醋酸纖維膜，超濾溫度2(TC，操作壓力O.10MP,超濾2小時后，測定濃縮酶液酶活力以及濃縮倍數。c.將脫色過濾酶液進行超濾濃縮，采用醋酸纖維膜，超濾溫度1(TC，操作壓力0.05MP，超濾2小時后，測定濃縮酶液酶活力以及濃縮倍數。d.將脫色過濾酶液進行超濾濃縮，采用醋酸纖維膜，超濾溫度1(TC，操作壓力O.1MP，超濾2小時后，測定濃縮酶液酶活力以及濃縮倍數。結論采用醋酸纖維的超濾膜進行堿性脂肪酶的超濾，超濾溫度IO'C，操作壓力為0.05MP時，單位時間酶的濃縮倍數最高，且酶活回收率最大為96.1%，達到了所需的最佳濃縮效果。總論本實驗活性炭脫色后用醋酸纖維膜超濾，有效提高脂酶液澄清度，提高液體酶商品性狀。每個濃縮工藝階段酶的回收率都維持在較高的水平，脫色精濾和超濾濃縮工藝酶的回收率分別達到92.4%和96.1%，最終整個工藝流程的總回收率為88.80%(見表1)。表1提取流程中酶活力檢測<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>下面對本發明進行酶學性質研究，以進一步論證本發明的先進性。例1:以對-棕櫚酸硝基苯酯為底物，用領域內常規的方法檢測PH值對制得的肉色曲霉濃縮酶活性的影響，表明酶作用的PH值范圍為6.0—-12.0，最佳pH值為10.0，對堿性環境有極強的耐受性。檢測結果見圖l。例2:以對-棕櫚酸硝基苯酯為底物，用領域內常規的方法檢測溫度對制得的肉色曲霉濃縮酶活性的影響，表明所產酶作用的溫度范圍為10°C--70°C，最佳溫度為30°C。檢測結果見圖2。例3以對-棕櫚酸硝基苯酯為底物，檢測肉色曲霉濃縮酶與表面活性劑(TritonX—lOO、Tween-80、Tween-20)、漂白劑(過硼酸鈉、過氧化氫)按濃度1%于30°C、pH10.0下保溫1個小時后脂肪酶活性的變化。結果顯示該脂肪酶活力除了與TritonX—lOO共存時大幅度提高，其他均變化不大。該酶具有良好的抗表面活性劑與氧化劑特性。檢測結果見表2。表2清潔劑對酶活的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>權利要求1.一種肉色曲霉生產濃縮堿性脂肪酶的方法，其特征在于其生產方法的步驟是(1).在種子培養基上制備肉色曲霉菌種；(2).肉色曲霉菌種在發酵培養基上制備發酵液，紙板過濾形成過濾酶液；(3).過濾酶液脫色，經紙板精濾形成脫色過濾酶液；(4).脫色過濾酶液進行超濾濃縮，即得到濃縮堿性脂肪酶。2.根據權利要求1所述的肉色曲霉生產濃縮堿性脂肪酶的方法，其特征在于所述的種子培養基為土豆斜面培養基，肉色曲霉菌種的制備方法是菌株肉色曲霉在土豆斜面培養基上2729。C溫度條件下培養7296小時；3.根據權利要求1所述的肉色曲霉生產濃縮堿性脂肪酶的方法，其特征在于所述的發酵培養基的構成及其重量百分比分別為黃豆粉2;玉米粉l;糊精l;檸檬酸鈉O.1;NaN030.5;K2HP040.5;FeS040.006;大豆油0.20.5;蔗糖1;NH4N030.5;培養基的pH二8.O,培養溫度為2837°C，培養時間為9597h，酶活為10.2114.18U/ml。4.根據權利要求1所述的肉色曲霉生產濃縮堿性脂肪酶的方法，其特征在于所述的過濾酶液脫色采用中顆粒活性炭，加入量為0.51.0%，脫色時間為2030min。5.根據權利要求1所述的肉色曲霉生產濃縮堿性脂肪酶的方法，其特征在于所述的脫色過濾酶液進行超濾濃縮采用醋酸纖維膜，操作溫度為1020。C，壓力為0.050.1Mpa。6.根據權利要求1或2所述的肉色曲霉生產濃縮堿性脂肪酶的方法，其特征在于所述的肉色曲霉菌種在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，其保藏編號為CGMCCNo.3.3919。全文摘要本發明涉及一種肉色曲霉生產濃縮堿性脂肪酶的方法，其制備方法的步驟是(1).在種子培養基上制備肉色曲霉菌種；(2).肉色曲霉菌種在發酵培養基上制備發酵液，紙板過濾形成過濾酶液；(3).過濾酶液脫色，紙板精濾形成脫色過濾酶液；(4).脫色過濾酶液進行超濾濃縮，即得到濃縮堿性脂肪酶。用本發明菌株肉色曲霉生產脂肪酶的最適pH值為10.0，最適溫度為30℃，pH和熱穩定性好，可抗表面活性劑和漂白劑，能夠成為一種新型的應用于常溫和低溫洗滌劑的酶制劑。文檔編號C12N9/20GK101210235SQ20071006020公開日2008年7月2日申請日期2007年12月25日優先權日2007年12月25日發明者劉瑞娟,薇戚,王建玲,王春霞,王海寬,趙婷婷,路福平申請人:天津科技大學