專利名稱：一種重組抗fl單克隆抗體及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及抗體技術領域。具體地說，本發明涉及一種新的重組抗FL單克隆抗體，及其制備方法和用途。
背景技術：
Flt3 Ligand(fms-like tyrosine kinase 3)(FL)是一種有效的造血刺激因子，不論在體外還是體內，均可影響造血干祖細胞的增殖和分化。FL可以有效促進小鼠及人的DC(一種少量的具有誘導、調節免疫反應的抗原遞呈細胞)增殖，因此其作為研究工具及治療手段得到廣泛深入的研究。
造血系統的穩定是多能干細胞自我更新并分化為造血祖細胞的過程。這些前體細胞定向分化、成熟為不同譜系的分化終末細胞，循環于外周的血液。造血干細胞的增殖和分化受多種可溶性和膜結合型生長因子與細胞表面特異性受體結合的調節。細胞因子的受體可以分為兩群具有內源性酪氨酸激酶活性及不具有酪氨酸激酶活性。前者，也稱為酪氨酸激酶受體(TKR)，可與多種配體結合，調節造血。Flt3 ligand(FL)是最近證實的在體內外均可以有效促進造血干祖細胞增殖分化的因子。最近幾年，生長因子越來越多的用于血液及腫瘤等疾病的治療以及自體或同種異體骨髓移植前的動員。
FL可以影響多能造血干細胞、祖細胞以及淋巴系、髓系多種譜系細胞的生長。FL單獨對干、祖細胞的刺激增殖作用比較弱，但可以增加對其他生長因子的反應。已經證實FL與多種集落刺激因子、白細胞介素及可溶性血小板生成素具有協同作用，可促進定向和原始祖細胞的生長和集落形成。
在正常個體，血清FL水平通常很低(＜100pg/ml)，遠低于結構上相似的其它生長因子，如ckitL及CSF-1，后兩者在血清中的水平分別為2-6ng/ml及2-4ng/ml。血清中FL水平在一些特異性影響干細胞庫的造血功能異常的疾病會顯著改變(如Fanconi貧血，獲得性再障)，但在影響紅系的造血疾病則無變化(如地中海貧血或紅細胞發育不全)。獲得性再障或Fanconi貧血的患者，血清FL水平顯著提高(可達10ng/ml)，這可能是干細胞擴增需要而導致的代償反應。免疫抑制、輸血或骨髓移植治愈的患者，FL水平恢復正常。類似的，接受放療或化療的患者，血清FL則下降。在這樣的狀況下，血清FL水平可能增加以刺激顯著減少的HPC的產生。
FL是有效的造血生長因子，在造血干細胞的增殖、分化、維持及長期重建中發揮重要作用。其對淋巴細胞的增殖具有較強的作用，對髓系細胞作用較弱，對紅系細胞則無作用。FL對造血功能的調節具有不同的作用，與其它細胞因子聯合可產生協同或拮抗的效應。因為FL具有擴增DC、NK、T及B細胞的能力，因此還可以發揮免疫佐劑的作用。更為重要和有意義的是FL能夠在體內擴增DC。FL的性質使其可望成為腫瘤及感染性疾病生物/免疫治療的工具。FL還可成為用于研究的工具及移植的治療。我們期望不久的將來，FL能在這些領域發揮更有意義的影響。
在FL進行臨床前研究及臨床研究的過程中，以及將來成為藥物后患者應用的過程中，均需要檢測受試者(動物或人)或患者的血清FL濃度，在某些造血系統的惡性疾患中，FL可能會異常高表達，因此，在這類患者的診療過程中，也需要檢測患者血清中FL濃度。所以迫切需要一種靈敏度高，能快速、有效檢測FL類藥物及FL的產品。
發明內容
本發明的需要解決的技術問題之一是提供一種重組的抗FL單克隆抗體，該抗體用于體外檢測FL的濃度。
本發明需要解決的第二個技術問題是提供一種編碼上述抗FL單克隆抗體的DNA分子。
本發明需要解決的第三個技術問題是提供一種表達載體。
本發明需要解決的第四個技術問題是提供一種真核宿主細胞。
本發明需要解決的第五個技術問題是提供一種上述單克隆抗體的用途。
本發明需要解決的第六個技術問題是提供一種該單克隆抗體的制備方法。
為達到上述發明目的，本發明一方面提供了一種重組的抗FL抗體，該抗體含有重鏈可變區和輕鏈可變區，其特征在于，輕鏈可變區具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，重鏈可變區具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
本發明另一方面提供了編碼上述單克隆抗體的DNA分子。
在一個較佳的實例中，該DNA分子含有SEQ ID NO3所示的編碼所述單抗輕鏈可變區的核苷酸序列，以及SEQ ID NO4所示的編碼所述單抗重鏈可變區的核苷酸序列。
本發明第三方面提供了一種表達載體，該表達載體含有上述DNA序列以及與該序列操作性相連的表達調控序列。
本發明第四方面提供了一種宿主細胞，其特征在于，它被上述表達載體轉化。在一個較佳的實例中，該宿主細胞是CHO細胞。
本發明第五方而提供了一種抗FL單克隆抗體檢測FL濃度的的方法，其特征在于，所述的方法為常規的ELISA法。
本發明第六方面提供了一種制備上述單克隆抗體的方法，其特征在于，該方法包括a)提供一表達載體，該表達載體含有上述DNA序列以及與該序列操作性相連的表達調控序列；b)用步驟a)所述的表達載體轉化宿主細胞c)在適合所述單克隆抗體表達的條件下培養步驟b)所得的宿主細胞；和d)分離純化獲得所述單克隆抗體。
本發明的優點在于本發明的單克隆抗體能在FL類藥物進行臨床前研究及臨床研究的過程中，以及將來成為藥物后患者應用的過程中，快速檢測受試者(動物或人)或患者的血清中FL的濃度；同時在某些造血系統的惡性疾患中，異常高表達FL，本發明提供的單克隆抗體在這類患者的診療過程中，也能快速檢測患者血清中FL濃度。本發明抗體用ELISA法檢測FL特異性強、靈敏度高，優于市售抗體。
圖1載體pMG18，并且標明了其中的元件及酶切位點，其中，hCMV pro為人巨細胞病毒主要早期啟動子；Ck為人κ輕鏈恒定區基因；IgG1恒定區為人γ1重鏈恒定區基因；pA為多聚腺苷化信號；DHFR為二氫葉酸還原酶基因；AmpR為氨芐青霉素抗性基因。
圖2本發明所構建的pM載體，其中，Ck仍為人κ鏈(輕鏈)恒定區基因，IgG1 constant為小鼠γ1重鏈恒定區基因。
圖3本發明所構建的pM(H+L)載體，含有重組抗FL抗體重鏈全長和輕鏈全長基因。
圖4本發明抗FL單克隆抗體與市售抗體分別用于檢測FL的靈敏度比較結果(■為本發明的單克隆抗體，○為市售抗體)。
具體實施例方式
本發明涉及一種重組的抗FL抗體，該抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其特征在于，輕鏈可變區具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，重鏈可變區具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
單克隆抗體可用本領域技術人員熟知的各種方法來制得。例如，單克隆抗體可用雜交瘤方法(由Kohler等，Nature，256495(1975)首先提出)制得，或用重組DNA方法(美國專利No.4,816,567)制得。單克隆抗體也可用例如Clackson等，Nature，3 52624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.，222581-597(1991)所述的技術從噬菌體抗體庫中分離獲得。
本發明還提供了編碼本發明重組抗FL單克隆抗體的DNA分子。在一個較佳的實例中，該DNA分子含有SEQ ID NO3所示的編碼所述單抗輕鏈可變區的核苷酸序列，以及SEQ ID NO4所示的編碼所述單抗重鏈可變區的核苷酸序列。
在獲得編碼本發明重組抗FL單克隆抗體重鏈可變區和輕鏈可變區的核苷酸序列后，通常可通過以下方法來制備本發明的單克隆抗體。
首先，提供含有編碼本發明單克隆抗體的核苷酸序列以及與該序列操作性相連的表達調控序列的表達載體。
編碼本發明單克隆抗體的DNA序列可用本領域技術人員熟知的常規手段來制得。例如，可根據本發明公開的序列人工合成或用PCR法擴增得到編碼該單克隆抗體重鏈可變區和輕鏈可變區的核苷酸序列。然后，用本領域熟知的各種方法通過選擇合適的酶切位點將這些核苷酸序列插入合適的表達載體中，使它們分別在表達載體所攜帶的重鏈恒定區編碼序列和輕鏈恒定區編碼序列之前，并使它們在同一閱讀框內。
本發明中所用的表達載體是本領域技術人員已知的各種市售的表達載體，例如購自Qiagen和Promega公司的表達載體，以及可購得的表達載體pMG 18(《根據INCP-9質粒序列進行環境監測的工具的開發》(DEVELOPMENT OFTOOLS FORENVIRONMENTAL MONITORING BASED ON INCP-9PLASMIDS SEQUENCES)，A.Created，R.Krasowiak，M.Titok，C.M.ThomasSchool of Biological Sciences，University of Birmingham，Edgbaston，Birmingham B15 2TT，UK and Faculty of Biology，Dept of Microbiology，Belarus State UniversityScoring Av.4，Minsk 220080 Belarus)。
隨后，用上述獲得的表達載體轉化合適的宿主細胞。“宿主細胞”一般包括原核細胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞，昆蟲細胞和哺乳動物細胞。在本發明中，較佳的宿主細胞是CHO細胞。用表達載體轉化宿主細胞的方法有很多種，所用的轉化程序取決于待轉化的宿主。將異源多核苷酸導入哺乳動物細胞中的力一法是本領域所知的，其包括葡聚糖介導的轉染、磷酸鈣沉淀、Polybrene(1，5-二甲基-1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物)介導轉染、原生質體融合、電穿孔、脂質體介導轉染以及將DNA直接顯微注射到胞核中。在本發明中，較佳的方法是電穿孔法或脂質體介導法等，例如可采用Invitrogen公司的脂質體法試劑盒來轉染CHO細胞。
然后，在適合本發明單克隆抗體表達的條件下，培養轉化所得的宿主細胞，然后用常規的免疫球蛋白純化步驟，如蛋白A-Sepharose羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析、離子交換層析、疏水層析、分子篩層析或親和層析等本領域技術人員熟知的常規分離純化手段純化得到本發明的重組抗FL單克隆抗體。
所得單克隆抗體可用常規手段來鑒定。單克隆抗體的結合特異性可用免疫沉淀或體外結合試驗(如放射性免疫測定(RIA)或酶聯免疫吸附測定(ELISA))來測定。單克隆抗體的結合親和力例如可用Munson等，Anal.Biochem.，107220(1980)的Scatchard分析來測定。
下面將結合實施例進一步詳細地描述本發明。然而應當理解，列舉這些實施例只是為了起說明作用，而并不是用來限制本發明。
盡管本發明描述了以下具體的例子，但是有一點對于本領域技術人員來說是明顯的，即在不脫離本發明的精神和范圍的前提下可對本發明作各種變化和改動。因此，所附權利要求覆蓋了所有這些在本發明范圍內的變動。
實施例中未標明來源的均為市售。
實施例1從抗體庫中篩選FL的抗體基因可變區1)鼠源抗體庫的構建Flt3 Ligand(購自R&D System)與弗氏佐劑免疫Balb/C小鼠，免疫4次后，小鼠血清1∶500稀釋后與FL顯強陽性反應，取免疫后小鼠脾臟，按照Marks等人J.Mol.Biol.，222，581-597.Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227，381-388.Haidaris CG等人J Immunol Methods.2001 Nov 1；257(1-2)185-202，Griffiths，A.D.等人EMBO J.，13，3245-3260(1994).Nissim，A.等人EMBO J.，13，692-698(1994)中描述的方法，構建鼠源抗體庫。
2)篩選將復蘇的抗體庫菌株1毫升加入新鮮LB培養基14毫升，于50毫升三角瓶中37℃培養16小時。
12000rpm高速離心10分鐘，將上清液轉移至無菌的50毫升離心管中，保存備用。確保其滴度應在2×1011以上。Flt3 Ligand作為抗原，用常規方法包被25毫升細胞培養瓶。包被后的細胞瓶中加入不少于3×1010噬菌體，37℃溫育1小時。倒掉瓶中的液體，用10毫升加入了1％Tween-20的PBS洗滌培養瓶10次。在培養瓶中加入1毫升對數期的TG1細胞，37℃溫育震蕩培養16小時。
重復上段所述步驟4次。
將上述獲得的細胞稀釋至105細胞/毫升后在加有0.1氨芐青霉素的1.5％瓊脂平板上培養，獲得單克隆。
取上述平板上的克隆在96孔深孔板上進行培養，每孔一個克隆，共作960個克隆(10塊96孔板)。
將上述深孔板在96孔板離心機上5000RPM離心20分鐘后，將上清轉移到新的無菌深孔板，封口后保藏于4度備用。
取96孔板10塊，每孔中加入FL(10微克/毫升)10微升常規包被后，分別加入上述保存的上清10微升，37℃溫育1小時后用含有1％Tween-20的PBS洗滌20次。加入1微升HRP標記的羊抗M13單抗(購自Pharmacia公司)，37℃溫育30分鐘后用1％Tween-20的PBS洗滌10次。
加入含有0.025％DAB顯色劑的PBS 200微升和1微升1％的H2O2，37℃溫育顯色20分鐘后在讀板機上讀取595納米處的光吸收。
根據光吸收讀數確定顯色反應強的孔，這些孔相對應的克隆即為親和力較強的抗體可變區克隆。本試驗結果共篩選出316個陽性克隆，根據其讀數確定其中5個親和力最強的克隆，用于下一步的研究。
3)抗體可變區編碼序列向表達載體的克隆使上述5個克隆的菌株在100毫升LB培養基中擴增，然后按照生產商說明書用Promega公司的質粒DNA抽提純化試劑盒(WizardPlus SV Minipreps DNAPurification System)純化質粒DNA。
用XbaI和NheI限制性酶酶切上述質粒DNA后在1.5％瓊脂糖凝膠電泳上分離酶切片段，取417bp左右的帶進行膠回收，所得片段即為重鏈可變區。PCR擴增后，進行序列測定。用XbaI和BsiWI限制性酶酶切上述質粒DNA后在1.5％瓊脂糖凝膠電泳上分離酶切片段，取321bp左右的帶進行膠回收，所得片段即為輕鏈可變區。PCR擴增后，進行序列測定。確定正確序列后，化學合成法合成輕鏈全長序列，5’端設計HindIII酶切位點，恒定區為小鼠κ輕鏈恒定區序列，3’端設計EcoRI酶切位點。
PCR法自小鼠脾細胞擴增IgG1重鏈恒定區序列，并將CH1起始氨基酸突變為Ala-Ser，同時含有了NheI酶切位點，3’端設計BamHI酶切位點，擴增后測序驗證無誤后，NheI和BamHI雙酶切小鼠IgG1恒定區片段和pMG18，將小鼠IgG1恒定區連入pMG18，構建的新載體命名為pM。
用XbaI和NheI限制性酶酶切表達載體pM。該表達載體的酶切圖譜如圖2所示。然后將上述重鏈可變區插入該表達載體的XbaI/NheI位點中。同樣，利用HindIII和EcoRI限制性酶將抗體輕鏈全長cDNA插入到pM載體的HindIII/EcoRI位點中，從而構建得到含有重組抗FL抗體重鏈全長和輕鏈全長基因的表達載體pM(H+L)，如圖3所示。
4)CHO細胞的轉染與重組克隆的篩選上述構建的帶有抗體基因的表達載體分別轉化大腸桿菌DH5α菌株中接種于100毫升LB培養基中進行擴增，用Qiagen公司的超純質粒DNA純化試劑盒(Ultrapure Plasmid DNA Purification Kit)抽提純化質粒DNA。采用Invitrogen公司的脂質體法試劑盒(lipofectamine 2000 transfection reagent，11668-027)，將上述純化的質粒DNA轉染CHO細胞，操作參照廠家的說明書進行。
轉化的CHO細胞在MTX選擇培養基上進行連續9周的選擇，最后在96孔板上進行極限稀釋培養，連續進行3次，進行單克隆化。
挑出的單克隆細胞系在RPMI 1640培養基上進行培養，對上清進行Western印跡試驗，根據染色反應判斷表達強度，挑選出12個表達強的克隆作為候選細胞株。
5)單克隆抗體的純化用Protein A親和層析柱從細胞培養上清中直接分離純化出上述單克隆抗體，經SDA-PAGE電泳證明，所得產物純度大于90％。親和層析的產物再次經過分子篩層析，獲得了純度＞98％的樣品。將這些樣品用于以下的進一步分析與研究中。
實施例2抗體基因在CHO細胞中的表達強度將上述篩選得到的12個高表達候選克隆培養于10cm的組織培養皿中，如下所述用ELISA法測定抗體的表達量。將羊抗鼠IgG(Fc)包被于ELISA板，4℃過夜，經2％BSA于37℃封閉2小時，加入待測的培養上清和標準品(鼠IgG1)，37℃孵育2小時，加入HRP一羊抗鼠IgG(κ)進行結合反應，37℃孵育1小時，加入TMB于37℃作用10分鐘，最后用H2SO4終止反應，測A450值。下表1中顯示了上述篩選獲得的12個候選克隆的表達量。
表1候選克隆在CHO細胞中的表達量
從上表1可以看出，8H5，9F4和9A2具有很高的表達水平。
實施例3抗FL單克隆抗體基因的DNA測序根據系譜，對上述獲得的8H5細胞株的抗FL抗體基因進行DNA測序。結果如下SEQ ID NO3顯示了其輕鏈可變區基因序列(5′到3′)321bp其推測的氨基酸序列顯示在SEQ ID NO1中；SEQ ID NO3顯示了8H5重鏈可變區基因序列((5′到3′)417bp)，其推測的氨基酸序列顯示在SEQ ID NO2中。
實施例4單克隆抗體親和力研究按以下方法對各克隆的細胞培養液進行純化10000rpm離心除去細胞和細胞碎片，100kD截留分子量的濾膜超濾濃縮至1/10體積，超濾緩沖液是100mMTris-HCl，pH7.5。過SPA-sepharose親和層析柱，上樣液為100mM Tris-HCl，pH7.5，洗脫液為20mM檸檬酸，pH3.0，100mM NaCl。分子篩(Sephadex G200)層析，洗脫液為100mM Tris-HCl，pH7.5，得純品。
親和力測定采用Scatchard分析法(Munson等人，1980，Anal.BioChem.，107220)進行。結果表明，8H5，9F4和9A2三種單抗的親和力分別達到6.32×10-10，1.78×10-9和8.2×10-8。
實施例5抗FL單克隆抗體的對FL的檢測試驗以及與市售抗體的比較
1.試劑和材料1.1Flt3 Ligand(R&D，308-FK/CF)。
1.2本發明抗FL單抗構建的工程細胞(8H5)經無血清發酵，proteinA親和層析純化獲得。
1.3市售抗FL單抗，R&D，MAB308。
1.4羊抗人FL多克隆抗體(R&D，AF-308-NA)。
1.5驢抗羊IgG(H+L)多抗，HRP標記，Immuclub Lab.SA0060。
1.6HRP顯色底物TMB，上海科華公司，分A液及B液，臨用前，兩者等體積混合。
1.7終止液0.5mol/L硫酸。
1.8 pH＝7.2的PBS稱取KH2PO40.21g，NaCl 9.0g，Na2HPO4.12H2O 0.97g，加注射用水溶解至1000ml。
1.9包被緩沖液20mmol/l pH＝9.6的碳酸鈉緩沖液。
1.10封閉緩沖液稱取3g牛血清白蛋白，加入pH7.2的PBS溶解至100ml。
1.11洗滌緩沖液取1ml Tween20，加入PBS至1升。
2.方法夾心ELISA法2.1本發明重組抗FL單抗或市售單抗稀釋于包被緩沖液中，濃度1.0μg/ml，包被96孔酶標板，0.1ml/well，37℃ 2h。
2.2洗滌洗滌緩沖液洗滌2遍，每次均在吸水紙上拍干。
2.3封閉封閉緩沖液加滿孔后37℃ 2h。
2.4洗滌洗滌緩沖液洗滌3遍，每次均在吸水紙上拍干。
2.5加抗原加入用封閉緩沖液稀釋至50，25，12.5，6.25，3.125(ng/mL)的Flt3 Ligand，0.1ml/well，設2復孔。
2.6 37℃ 2h。
2.7洗滌洗滌緩沖液洗滌5遍，每次均在吸水紙上拍干。
2.8加入羊抗人Flt3 Ligand多抗PBS 1∶1000稀釋，37℃ 1h。
2.9洗滌洗滌緩沖液洗滌5遍，每次均在吸水紙上拍干。
2.10加入HRP標記的驢抗羊抗體，PBS 1∶2000稀釋，37℃ 1h。
2.11洗滌洗滌緩沖液洗滌5遍，每次均在吸水紙上拍干。
2.12顯色加顯色底物100μL/孔，避光顯色5～20min(顯色時間視顯色情況而定)，加終止液50μL/孔。
2.13酶標儀讀數測量450nm光吸收，以630nm為參考波長。
2.14用標準品濃度(對數)與A450/630nm值做直線回歸方程。
本發明抗體用該法檢測Flt3 Ligand靈敏度高，可以達到3ng/mL，特異性強，而市售同類抗體檢測Flt3 Ligand靈敏度只有30ng/ml。本發明抗體的靈敏度為市售抗體的10倍，如圖4所示。
從以上結果可以看出，本發明抗體與市售抗體比較具有特異性強、親和力高的優點，作為檢測抗體，靈敏度高于市售抗體，因此，本發明抗體可以替代市售抗體用于制備檢測FL濃度的試劑。
此外，市售的檢測試劑盒通常是利用ELISA雙抗體夾心法原理，預先將抗體包被于試劑盒中，用于檢測相應的抗原物質，這種方法更加簡便、快速。因此，本發明抗體也可以替代現有檢測試劑盒中的包被抗體，用于制備檢測FL濃度的試劑盒。
序列表<110>上海中信國健藥業有限公司<120>一種重組抗FL單克隆抗體及其制備方法和用途<150>CN200610026637.3<151>2006-05-17<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>107<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)...(107)<223>輕鏈可變區氨基酸序列<400>1Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Asn Gly Ser Gln Thr Leu Glu Ser Asn20 25 30Ala Gly Cys Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Thr Leu Ile35 40 45Tyr Ser Gln Ser Leu Arg Cys Ser Gly Leu Pro Asp Arg Phe Thr Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ile Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser65 70 75 80Glu Asp Leu Ala Lys Tyr Phe Cys Pro His Phe Lys Met Leu Arg Leu85 90 95Lys Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105<210>2<211>139<212>PRT
<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)...(139)<223>重鏈可變區氨基酸序列<400>2Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Met Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Asn Tyr20 25 30Trp Thr Tyr Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Gln Ile Pro Met Lys Pro Asp His Asp Ala Ser Asn His Ala Lys50 55 60Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser65 70 75 80Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Glu Asn Gly Ile Tyr85 90 95Tyr Cys Thr Gly Ser Gly Asn Pro Ile Asp Asn Cys Gly His Gly Thr100 105 110Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Thr Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro115 120 125Leu Val Pro Gly Cys Ser Asp Thr Ser Gly Ser130 135<210>3<211>321<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)...(321)<223>輕鏈可變區核苷酸序列<400>3gacattgtgc tgacccagtc tcaaaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60gtcacctgca acggcagtca gactttggaa agtaatgcag gctgctatca acagaaacca120ggtcaatctc ctaaaacact gatttactcg caatccttgc ggtgtagtgg actccctgat180cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcattctca ccatcagcaa tgtgcagtct240
gaagacttgg caaaatattt ctgtccgcac tttaagatgt tacgcttaaa gttcggaggg300gggaccaagc tggaaattaa a 321<210>4<211>417<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)...(417)<223>重鏈可變區核苷酸序列<400>4gaagtgaagc ttgaggagtc tggaggaggc ttggtgcatc ctggaggatc catgagactc 60tcctgtgttg cctctggact cactttcagt aactactgga cgtactgggt ccgccagtct120ccagagaagg ggcttgagtg ggttgctgaa attccaatga aacctgatca tgatgcatca180aatcatgcga agactgtgaa agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaagtagt240gtctacctgc aaatgaataa cttaagagct gaagaaaatg gcatttatta ctgtaccggg300tccggcaatc ctatcgacaa ctgcggtcac ggaacctcag tcaccgtctc ttcagctaca360acaacagccc catctgtcta ccccttggtc cctggctgca gtgacacatc tggatcc 41權利要求
1.一種重組抗FL單克隆抗體，它包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其特征在于，輕鏈可變區具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，重鏈可變區具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
2.一種DNA分子，其特征在于，它編碼權利要求1所述的單克隆抗體。
3.權利要求2所述的DNA分子，其特征在于，該DNA分子含有SEQ ID NO3所示的編碼所述單抗輕鏈可變區的核苷酸序列，以及SEQ ID NO4所示的編碼所述單抗重鏈可變區的核苷酸序列。
4.一種表達載體，其特征在于，它含有權利要求2所述的DNA序列以及與該序列操作性相連的表達調控序列。
5.一種真核宿主細胞，其特征在于，它被權利要求4所述的表達載體轉化。
6.權利要求5所述的真核宿主細胞，其特征在于，它是CHO細胞。
7.一種利用權利要求1所述的抗體檢測FL濃度的方法，其特征在于，所述的方法為ELISA法。
8.一種制備權利要求1所述的單克隆抗體的方法，其特征在于，該方法包括a)提供一表達載體，該表達載體含有權利要求2所述的DNA序列以及與該序列操作性相連的表達調控序列；b)用步驟a)所述的表達載體轉化真核宿主細胞；c)在適合所述單克隆抗體表達的條件下培養步驟b)所得的真核宿主細胞；和d)分離純化獲得所述單克隆抗體。
9.權利要求1所述的單克隆抗體在制備檢測FL濃度的試劑中的應用。
10.權利要求1所述的單克隆抗體在制備檢測FL濃度的試劑盒中的應用。
全文摘要
本發明提供了一種重組抗FL單克隆抗體，輕鏈可變區具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，重鏈可變區具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。本發明還公開了編碼該抗體的DNA分子，表達該抗體的載體以及被該表達載體轉化的真核宿主細胞。本發明提供的抗FL單克隆抗體能在FL類藥物過程中快速檢測受試者血清中FL的濃度，同時也能快速檢測患有某些惡性疾患的患者血清中FL濃度。
文檔編號C12N15/85GK101074262SQ20071010148
公開日2007年11月21日 申請日期2007年4月23日 優先權日2006年5月17日
發明者郭亞軍, 候盛, 王皓, 倪華, 陶靜 申請人:上海中信國健藥業有限公司