專利名稱：一種應用編碼多種外源基因的慢病毒載體制備分泌胰島素的干細胞系的方法
技術領域：
本發明涉及一種制備分泌胰島素的干細胞系的方法，尤其是涉及一種應用 編碼多種外源基因的慢病毒載體制備分泌胰島素的干細胞系的方法。
背景技術：
糖尿病是嚴重危害人類健康的主要疾病之一，已經成為繼心血管疾病和腫 瘤之后的第三大疾病。近年來，糖尿病的發病率不斷上升，而且發病更趨年輕
化。據文獻報道全世界的糖尿病患者已超過2.，3億，并且以每年200萬人的 速率增長。
我國的糖尿病患者已經超過4000萬，預計到2010年將達到6000萬人。糖
尿病病人由于產生胰島素障礙或胰島素不能發揮生理作用引起糖代謝紊亂導致 微血管病變，引起肢體壞死、失明和腎功能衰竭等一系列嚴重的并發癥。雖然 采用胰島素治療在一定程度上能夠改善病人的糖代謝紊亂，然而長期的胰島素 注射不僅在治療上給病人帶來不便，并且這種方法并不能有效地防止或逆轉糖 尿病引起的微血管病變及其并發癥。胰島移植是治療胰島素依賴型糖尿病的一 種有效方法，胰島移植不僅能夠糾正糖代謝紊亂，而且還能有效地防止或逆轉 糖尿病引起的微血管病變及其并發癥。但是，由于胰腺供體的缺乏，極大地限 制了胰島移植的臨床應用。干細胞具有自我增殖和分化成為各種組織細胞的潛 能。如果能夠將干細胞在體外大量擴增，并定向誘導分化成為胰島素分泌細胞， 就有可能成為胰島移植治療糖尿病的細胞資源。如何解決干細胞向胰島素分泌 細胞的定向誘導分化是干細胞治療糖尿病的關鍵技術。
胰腺轉錄因子在胰島P細胞生長和定向分化及胰腺發育過程中起重要作
用。當敲除轉錄因子PDX-1 (pancreatic and duodenal homeobox factor l)時，
則胰腺發育在胚胎的早期階段就停止；倘若破壞胰腺發育過程的下游轉錄因子 NeuroD(neurogenic differentiation factor, NeuroD )，貝U可以使胰島P細 胞形成受阻。轉錄因子MafA能特異地結合于胰島素啟動子元件RIPE3b并且激活 胰島素基因的表達，在P細胞功能維持和分化過程中是必要的調控因子。己有 研究證明將MafA、 PDX-l和NeuroD三種轉錄因子組合表達，可明顯增加肝臟胰 島素基因的表達，從而改善糖尿病小鼠的高血糖狀態。Barrow等證明，這三個轉 錄因子通過循環結合于胰島素基因啟動子相應區域而發揮促進胰島素基因轉錄 的作用(FEBS Letters 580 ，2006， 711-715)。而18-20周齡人胚胎胰腺干細 胞即有干細胞增殖旺盛的特性，又有發育成成熟胰島e細胞的潛能。胰島素基 因啟動子區域3個保守的增強子元件可以調控e細胞特異的胰島素基因表達，這 3個增強子區域E1、 A3和RIPE3b/Cl可分別與NeuroDl (neurogenic differentiation factor 1) 、 PDX-l (pancreatic肌d duodenal homeobox factor 1)禾口MafA(v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homologue A) 這3個轉錄因子結合，調控胰島素基因轉錄。胰腺的所有內分泌細胞均可以產生 NeuroDl，但PDX-l和MafA只在胰島e細胞產生。有文獻報道在PDX-1、 NeuroDl和 MafA可使胰島素啟動子活性增加1200倍。
以往同時轉染MafA、 NeuroDl和PDX-1三各胰島素調控基因所用的是腺病 毒，腺病毒載體不能實現細胞的穩定轉染。作為基因轉染的工具之一，慢病毒 (lentivirus)因其能將外源基因整合入非分裂細胞的基因組內，并且轉染效 率高，無明顯免疫反應而受到人們的青睞。而慢病毒特有的這種優勢可以克服 轉染的不穩定性，實現同時穩定轉染胰島素的三個關鍵調控基因，從而促進胰 島素的轉錄。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種應用編碼多種外源基因的慢病毒載體 制備分泌胰島素的干細胞系的方法。該方法選擇改造的是復制缺陷型慢病毒載
體pWPST;將多種胰島素調控基因克隆至該載體，轉染293T細胞進行包裝后， 收集病毒顆粒并濃縮后，轉染人胚胎胰腺干細胞；這種含有多種胰島素調控基 因的慢病毒載體在轉染干細胞后，可以使干細胞合成胰島素的能力大幅度提高， 并在葡萄糖的刺激時產生明顯的胰島素釋放。
為解決上述技術問題，本發明一種應用編碼多種外源基因的慢病毒載體制 備分泌胰島素的干細胞系的方法，包括如下步驟
1) 載體的構建
① 根據pWPTS-GFP的序列，用SalI和BamHl切除GFP后，用Klenow酶補 平載體的兩端，經堿性磷酸酶處理切除羥基，防止載體自身的環化；
② 分別將帶BstBl和Bgl II酶切位點的RSVneo質粒、帶有Xbal和Notl酶 切位點的MafA質粒、帶有EcoRl酶切位點的PDX-1質粒、帶有EcoRl和Xbal 酶切位點的NeuroDl質粒擴增后，用前述相應的限制性內切酶釋放出目的片段， 分別經Klenow酶補平后與pWPTS載體連接，獲得攜帶目的基因的慢病毒載體； 經前述限制性內切酶消化及DNA序列測定以證實克隆的目的基因序列正確，從 而證實重組構建慢病毒載體pWPTS-Neomycin、 pWPTS-MafA、 pWPTS-PDX-1和 pWPTS-NeuroDl成功；
2) 慢病毒的包裝
將慢病毒包裝質粒PMD2G和pPAX2分別轉入A DH5 a菌中進行擴增后， 用質粒提取純化試劑盒制備質粒；然后在培養的293T細胞接近1/4 1/3匯合 時，將制備好的4. 5 5. 5 p g包裝質粒pMD2G和12 17 u g的包裝質粒pPAX2 分別與載體質粒pWPTS-GFP、 pWPTS-Neomycin、 pWPTS-NeuroDl 、 pWPTS-PDX-1 和pWPTS-MafA各18 23 u g混合后，用含2. 5毫摩爾/升H印es的滅菌水做為 緩沖水調節到240 260ul，然后加入O. 5摩爾/升的CaCl2 250 yl，混和均勻， 以40 60u 1/秒的速度滴加到2XHeBS溶液中；然后以2500轉/分的速度振蕩 混合均勻前述各溶液，混合后得混合液，輕輕將混合液加到293T細胞表面，轉 染后在轉染后45 50小時和在轉染后65 75小時，分別收集含有不同病毒顆 粒的細胞上清液，將此上清液用直徑0.45um濾器過濾后，混合在一起進行濃 縮，得含有Neomycin、 MafA、 PDX-1和NeuroDl基因的病毒混合懸液，在0 4 "C的條件下保存備用；
3) 病毒滴度的測定
用含有GFP的病毒懸液轉染Hela細胞，經流式細胞儀檢測此含有GFP的病 毒滴度，間接反映含有Neomycin、 MafA、 PDX-1和NeuroDl基因的病毒滴度；
4) 轉染人胚胎胰腺干細胞
從人胚胎胰腺分離出胰腺干細胞，接種在6、 12或24孔的細胞培養板上， 待細胞長至60 85%匯合時,用第2步得到的含有Neomycin、 MafA、 PDX-1和 NeuroDl基因的病毒混合懸液共同轉染人胚胎胰腺干細胞；24 96小時后，培 養基換成含有G418的選擇性培養基，待細胞長滿進行傳代時，消化收集細胞， 并用含有G418的選擇培養基進行有限稀釋，以達到0. 5 1個細胞/孔的密度接 種96孔板，進行細胞克隆；將所得到的克隆擴增培養后，檢測各克隆細胞MafA、 PDX-1和NeuroDl的表達水平，將表達特點相同的克隆合并，最后得到三類、共 6種細胞第一類是只高表達一種基因的，即只整合了MafA、 PDX-1或NeuroDl 基因的細胞；第二類是高表達兩種基因的，包括同時整合了 MafA + PDX-l， MafA+NeuroDl或NeuroDl+PDX-l的細胞；第三類是同時高表達三種基因的，即
同時整合了 MafA+PDX-1+NeuroDl的細胞。進一步對這三類6種細胞表達的胰島 素水平進行分析，同時表達MafA、 PDX-1和NeuroDl三個基因的細胞中胰島素 的表達水平明顯上調。
所述HeBS溶液中含0. 28摩爾/升NaCl， 0. 05摩爾/升H印es， 1. 5毫摩爾
/升％3 (P04)。
本發明所構建的慢病毒載體具有以下優點
1. 載體構建方法簡單，實用性好在向載體上插入外源基因時，使用平端
連接，因此可以連接任意目的基因。
2. 轉染效率高利用慢病毒為載體，可以穩定轉染各種細胞，并且轉染效
率在80%以上。
3. 轉染后明顯提高胰島素表達水平由于在載體中含有編碼胰島素調控基
因的序列，因此，轉染后可以明顯增強胰島素表達。并且，根據需要，可以同 時向細胞轉染任意一種、二種或三種基因。
4. 篩選方法獨特轉染后使用細胞克隆方法篩選，可以得到表達一種、兩
種或同時表達三種外源基因的細胞株，并且這三類細胞株胰島素表達水平不同，
可以用于不同的需要。
圖1是慢病毒載體經限制性內切酶Sal I和BamHl酶切的結果，顯示釋放GFP。 各泳道分別為h Marker2， 3: pWPTS-GFP ;
圖2是含有目的基因的質粒經限制性酶切后釋放出的目的基因。各泳道分別為 1， 6: Marker, 2: NeuroDl， 3: PDX-1， 4: MafA， 5: Neomycin ;
圖3是RT-PCR鑒定轉染后細胞中外源基因的表達。各泳道分別為l: Marker,
2: Neomycin ， 3: PDX-1， 4: NeuroDl， 5: MafA， 6: Neomycin ;
圖4是RT-PCR分析轉染后表達不同外源基因的細胞中胰島素mRNA的表達水平。
各泳道分別為l:Marker， 2:NeuroD+.PDX-l+MafA細胞，3:PDX-l+MafA細胞，
4:PDX-l+NeuroDl細胞，5:NeuroDl+MafA細胞6:NeuroDl細胞 7:PDX-1
細胞8:MafA細胞。
具體實施例方式
一種應用編碼多種外源基因的慢病毒載體制備分泌胰島素的干細胞系的方
法，包括如下步驟
1) 編碼Neomycin、 MafA、 NeuroD和PDX-1基因的慢病毒載體的構建 首先將慢病毒載體質粒pWPTS-GFP用BamHl和Sal I酶進行雙酶切，釋放
出GFP后，回收載體pWPTS片段；然后將含有Neomycin、 MafA、 NeuroDl和PDX-1 基因的質粒，分別經BstBl和Bgl II 、 Xbal I和Not I 、 EcoR I和Xbal I 、 EcoR I限制型內切酶酶切后，用0.7%瓊脂糖凝膠電泳分析，回收目的基因片段；再 按照常規方法將每個目的基因分別連接到載體PWPTS片段中，構建成分別編碼 Neomycin、 MafA、 NeuroD和PDX-1基因的慢病毒載體；
2) 慢病毒顆粒的包裝
① 包裝質粒的擴增
將慢病毒包裝質粒pMD2G和pPAX2分別轉入￡ 6bh' DH5 a菌中進行擴增后， 用質粒提取純化試劑盒制備質粒。
② 轉染
轉染前20 30小時，用0.2。/。胰蛋白酶/EDTA分離293T細胞；每10cm培 養皿接種1百萬 3百萬293T細胞，在轉染前一天細胞接近1 / 4 1 / 3匯合時； 加入8 12ml D10完全培養基，所述D10完全培養基即:DMEM加入10X (v/v)
胎牛血清，100 U g/ml青霉素鈉，100 U g/ml鏈霉素鈉，0. 002mM/ml L-谷氨酰胺； 在轉染前1 3小時換D10完全培養基；
在轉染后10 15小時，按以下配方制備用于10cm培養皿的沉淀，混合 Envelope plasmid pMD2G 5 ti g
Packaging plasmid pPAX2 15 yg
Transfer vector pWPTS-GFP、 Neomycin、 NeuroDl、 PDX-1或MafA 20u g
用含2. 5毫摩爾/升H印es的滅菌水做為緩沖水調到250 u 1 ，加入250 u 1的 0.5摩爾/升CaCl2溶液進行混合；混合好后以30 70u 1/秒的速度加入到500 ul的2XHeBS中，以2000 3000轉/分的速度渦旋混勻；在25 37。C的條件 下靜置20 40分鐘；然后加入到單層細胞上；溫和地振動平皿，但不是搖動，
否則所有沉淀物都將聚在中心； 在轉染后20 30小時
檢査細胞，這時可以看見整個培養皿上很細微的、像沙子般的沉淀物；但 細胞上和細胞附近部位除外，其原因可能是細胞吸收CaP(VDNA沉淀物；然后溫 和地搖動培養皿，使培養基與沉淀物盡可能混合，吸棄含有沉淀物的培養基， 重新加入在37。C條件下已靜置20 40分鐘的10 15ml新鮮培養基；
在轉染后45 50小時
收集上清液，像前一天一樣換成新鮮的10 15ml培養基；將收集的上清液 以2000 3000轉/分鐘，在0 4。C的條件下離心8 12分鐘，然后用0.45um 濾器過濾，在0 4"C的條件下儲存；
在轉染后65 75小時
收集上清液，將收集的上清液以2000 3000轉/分鐘，在0 4。C的條件下 離心8 12分鐘，然后用0.45um濾器過濾，與在轉染后45 50小時收集的上
清混合；這時上清混合液包含接近106轉導單位(TU) /ml; ③濃縮和儲存
載體的濃縮將4 5ml的20% (w/v)蔗糖水溶液放入試管底部，并用過 濾的上清液添滿到頂部，以24000 28000轉/分鐘的速度，離心90分鐘，去除 被蔗糖轉化的上清液；顛倒試管使其干燥并用完全培養基重懸片狀沉淀物，可 用無血清培養基重懸片狀沉淀物；
3) FACS測定Hela細胞中慢病毒載體的滴度
第0—12小時
在6孔板上以50 100 X 107wel1密度接種Hela細胞，加入D10完全培養
基；
第24-30小時
將500ul、 50 ul、 5ul載體懸液分別放入3個獨立的孔中； 第48-60小時
去掉上清液，換成2ml新鮮的D10培養基； 第96-120小時
用2ml無l丐一鎂的磷酸鹽緩沖液(NaCl 137mM， KC1 2. 7mM， Na2HP047H20 4. 3mM， KH2P04 1. 4mM)沖洗細胞，用250 u 1胰酶/EDTA于37°C ， 1分鐘分離細 胞，加入250ul用無鈣一鎂的PBS配制的2X (w/v)甲醛，徹底重新懸起，GFP
的表達用流式細胞儀分析；
在一個典型的滴度實驗中，只有產生的1 20XGFP陽性的稀釋液才被考慮 滴度計算；在1%以下，FACS可能不足以準確可靠的確定GFP陽性細胞數；在 20%以上，每個GFP陽性耙細胞被轉導兩次的機會明顯增加，導致低估轉導顆 粒的數量； 一旦選擇了合適的稀釋度，應用下面的數學計算
Titer (Hela-transducing units/ml) = 100000 (target Hela cells) X (% of GFP-positive cells/100)/ volume of supernatant(in ml)
4) 人胚胎胰腺干細胞的轉染 人胚胎胰腺干細胞的分離和培養
無菌條件下取引產的20周齡以下人胚胎胰腺組織，剪碎后加入2 5ml的 0. 2%的膠原酶P，在37。C的條件下消化10 20分鐘后，振蕩，用10 30ml無 血清培養基終止消化，然后再用無血清培養基洗至少兩次，然后將細胞懸浮于 完全性干細胞培養基M199中；所述M199培養基含5% (V/V) FCS、 100ug/ml 的glucagon、 10ng/ml的LIF(Leukemia Inhibitory Factor) ， 100 p g/ml的青 霉素鈉和lOOu g/ml的鏈霉素鈉；將細胞接種于0. 1 0. 3%明膠包被的35mm培 養皿中，24 48小時后換培養液，120 — 170小時后傳至T25培養瓶中培養；
轉染
在6、 12或24孔培養板中以50 100 X107孔密度接種胚胎干細胞，加入 干細胞完全培養基M199， 24 48小時后，將4種含病毒包顆粒的懸液按照等比 例混合——每種0. 5ml加入孔中；24 48小時后將轉染的細胞用不含LIF的完 全培養基M199按照1: 4 6比例分種5個孔進行培養，48 96小時后加入含 150 300ng/ml的G418的選擇培養基進行篩選培養。
5) 轉染后陽性細胞的篩選
收集選擇性培養后的細胞，并用選擇培養基進行有限稀釋，以0.5 1個細 胞/孔的細胞密度接種96孔板，進行細胞克隆。擴增后的細胞克隆通過RT-PCR 檢查三種外源基因的表達水平，驗證該克隆中外源基因的種類和數目，同時檢 查克隆中胰島素mRNA的表達水平；結果獲得三類、共7種克隆細胞第一類是 只高表達一種轉染基因；第二類是高表達兩種轉染基因，包括MafA + PDX-l，MafA+NeuroDl或NeuroDl+PDX-1;第三類是同時高表達三種轉染基因，即 MafA+PDX-l+NeuroDl;對這三類7種細胞表達胰島素的mRNA表達進行分析，發 現同時表達MafA、 PDX-1和NeuroDl三個基因的干細胞胰島素mRNA的表達水平 最高，同時表達兩種轉染基因的干細胞次之，只轉染了一種轉染基因的干細胞 較低，但仍高于未轉染基因的干細胞。
顯然，本發明的上述實施例僅為清楚地說明本發明所作的舉例，而并非是 對本發明的實施方式的限定。對于所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明 的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實 施方式予以窮舉。凡屬于本發明的技術方案所引伸出的顯而易見的變化或變動 仍處于本發明的保護范圍之列。
權利要求
1、一種應用編碼多種外源基因的慢病毒載體制備分泌胰島素的干細胞系的方法，其特征在于，包括如下步驟1)載體的構建①根據pWPTS-GFP的序列，用Sal I和BamH1切除GFP后，用Klenow酶補平載體的兩端，經堿性磷酸酶處理切除羥基，防止載體自身的環化；②分別將帶BstB1和Bgl II酶切位點的RSVneo質粒、帶有Xba1和Not1酶切位點的MafA質粒、帶有EcoR1酶切位點的PDX-1質粒、帶有EcoR1和Xba1酶切位點的NeuroD1質粒擴增后，用前述相應的限制性內切酶釋放出目的片段，分別經Klenow酶補平后與pWPTS載體連接，獲得攜帶目的基因的慢病毒載體；經前述限制性內切酶消化及DNA序列測定以證實克隆的目的基因序列正確，從而證實重組構建慢病毒載體pWPTS-Neomycin、pWPTS-MafA、pWPTS-PDX-1和pWPTS-NeuroD1成功；2)慢病毒的包裝將慢病毒包裝質粒pMD2G和pPAX2分別轉入E.Coli DH5 α菌中進行擴增后，用質粒提取純化試劑盒制備質粒；然后在培養的293T細胞接近1/4～1/3匯合時，將制備好的4.5～5.5μg包裝質粒pMD2G和12～17μg的包裝質粒pPAX2分別與載體質粒pWPTS-GFP、pWPTS-Neomycin、pWPTS-NeuroD1、pWPTS-PDX-1和pWPTS-MafA各18～23μg混合后，用含2.5毫摩爾/升Hepes的滅菌水做為緩沖水調節到240～260μl，然后加入0.5摩爾/升的CaCl2 250μl，混和均勻，以40～60μl/秒的速度滴加到2×HeBS溶液中；然后以2500轉/分的速度振蕩混合均勻前述各溶液，混合后得混合液，輕輕將混合液加到293T細胞表面，轉染后在轉染后45～50小時和在轉染后65～75小時，分別收集含有不同病毒顆粒的細胞上清液，將此上清液用直徑0.45μm濾器過濾后，混合在一起進行濃縮，得含有Neomycin、MafA、PDX-1和NeuroD1基因的病毒混合懸液，在0～4℃的條件下保存備用；3)病毒滴度的測定用含有GFP的病毒懸液轉染Hela細胞，經流式細胞儀檢測此含有GFP的病毒滴度，間接反映含有Neomycin、MafA、PDX-1和NeuroD1基因的病毒滴度；4)轉染人胚胎胰腺干細胞從人胚胎胰腺分離出胰腺干細胞，接種在6、12或24孔的細胞培養板上，待細胞長至60～85％匯合時，用第2步得到的含有Neomycin、MafA、PDX-1和NeuroD1基因的病毒混合懸液共同轉染人胚胎胰腺干細胞；24～96小時后，培養基換成含有G418的選擇性培養基，待細胞長滿進行傳代時，消化收集細胞，并用含有G418的選擇培養基進行有限稀釋，以達到0.5～1個細胞/孔的密度接種96孔板，進行細胞克隆；將所得到的克隆擴增培養后，檢測各克隆細胞MafA、PDX-1和NeuroD1的表達水平，將表達特點相同的克隆合并，最后得到三類、共6種細胞第一類是只高表達一種基因的，即只整合了MafA、PDX-1或NeuroD1基因的細胞；第二類是高表達兩種基因的，包括同時整合了MafA+PDX-1，MafA+NeuroD1或NeuroD1+PDX-1的細胞；第三類是同時高表達三種基因的，即同時整合了MafA+PDX-1+NeuroD1的細胞；進一步對這三類6種細胞表達的胰島素水平進行分析，同時表達MafA、PDX-1和NeuroD1三個基因的細胞中胰島素的表達水平明顯上調。
全文摘要
一種應用編碼多種外源基因的慢病毒載體制備分泌胰島素的干細胞系的方法。該方法選擇改造的是復制缺陷型慢病毒載體pWPST；將多種胰島素調控基因克隆至該載體，轉染293T細胞進行包裝后，收集病毒顆粒并濃縮后，轉染人胚胎胰腺干細胞；本發明具有以下優點載體構建方法簡單，實用性好；轉染效率高；轉染后明顯提高胰島素表達水平；轉染后使用細胞克隆方法篩選，可以得到表達一種、兩種或同時表達三種外源基因的細胞株，并且這三類細胞株胰島素表達水平不同，可以用于不同的需要。
文檔編號C12N5/10GK101100677SQ20071010032
公開日2008年1月9日 申請日期2007年6月8日 優先權日2007年6月8日
發明者婁晉寧, 張文健, 門秀麗 申請人:中日友好醫院