專利名稱：香港海鷗形菌檢驗技術的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種檢驗技術，特別是一種細菌的檢驗技術。
背景技術：
香港海鷗形菌是2001年在香港被首次發現的一種新的腸道致病菌，經深入研究發現，該細菌主要引起感染者腹瀉，而食用淡水魚與外出旅行是該細菌感染的危險因素。由于這是一種新發現的細菌，目前尚未建立對該細菌的一套規范、有效、快捷的檢驗技術與檢驗流程。香港在檢驗香港海鷗形菌時要做生化試驗十多項，所以檢出率較低，不易發現，檢出程序過于復雜。
發明內容
本發明的目的是提供一種簡便、實用、快速的香港海鷗形菌檢驗技術。
本發明的目的是通過下述方法實現的1、取糞便標本，接種在含有頭孢哌酮的麥康凱培養基上，放入溫度為37℃培養箱內培養48小時后取出；2、肉眼在其內挑選無色、透明、扁平狀，直徑在0.5mm～1.0mm之間的微小菌落進行純化培養；3、對培養的菌按以下步驟進行實驗第一步用常規革蘭染色檢驗為陰性的短桿菌或弧菌第二步用常規氧化酶、觸酶試驗必須均為陽性后，第三步再用常規接種在三糖鐵培養基試管內，置于溫度為37℃培養箱內培養24小時后取出試管；4、用肉眼觀察試管內鮮紅色培養基保持原來的顏色不變或顏色變得更深；5、凡符合上述實驗3)和4)結果的細菌，采用PCR診斷技術診斷，當PCR診斷結果呈陽性，即診斷為香港海鷗形菌。
所述在麥康凱瓊脂內加入頭孢哌酮的濃度在15～17mg/L之間。所述濃度是16mg/L。所述PCR診斷香港海鷗形菌檢驗技術的由特異性引物對P2F5’TTGAGGGTGCCCGAAAGGGA3’，P2B5’CTACCCACTTCTGGCGGATT3’。
香港海鷗形菌的檢出率較低，甚至發現不了，這主要是與該細菌的檢出技術有一定的難度以及檢出程序過于復雜有關。
“麥康凱培養基”在醫學上是一種古老的、經典的，用于腸道細菌培養的最常用的培養基；但由于腸道細菌眾多，且大部分在“麥康凱培養基”上生長得又快又大，一些腸道細菌的菌落要比香港海鷗形菌大數十倍，甚至上百倍，故掩蓋了香港海鷗形菌的生長(該細菌菌落較小，且生長較緩慢)；所以，人們很難從長滿的細菌的培養皿上發現“小個子”的香港海鷗形菌。為此，根據香港海鷗形菌具有天然耐抗生素---頭孢哌酮的這一特點，在麥康凱培養基中加入濃度為16mg/L的頭孢哌酮，這樣使那些不需要看到的其他腸道細菌都被頭孢哌酮抑制了，而“小個子”的香港海鷗形菌就容易被肉眼發現了。
臨床上要鑒定一種細菌，往往要做數十種生化試驗。這就為我們開展香港海鷗形菌的檢出帶來復雜的程序以及造成試驗成本的提高，在數十種生化試驗中，氧化酶試驗、觸酶試驗以及三糖鐵試驗，這3種試驗是香港海鷗形菌所必備的；如前兩種生化試驗，氧化酶試驗、觸酶試驗，必須是都為陽性反應；而三糖鐵試驗的顏色觀察非常重要，如發現該樣本的細菌在三糖鐵試管內，經37℃、24小時培養后不會變色，即保持原來的顏色，或顏色變得更深，既是略變黃色，都不會是香港海鷗形菌。如果這3種生化實驗均符合要求，該細菌基本就是香港海鷗形菌。
基因診斷技術，由于已獲得了香港海鷗形菌菌株，為此，根據其DNA序列檢測數據，將其最保守的片段(最具診斷價值)設計為PCR引物。從而，大大提高了診斷的可靠性。從PCR診斷為陽性的香港海鷗形菌的標本中選擇10株細菌，送檢進行16S rRNA檢測驗證，結果PCR的診斷符合率為100％。
目前，只要符合上述3種生化試驗結果的細菌，送檢PCR實驗，均為香港海鷗形菌陽性；而PCR陽性的細菌，即可診斷為香港海鷗形菌。對香港海鷗形菌的檢驗程序進行充分優化，對細菌所要求鑒定的數十種生化實驗，選擇了這3種必備實驗，符合要求的細菌才做PCR，這樣大大節約了時間、人力、物力與資金。
本發明由于建立了一套香港海鷗形菌實驗診斷(表型診斷+基因診斷)方法，為香港海鷗形菌感染疾病的防治臨床治療提供依據，為香港海鷗形菌作為新的食源性病原菌的進一步深入研究提供實驗技術支持。同時具有簡便、實用、快速的檢驗優點，并節約了時間、人力、物力與資金。
圖1是本發明的簡易的檢驗流程圖。
具體實施例方式
用無菌棉簽取腹瀉病人甲的新鮮糞便，即插入Cary-Blair運送培養基試管內，送達實驗室進行劃線培養。來自人體的糞便標本接種在加入濃度為16mg/L頭孢哌酮的麥康凱培養基上，再放入溫度為37℃培養箱內，培養48小時后，取出培養皿，用肉眼尋找可疑菌落，香港海鷗形菌菌落在這種培養基上為無色、透明、扁平狀，直徑在0.5mm～1.0mm之間的微小菌落；挑選這些可疑菌落，進行純化培養后，再按以下步驟開展實驗先用常規的革蘭染色細菌檢驗步驟，檢驗結果為陰性短桿菌或弧菌，再進行以下試驗；其次經常規氧化酶試驗、觸酶試驗步驟，檢驗結果必須均為陽性后；再用常規接種在三糖鐵培養基試管內(三糖鐵培養基呈現為鮮紅色)，置于溫度為37℃培養箱內培養24小時后取出試管；用肉眼觀察試管內培養基的顏色變化，如保持原來的顏色或顏色變得更深，即符合香港海鷗形菌的生化試驗結果。凡符合上述實驗步驟結果的細菌，即采用PCR診斷技術診斷，PCR診斷結果呈陽性，即診斷為香港海鷗形菌。
用無菌棉簽取腹瀉病人乙的新鮮糞便，使用與腹瀉病人甲完全相同的檢驗方法，不同的只是在麥康凱培養基中加入濃度為15mg/L頭孢哌酮，同樣能診斷出香港海鷗形菌。
取新鮮活草魚腹部解剖，剪開中、后腸后用無菌棉簽取腸內糞便，使用與腹瀉病人甲完全相同的檢驗方法，不同的只是在麥康凱培養基中加入濃度為17mg/L頭孢哌酮，同樣能診斷出香港海鷗形菌。
取新鮮活鰱魚，使用與新鮮活草魚完全相同的檢驗方法，不同的只是在麥康凱培養基中加入濃度為15mg/L頭孢哌酮，同樣能診斷出香港海鷗形菌。
取新鮮活鱸魚，使用與新鮮活草魚完全相同的檢驗方法，不同的只是在麥康凱培養基中加入濃度為16mg/L頭孢哌酮，同樣能診斷出香港海鷗形菌。
從檢驗的效果看，在麥康凱培養基中加入濃度為16mg/L頭孢哌酮的效果最好，其附近濃度的效果逐步次之。
權利要求
1.一種香港海鷗形菌檢驗技術1)取糞便標本，接種在含有頭孢哌酮的麥康凱培養基上，放入溫度為37℃培養箱內培養48小時后取出；2)肉眼在其內挑選無色、透明、扁平狀，直徑在0.5mm～1.0mm之間的微小菌落進行純化培養；3)對培養的菌按以下步驟進行實驗用常規革蘭染色檢驗為陰性的短桿菌或弧菌→經常規氧化酶、觸酶試驗必須均為陽性后→再用常規接種在三糖鐵培養基試管內，置于溫度為37℃培養箱內培養24小時后取出試管；4)用肉眼觀察試管內鮮紅色培養基保持原來的顏色不變或顏色變得更深；5)凡符合實驗3)和4)結果的細菌，采用PCR診斷技術診斷，當PCR診斷結果呈陽性，即診斷為香港海鷗形菌。
2.根據權利要求1所述的香港海鷗形菌檢驗技術，其特征在于所述在麥康凱瓊脂中加入頭孢哌酮的濃度在15～17mg/L之間。
3.根據權利要求2所述的香港海鷗形菌檢驗技術，其特征在于所述濃度是16mg/L。
4.根據權利要求1所述的香港海鷗形菌檢驗技術，其特征在于所述PCR診斷香港海鷗形菌檢驗技術的由特異性引物對P2F5’TTGAGGGTGCCCGAAAGGGA3’，P2B5’CTACCCACTTCTGGCGGATT3’。
全文摘要
一種香港海鷗形菌檢驗技術，取糞便標本接種在含頭孢哌酮的麥康凱培養基上，放入37℃箱內培養48小時取出；挑無色透明、扁平狀，直徑在0.5～1.0mm之間的微小菌落進行純化培養；對培養菌按步驟實驗革蘭染色檢驗為陰性短桿菌或弧菌→氧化酶、觸酶試驗均為陽性→接種在三糖鐵培養基試管內，置37℃箱內培養24小時取出；鮮紅色培養基的顏色保持不變或變得更深；符合結果的細菌，用PCR診斷技術診斷，當PCR結果呈陽性，即診斷為香港海鷗形菌。本發明為香港海鷗形菌感染疾病的防治與臨床治療提供了依據，為該菌作為新的食源性病原菌的深入研究，提供實驗技術支持。具有簡便、實用、快速的檢驗優點，并節約了時間、人力、物力與資金。
文檔編號C12Q1/68GK101063164SQ20071006897
公開日2007年10月31日 申請日期2007年6月4日 優先權日2007年6月4日
發明者孫建榮, 項海青, 倪曉平, 任淑華, 李長春, 查捷, 孔慶鑫, 徐虹, 金慧, 俞驊 申請人:杭州市疾病預防控制中心, 杭州市第一人民醫院