一種新型煙葉發酵酶制劑生產方法

專利名稱：：一種新型煙葉發酵酶制劑生產方法一種新型煙葉發酵嗨制劑生產方法
技術領域：
煙葉自然發酵。技術背景在煙葉調制過程中，對經初烤和復烤后的煙葉在合適的溫度和濕度條件下進行充分的發酵是提高和改善煙葉品質極為重要的技術環節。因此，對發酵機理的研究多年來一直是國內外相關學者和巻煙生產商們關注的焦點。其中一個重要研究領域就是煙葉發酵的酶機理的闡釋和應用。早在1950年(Frankenburg，W.G.)就有學者提出了煙葉發酵由酶催化的理論框架。隨著研究的深入和積累，現在普遍認為煙葉本身所含的氧化還原酶類主導發酵作用，而且這種發酵過程是多種酶聯合作用的結果，從而促使底物向多種香氣物質成分的有效轉化。這些酶促反應過程主要包括以下幾個方面1、萜烯類化合物降解過程。類胡蘿卜素是煙葉中最重要的一類萜烯化合物，其是50多種煙葉特有香氣成分的前體；2、Mailard反應。該反應過程是還原糖和氨基酸經分子重排后生成56種雜環化合物一類黑素，類黑素的形成使煙葉表現陳煙香氣。盡管Mailard反應本身不是由酶催化的反應，但其底物一還原糖和氨基酸是酶促反應的產物。蛋白質在蛋白酶的作用下水解成氨基酸，淀粉和糖在水解酶的作用下水解生成葡萄糖、果糖等還原糖。因此，促進多糖和蛋白質的轉化將有利于Mailard反應的進行；3、葉綠素的降解反應。煙葉中殘存的葉綠素是巻煙制品在吸食過程中產生青雜氣的根源，應在調制過程中加以控制。盡管煙葉葉綠素絕大部分已經在煙葉烘烤過程中被降解，但殘存的葉綠素仍然會對巻煙制品帶來不良影響；4、游離煙堿降解，消除強烈刺激性和不良余味；5、酰胺與易分解氨氮化合物的脫氨揮發作用。煙葉氨氮化合物在發酵過程中脫去氨基生成有機酸和氨氣，有機酸積累與氨氣自然揮發可提高發酵效果。這五個方面是煙葉發酵過程中主要的酶促反應過程，其它還包括一些小分子物質的緩慢物理揮發過程及次要的煙葉內含物轉化反應。然而，煙葉在烘烤過程中的干燥脫水使煙葉內酶群絕大部分失活，因此不利于上述酶促反應的進行。基于這些認識，在煙葉發酵過程中添加專一性酶系或復合酶種促進煙葉發酵、加速煙葉內含物轉化已經成為增加煙葉香氣、加速發酵過程的一條途徑。張立昌報道了一種適合在打葉復烤時添加的酶制劑，對自然醇化和人工發酵煙葉的質量有明顯的改善作用。該酶制劑可明顯增加巻煙香氣，減輕青雜氣和刺激性，改善巻煙吸味品質。趙銘欽等利用4種具有生物活性的a-淀粉酶、蛋白酶等配制而成的煙草發酵增質劑進行煙葉發酵，試驗表明煙葉香氣質改善、香氣量增加、煙葉固有雜氣和刺激性減輕，煙葉內部的糖、氮、堿等主要化學成分及其比值趨于協調、平衡。在這些研究過程中所用的酶主要為糖化酶、纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶。阮祥穩等申請的中國專利CN200510042773.7公開了一種由多種外源生物酶(纖維素酶、蛋白酶、果膠酶、淀粉酶、糖化酶)及酵母粉組成的復合酶制劑，其特征在于多種生物酶及酵母粉按照特定的比例直接進行組配。專利CN03114578.7公開了由纖維素酶、蛋白酶、轉化酶、麥芽糖酶、溶菌酶組成的酶制劑。專利CN87101362.2公開了由纖維素酶、果膠酶、木質酶及蛋白酶的多種酶系的微生物復合酶。以上文獻和專利的一個共同特征是直接采用外源(微)生物酶經特定比例混合后直接進行手工操作施用，對如何保護酶活性及如何滿足巻煙企業批量生產的要求沒有進行描述。
發明內容本發明提出一種煙葉發酵酶制劑的制備及生產工藝。該酶制劑的復合酶群來自于新鮮煙葉，經組織勻漿、酶群純化、輔基置換分子修飾及蔗糖低聚物保護后得到由葡萄糖氧化酶、葉綠素氧化酶、類胡蘿卜素氧化酶、蛋白酶及煙堿降解酶五類酶組成的復合酶制劑。具體生產工藝如下(圖1):1、取鮮活煙葉或頂杈破碎細胞，測其體積，加緩沖液A(體積比V:VaM=l:9):2、丁'4°C，2600g離心20min,取上清液并測體積，緩慢加入(NH4)2S04(144g/L)至含25%(NH4〕2S04(W/V);3、4'C緩慢混合30min，4°C15000g離心40niin:4、取上清液并測體積，加入(NH4)2S04(390g/L)至含80%(NH4)2S04(，);5、緩慢混合2h或過夜，4'C15000g離心2h，收集沉淀，加緩沖液A至沉淀充分溶解；6、忒液按1:0.1體積比加入緩沖液B于4'C沉淀20min，S000g離心10min，獲上清，棄沉淀；7、等體積加入0.1%EDTA緩沖液(pH8.0),于1一5'C進行10—20min螯合，過濾棄沉淀8、上清液按1:0.001體積比先后加入0.3%Ca(N03)2'4H20和MgS04溶液，充分泡勻，于1一5'C冷室靜置8—12hr或過夜；9、按1:0.01體積比加入0.01。/。蔗糖低聚物溶液，于1—5'C靜置10—15hr;10、溶液樣品于-8'C干燥濃縮至原體積的1/8時停止，4'C解凍分裝。緩沖液A0.1MTris-HCL，pH7.7,0.1MPMSF緩沖液B0.1MTris-HCL,pH7.7，0.1%EDTA(W/W)成品酶制劑在施用前用水稀釋至0.4%，于打葉復烤前的二潤時均勻噴施，用量200ml/50kg煙葉。見圖2。酶制劑總蛋白含量與酶比活力測定酶制劑產品總蛋白含量采用菲林一酚測定法，定義為每100毫升酶制劑中的蛋白含暈(mg/100ml):五種酶的比活力采用分光光度法進行定量。酶比活力定義為每毫升酶制劑中酶的單位量(U/ml)。測定結果表l:表l酶制劑蛋白含量與酶比活力樣品總蛋白酴比活力(U/ml)編號(mg/l柳ml)葡萄糖氧化酶葉綠素氧化酶類胡蘿卜素氧化酶蛋白酶煙堿降解酶15.3121683822583168021924.8102982981963426018735.598463682104105815646.0158304202843872119254.61363037621135834176平均12354.4±2462.9368.8±44.3231.8±37.436310.6±3681.8186.0±23.1分子修飾與低聚物保護對酶活性的影響與現有煙葉發酵酶制劑相比，經分子修飾和低聚物保護的新型煙葉發酵酶制劑具有一定耐復烤線高溫特性，有效保護酶活性，極大改善酶制劑應用效果。為比較天然酶(不經Ca(N03)24H20和MgS04與0.01%蔗糖低聚物修飾和保護)與修飾酶活力特性，特進行如下試驗將酶制劑產品用緩沖液B稀釋9倍后精確量取lml,盛于1.5ml離心管，取lml發剪力吝中16步得到的天然酶群溶液，盛于1.5ml離心管，兩管同時于75'C水浴鍋中溫浴15min，相應的對照樣品置-2(TC冰箱，5次重復。測定比較不同酶種酶活，結果見表2。表2酶制劑修飾酶與天然酶熱穩定性對比<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>表2顯示，經輔基置換與蔗糖低聚物保護后可顯著提高酶群的熱穩定性，酶活損失均低于30%，具有滿足煙葉發酵工業化生產的需求。煙葉發酵酶制劑的特點與效果該技術工藝滿足了煙葉打葉復烤線的自動化要求，即酶群在二潤回濕的高溫條件下(75一8(TC)酶活性的保持，從而保證酶群在煙葉發酵過程中切實發揮催化作用，加快底物轉化。因此，該酶制劑可提高煙葉的可用性與安全性，增加煙葉純正天然煙香，縮短發酵周期，改善煙葉品質。與現有酶制劑相比，用本技術工藝生產的新型煙葉發酵酶制劑具有耐復烤線高溫特性、加快底物轉化、縮短自然發酵時間、提高煙葉品質的特點。具體表現如下1、耐高溫。即使經受80。C葉面溫度10—15min仍能保持酶活性；2、施用方便，滿足巻煙企業自動化的要求；3、安全性高。所有酶種都來自于新鮮煙葉，在吸食安全性上有絕對保障；4、降解煙葉殘存葉綠素，消除青雜氣；5、催化分解煙葉內部萜烯類化合物，為香氣物質的產生提供前體，達到增強煙葉天然香氣，發揮煙葉潛在品質；6、加速煙葉發酵的酸化過程。一般降低pH值一個單位；7、加快氨氮化合物脫氨揮發，降低煙葉總氮含量，減少刺激性，改善吃味；8、促進游離煙堿分解，提高煙葉食用安全性，協調化學組分；9、縮短自然發酵時間5—6倍。常規2—3年縮短為夏季100—150天，冬季150—200天。10、高回報率。每公斤煙葉施用量4m1(0.4。/。)，成本約合0.40元，一般提高煙葉等級一個級，按市場價值計算增值2.0元，利潤率為80%。實施方式(見圖3)1、選取玉溪紅塔地區有代表性的云85上部初烤煙葉B2F;2、按照酶制劑說明配制0.4%溶液，常溫條件下均勻噴施B2F煙樣，置溫度28'C，相對濕度65%下醇化；(A)3、模擬復烤工藝條件(75i5。C)，按1的方法處理煙樣，分別存放于28'C(B1)和38'C(B2)，相對濕度65%條件下進行醇化；4、60天后對(A)、(Bl)和(B2)煙樣進行專業評吸、吸煙機分析與常規化學分析；5、應用MATLAB統計分析軟件進行數據分析。感官評吸結果表明，(A)方法處理對煙葉品質有較明顯改善，表現為勁頭、刺激性減弱，香氣質、口感得到改善；(B)方法主要表現與(A)類似，對香韻、香氣質改善較明顯，刺激有所減弱。三種處理方法差別不明顯，說明該酶制劑能較好的保持高溫條件下的酶活性(表3、4、5)。表3酶制劑處理煙樣評吸結果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>吸煙機分析結果顯示煙氣總粒相物平均下降了8.4%，焦油量下降了降了28.0%,—氧化碳下降了1.6%，十分有利于巻煙產品降焦減害(表4)。.1%,煙氣煙堿量下表4吸煙機煙氣分析結果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>常規化學成分分析表明，煙堿下降9.3%，成分協調(表5)。總氮下降5.7%,蛋白質下降7.1%,煙葉的化學表5煙葉常規分析部分結果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>權利要求1.一種用于煙葉發酵的專用復合酶制劑，該酶制劑由葡萄糖氧化酶、葉綠素氧化酶、類胡蘿卜素氧化酶、蛋白酶及煙堿降解酶五類酶組成，其各組分的酶活比為葡萄糖氧化酶12354，葉綠素氧化酶368，類胡蘿卜素氧化酶231，蛋白酶36310，煙堿降解酶186；其制備方法如下選取新鮮煙葉，組織勻漿，酶群經兩次(NH4)2SO4分級沉淀純化后得到粗酶液；該粗酶液用含0.1％EDTA的緩沖液進行酶金屬離子螯合，螯合條件pH8.0，1-5℃，螯合時間10-20min；然后用0.3％Ca(NO3)2·4H2O和MgSO4進行離子置換，置換條件按粗酶液∶置換溶液1∶0.001體積比反應，1-5℃，置換時間8-12hr或過夜，完成酶分子修飾；經修飾的酶分子，于1-5℃條件下用0.01％蔗糖低聚物進行二次修飾保護，反應時間至少10hr以上；經過這樣處理，即可獲得所述的用于煙葉發酵的耐高溫專用復合酶制劑。2.權利要求1所述的復合酶制劑的生產方法，其特征在于該酶制劑由葡萄糖氧化酶、葉綠素氧化酶、類胡蘿卜素氧化酶、蛋白酶及煙堿降解酶五類酶組成，其各組分的酶活比為葡萄糖氧化酶12354，葉綠素氧化酶368，類胡蘿卜素氧化酶231，蛋白酶36310，煙堿降解酶186;其制備方法如下選取新鮮煙葉，組織勻漿，酶群經兩次(NH4)2S04分級沉淀純化后得到粗酶液;將該粗酶液用含0.iy。EDTA的緩沖液進行酶金屬離子螯合，螯合條件pH8.0，1一5。C,螯合時間10—20min;;然后用0.3%Ca(N03)2'4H20和MgS04進行離子置換，置換條件按粗酶液置換溶液1:0.001體積比反應，1一5'C，置換時間8一12hr或過夜，完成酶分子修飾；經修飾的酶分子，于1一5'C條件下用0.01%蔗糖低聚物進行二次修飾保護，反應時間至少10hr以上；經過這樣處理，即可獲得所述的用于煙葉發酵的耐高溫專用復合酶制劑。3.權利要求1所述復合酶制劑的使用方法是，成品酶制劑在用蒸餾水稀釋為0.4%后，在煙葉打葉復烤前進行二潤時均勻噴施，用量200ml/50kg煙葉。4.權利要求1所述復合酶制劑的用途，其特征是，將權利要求1所述復合酶制劑應用于煙葉發酵。全文摘要“一種新型煙葉發酵酶制劑生產方法”目的是解決煙葉自然發酵領域中如何改善煙葉發酵品質及實現煙葉發酵酶制劑活性保護技術問題。該酶制劑由葡萄糖氧化酶、葉綠素氧化酶、類胡蘿卜素氧化酶、蛋白酶及煙堿降解酶組成。新鮮煙葉經細胞破碎后，先用(NH₄)₂SO₄進行二次分級沉淀獲得粗酶液，酶分子采用Ca²⁺和Mg²⁺進行金屬離子置換，完成分子修飾；大分子結合修飾采用0.01％蔗糖低聚物完成，由此延長酶制劑的半衰期及顯著提高其耐高溫能力。該酶制劑施用的試驗結果表明，煙堿下降9.3％，總氮下降5.7％，蛋白質下降7.1％；煙氣總粒相物下降8.4％，焦油量下降5.1％，煙氣煙堿量下降28.0％，一氧化碳下降1.6％。該酶制劑在煙葉打葉復烤前的二潤時施用。文檔編號C12N9/02GK101254027SQ200710085338公開日2008年9月3日申請日期2007年3月1日優先權日2007年3月1日發明者何寶玉,陳應昆,偉韓申請人:韓偉;陳應昆;何寶玉