專利名稱：一種復合酶制劑的制備方法及其在飼料中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種用木霉菌株制備復合酶制劑的方法以及該復合酶制劑在飼料中的應用。
背景技術：
近年來，隨著我國人民的生活水平的不斷提高，我國的飼料業、養殖業得到迅速發展，飼料資源不足已經成為阻礙我國飼料エ業發展的ー個重要原因。特別是我國是ー個發展中的農業大國、人口大國，飼料的主要原料是植物性的餅柏和其他農副產品，由于植物細胞壁中含有大量的纖維素組成的微纖維，埋在木質素、半纖維素和果膠的連續相中，形成結構穩定且復雜的細胞壁結構。加工粉碎只能打碎部分細胞壁，還有相當多的植物細胞完整無損，營養物質包含在其中，難以被動物所消化吸收，以致飼料利用率低。
發明內容
本發明的目的是提供一種用木霉菌株制備復合酶制劑的方法以及該復合酶制劑在飼料中的應用。本發明選擇產纖維素酶活性較高的木霉菌株進行誘變選育、培養和發酵， 提取出酶制劑，然后將該酶制劑用于動物飼料中。本發明的飼用復合酶制劑有以下作用
I、能夠破解植物細胞壁，使營養物質更好地被吸收飼用復合酶中的纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶等的協同作用，能夠破壞細胞壁，使其中的營養物質釋放出來，增加動物對植物性飼料的利用率。2、補充內源酶不足，促進動物的消化吸收。加入飼用酶，可以通過外源酶的作用， 提聞詞料的消化率，從而促進動物的生長。3、消除抗營養因子纖維素是ー種纖維ニ糖的高聚體，較難溶解，對單胃動物的消化有阻礙作用。半纖維素和果膠溶于水后會產生粘性，不利于內源酶的擴散。飼用復合酶制劑中的外源酶的作用可以將阻礙動物消化吸收的物質降解，促進動物的消化吸收。本發明技術方案的具體步驟如下
I、木霉91一11 (分類名為康氏木霉WJP-02,拉丁文學名為Trichoderma Koningii WJP-02，保藏日期為2012年2月22日，保藏單位全稱是中國典型培養物保藏中心，簡稱是 CCTCC，保藏編號為CCTCC N0:M2012028)菌株的培育
(1)出發菌株的選擇取保存的產纖維素酶活性較高的里氏木霉菌株在相同條件下固態培養，測定產酶能力，選取出發菌株里氏木霉A3;
(2)誘變選育將在PDA培養基上培養4-5天的里氏木霉A3菌株孢子懸液置紫外燈下處理2分鐘；稀釋后與含LiCl的去氧膽酸鈉、經球磨12小時的2%纖維素粉瓊脂基混合，倒在I毫米的雙層平板的上層，雙層平板的下層是3毫米厚的Mand ' s營養液瓊脂層。30°C 避光培養3-4天，15°C下放置7天，挑取透明圈直徑與菌落直徑比值大的單菌落；
(3)將從雙層平板上挑取的40個優良菌株移入PDA斜面，30°C培養4-5天，取斜面一支，無菌水洗下，制成孢子懸液，將Iml孢子懸液接種于固體培養基中，30°C培養3-4天，加50 ml水30°C浸提I小時，過濾得發酵粗酶液，測定纖維素酶活力，得到10株高產菌株；
(4)再經固態培養復篩，進行單孢子分離和酶活測定，最終得到木霉91-11菌株。2、酶制劑的制備飼用復合酶制劑含有纖維素酶、半纖維素酶、淀粉酶、果膠酶、蛋白酶等多酶組分，以木霉91-11菌株、玉米秸桿和麩皮為主原料，經固態通風發酵、提取酒精而成。本エ藝采用硫酸銨鹽析、酒精沉淀兩種方法進行
(1)酶曲的制備木霉91-11菌株用PDA培養基進行斜面種子培養，將得到的斜面種子懸液接種至以秸桿和麩皮為基質的三角瓶中進行固態培養，得到酶曲；
(2)酶曲水浸提浸提槽中加入水和酶曲，常溫下間歇攪拌，浸提；
(3)離心分離將浸提得到的料液，用三足式離心機分批離心，分出纖維渣，離心稀酶液入儲te ；
(4)過濾凈化離心稀酶液泵入高位槽中，用管式過濾器進行過濾，得浄化的酶液；
(5)超濾濃縮浄化的酶液進行超濾濃縮，得超濾液；
(6)超濾液沉淀，得到酶泥；
(7)酶泥加輔料混勻后，45°C真空干燥至水分的重量含量在8.0%以下；
(8)粉碎、混合干燥的酶進行粗破碎后，在粉碎機中進行粉碎，過40目或60目篩，得到飼用復合酶制劑。根據上述酶制劑的制備方法，其中步驟(2)的浸提條件為酶曲與水之比為I :7 ； 控制浸提液的PH5. 0-5. 59，室溫下浸提I. 5小時；
根據上述酶制劑的制備方法，其中步驟(5)中超濾濃縮的具體條件為工作溫度為常溫、控制PH5. 0-5. 5，進液量與超濾水體積之比為4-6:1，系統壓カ控制在0. 1-0. 25MPa之間,濃縮4倍；
根據上述酶制劑的制備方法，其中步驟(6)中的沉淀方法優選硫酸銨鹽析沉淀或酒精沉淀；
硫酸銨鹽析的具體方法優選為超濾液泵入鹽析罐，開動攪拌，緩緩加入硫酸銨至飽和，加完后，繼續攪拌15分鐘，使硫酸銨充分溶解并與酶液混合均勻，常溫下靜置沉淀12 小時，濃縮液進行壓濾或離心得到酶泥；
酒精沉淀的具體方法優選為超濾液泵入酒精沉淀罐中，開動攪拌，加入預冷的重量比為95%酒精，加完后，繼續攪拌10分鐘，常溫下靜置沉淀，傾去上清液，離心分離或板框壓濾，收集濾液待回收，得酶泥；
本發明的有益效果是
1.纖維素酶組分較齊全，結晶纖維素也可分解；
2.酶活性比較穩定，在pH4.8，50°C攪拌缸中，穩定達48小時以上；
3.對化學抑制劑有一定的抗性；
4.91-11菌株產纖維素酶活性(FDA)較QM9414、Rut-C_30、⑶R-29都有大幅度的提
聞;
5.91-11菌株適合于固態發酵法生產，這種發酵法投資成本相對較低。6.發酵的原料為各種飼料原料，如，豆柏、麩皮、米糠等等。通過固體發酵得到的酶制劑，正是由各種飼料原料中的抗營養因子誘導得到，來源性決定了該類酶制劑在動物腸胃道內適應性強、作用效果明確。
7.發酵產物是含有主要酶種和多種輔助酶種的復合酶，而不是簡單的單酶復合物發酵所得到的酶制劑產品中，包括幾種主要酶種，如木聚糖酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶， 等等，同時，產品中含有多種低濃度輔酶，能增強主要酶種的作用。輔助酶種可切去主鏈上的分枝，也可與微生物的其他代謝因子(未知因子)，一起作用，協助酶與特定的物質結合， 這個過程是酶降解完整抗營養因子的關鍵一歩，協助水解飼料組分中廣泛存在的非淀粉多糖及其他抗營養因子。8.微生物在固體發酵的生長條件，接近它們在自然環境中的生長，因而更有能力生產出液體深層發酵不能生產的酶和代謝產物。9.酶蛋白屬于次級代謝產物，微生物的次級代謝產物通常是在微生物進行分化時形成的，液體培養抑制微生物分化，所以固體發酵單位的酶產量和種類，往往比液體發酵聞。10.固體發酵得到的自然組合的酶，才真正具有協同作用，能很好地降解各種飼料中不可消化的組分。11.固體發酵生產，復合酶的各種酶制劑之間具有“協同性”。12.添加復合酶，能夠通過提前淀粉和蛋白質的消化位點，從而提高動物日量的消化率，改善動物健康水平。13.添加復合酶，有明顯的能量效益。14.添加復合酶，酶解產生“生物活性寡糖”。15.添加復合酶，提高脂肪(油脂)的消化率。16.添加復合酶，能夠分解熱不敏感的大豆抗原蛋白、凝集素、胰蛋白酶抑制劑等抗營養因子。17.除“木聚糖酶、葡聚糖酶”以外，復合酶中均含有一定量的“纖維素酶”、“甘露聚糖酶”、“半乳糖苷酶”等等。
附圖I中是酶制劑提取的エ藝流程圖。本申請中的木霉91 一 11的分類名為康氏木霉WJP-02，拉丁文學名為Trichoderma Koningii WJP-02，保藏日期為2012年2月22日，保藏單位全稱是中國典型培養物保藏中心，簡稱是CCTCC，保藏編號為CCTCC N0:M2012028o
具體實施例下面結合具體實施例進ー步說明本發明。實施例I
木霉菌株91一11，全稱為康氏木霉WJP-02 (Trichoderma Koningii WJP-02),保藏號為CCTC N0:M2012028，選育方法如下
首先制備培養基以PDA為培養基在30°C下培養4-5天，然后固態培養以秸桿和麩皮為基質、250ml三角瓶裝料5g，加營養鹽15ml，0. IMPa滅菌30min，接種產纖維素菌株的孢子懸液(105-106 個/ml) lml，30°C培養 4 天。然后取保存的產纖維素酶活性較高里氏木霉菌株的菌株同條件下固態培養，測定產酶能力，選擇里氏木霉A3菌株為出發菌株。然后將在PDA培養基上培養4-5天的菌株孢子懸液以終濃度2 u g/ml的NIG溶液，pH6. 0，30°C預感處理30分鐘；置紫外燈下處理2分鐘；稀釋后與含LiCl (0. 2%)去氧膽酸鈉(0. 05%)，經球磨12小時的2%纖維素粉瓊脂基混合，倒在I毫米的雙層平板的上層，雙層平板的下層是3毫米厚的Mand , s營養液瓊脂層。 30°C避光培養3-4天，15°C下放置7天，挑取透明圈直徑與菌落直徑比值大的單菌落。將從雙層平板上挑取的40個優良菌株移入PDA斜面，30°C培養4-5天，取斜面一支無菌水洗下，制成孢子懸液，將Iml孢子懸液接種于固體培養基中，30°C培養3-4天，加50 ml水30°C 浸提I小時，過濾得發酵粗酶液，測定纖維素酶活力(FDA)，得到10株高產菌株。再經固態培養復篩，獲得一株產纖維素酶活力高，發酵周期短的菌株，對其進行單孢子分離和酶活測定，最終得到91一 11菌株。
實施例2
酶制劑的制備
主要設備浸提糟、離心機、超濾器、鹽析罐、貯罐、離心沉降機、輸、液泵、真空干燥器、粉碎機、混合器。實施例I中篩選出的木霉91 一 11菌株用PDA培養基進行斜面種子培養，將得到的斜面種子懸液接種至以秸桿和麩皮為基質的三角瓶中進行固態培養，得到酶曲；浸提槽定量的水，酶曲與水之比為I :7 ;浸提液pH5. 0-5. 59，室溫下間歇攪拌，浸提I. 5小吋。浸提的料液，用三足式離心機分批離心，分出纖維渣，稀酶液入儲罐。離心稀酶液泵入高位槽中，用管式過濾器進行過液，得浄化的酶液。浄化的酶液進行超濾濃縮。工作溫度為常溫、pH5. 0—5. 5，進液量與超濾水體積之比為4-6:1，根據超濾情況調整系統壓力，控制在
0.I一0.25MPa之間，濃縮4倍。超濾濃縮液泵入鹽析罐，開動攪拌，按所需硫酸銨飽和度緩緩加入粉狀硫酸銨，邊加邊攪拌，硫胺加完后，繼續攪拌15分鐘，使硫酸銨充分溶解并與酶液混合均勻，達到酶液中硫酸銨飽和度為70%，常溫下靜置沉淀12個小時，傾去上清液，濃縮液進行壓濾或離心。離心分離離心速度1450轉/分以上，離心時間30— 35分鐘。真空低溫干燥酶泥加輔料混勻后，裝盤入真空干燥器中進行低溫(45°C)干燥。酶中水重量含量在8.0%以下。干燥的酶進行粗破碎后，在粉碎機中進行粉碎，分別過40目或60目篩，摻入助劑，混合后即為飼用復合酶。提取收率浸提收率87%;濃縮收率85%;硫酸銨鹽析收率 95% ；尚心分尚收率95% ;干燥收率94%,提取總收率63%。
實施例3
酶制劑的制備實施例I中篩選出的木霉91 一 11菌株用PDA培養基進行斜面種子培養，將得到的斜面種子懸液接種至以秸桿和麩皮為基質的三角瓶中進行固態培養，得到酶曲；浸提槽定量的水，酶曲與水之比為I :7 ;浸提液PH5. 0-5. 59，室溫下間歇攪拌，浸提I. 5 小吋。浸提的料液，用三足式離心機分批離心，分出纖維渣，稀酶液入儲罐。離心稀酶液泵入高位槽中，用管式過濾器進行過液，得浄化的酶液。浄化的酶液進行超濾濃縮。工作溫度為常溫、pH5. 0-5. 5，進液量與超濾水體積之比為4-6:1，根據超濾情況調整系統壓力，控制在0. 1-0. 25MPa之間，濃縮4倍。超濾濃縮液泵入酒精沉淀罐中，酶液中酒精濃度為67%， 開動攪拌，按所需濃度流量加_15°C以下預冷的95%酒精，加完后，繼續攪拌10分鐘，常溫下靜置沉淀4-6小時，傾去上清液，離心分離。離心速度1450轉/分以上，離心時間30-35 分鐘。板框試壓、試漏一切正常后，壓入沉淀酶液，根據壓濾情況，調節壓力，控制在0. 5MPa 之內。收集濾液待回收，得酶泥。酶泥加輔料混勻后，裝盤入真空干燥器中進行低溫(45°C) 干燥。酶中水的重量含量在8.0%以下。干燥的酶進行粗破碎后，在粉碎機中進行粉碎，分別過40目或60目篩，摻入助劑，混合后即為飼用復合酶。提取收率浸提收率87%;濃縮收率85% ;酒精沉淀收率93% ;離心分離收率95% ;干燥收率91% ;提取總收率62%。
實施例4
兩組雞飼料，選用常規配方，其組成為以重量計玉米63%，豆餅18. 5%，麩皮5%，酵母4%，骨粉I. 5%，貝殼粉7. 5%，鹽0. 3%，多維素0. 03%,蛋氨酸0. 03%。但是在第一組雞飼料中添加了飼料總重量0. 1%的按以上步驟制作的復合酶，也就是說第二組為對照組。試驗雞為雛雞籠三級喂養，每籠10只雞，飼養人員手撒料，每天喂4次，并記錄投喂量。經過50天后
的飼養結果如下
權利要求
1.ー種飼用復合酶制劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1)酶曲的制備木霉91-11菌株用PDA培養基進行斜面種子培養，將得到的斜面種子懸液接種至以秸桿和麩皮為基質的三角瓶中進行固態培養，得到酶曲；(2)酶曲水浸提浸提槽中加入水和酶曲，常溫下間歇攪拌，浸提；(3)離心分離將浸提得到的料液，用三足式離心機分批離心，分出纖維渣，離心稀酶液入儲te ；(4)過濾凈化離心稀酶液泵入高位槽中，用管式過濾器進行過濾，得浄化的酶液；(5)超濾濃縮浄化的酶液進行超濾濃縮，得超濾液；(6)超濾液沉淀，得到酶泥；(7)酶泥加輔料混勻后，45°C真空干燥至水分的重量含量在8.0%以下；(8)粉碎、混合干燥的酶進行粗破碎后，在粉碎機中進行粉碎，過40目或60目篩，得到飼用復合酶制劑。
2.如權利要求I所述的方法，其特征在于步驟(6)中的沉淀方式為硫酸銨鹽析沉淀。
3.如權利要求I或2所述的方法，其特征在于步驟(6)的具體操作為將超濾液泵入鹽析罐，開動攪拌，緩緩加入硫酸銨至飽和，加完后，繼續攪拌15分鐘，使硫酸銨充分溶解并與酶液混合均勻，常溫下靜置沉淀12小時，去掉上清液，壓濾或離心得到酶泥。
4.如權利要求I所述的方法，其特征在于步驟(6)中的沉淀方式為酒精沉淀。
5.如權利要求I或4所述的方法，其特征在于步驟(6)的具體操作為將超濾液泵入酒精沉淀罐中，開動攪拌，加入預冷的重量比為95%酒精，加完后，繼續攪拌10分鐘，常溫下靜置沉淀，傾去上清液，離心分離或板框壓濾，收集濾液待回收，得酶泥。
6.根據權利要求I所述的制備方法制備的復合酶制劑在飼料中應用，其特征在于將該復合酶制劑混合在植物制成的飼料中。
7.一種制備如權利要求I所述的木霉91-11菌株的方法，其特征在于該方法包括以下步驟出發菌株的選擇取保存的產纖維素酶活性較高的里氏木霉菌株在相同條件下固態培養，測定產酶能力，選取里氏木霉A3為出發菌株；誘變選育將在PDA培養基上培養4-5天的里氏木霉A3菌株孢子懸液置紫外燈下處理 2分鐘；稀釋后與含LiCl的去氧膽酸鈉溶液、經球磨12小時的2%纖維素粉瓊脂基混合，倒在I毫米的雙層平板的上層，雙層平板的下層是3毫米厚的Mand , s營養液瓊脂層，30°C避光培養3-4天，15°C下放置7天，挑取透明圈直徑與菌落直徑比值大的單菌落；將從雙層平板上挑取的40個優良菌株移入PDA斜面，30°C培養4-5天，取斜面一支，無菌水洗下，制成孢子懸液，將Iml孢子懸液接種于固體培養基中，30°C培養3-4天，加50 ml 水30°C浸提I小時，過濾得發酵粗酶液，測定纖維素酶活力，得到10株高產菌株；再經固態培養復篩，進行單孢子分離和酶活測定，最終得到木霉91-11菌株。
8.利用如權利要求7所述的木霉91-11菌株制備酶的方法，其特征在于菌株在含有碳源和氮源的營養鹽溶液配成的培養基中生長產酶。
9.如權利要求8所述的方法，其特征在于所述碳源為花生秸、苞米秸、谷草和稗草粉中的ー種或多種。
10.如權利要求8或9所述的方法，其特征在于所述氮源為麩皮。
全文摘要
本發明涉及一種用木霉菌株制備復合酶制劑的方法以及該復合酶制劑在飼料中的應用。本發明選擇產纖維素酶活性較高的木霉菌株進行誘變選育、培養和發酵，提取出酶制劑，然后將該酶制劑用于動物飼料中，從而增加動物對飼料的利用率。
文檔編號C12R1/885GK102604918SQ20121008582
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月28日 優先權日2012年3月28日
發明者王健鵬 申請人:王健鵬