磁性細胞及其使用方法

專利名稱：磁性細胞及其使用方法
技術領域：
本發明涉及在醫療、尤其是再生醫療中有效使用的磁性細胞及其使 用方法。
背景技術：
一般而言，在給藥后藥物分布于全身，因此，對于以抗癌藥為首的:. 副作用較強的藥物，希望其以高濃度存在于作用部位，而不分布于其它 部位。為了使藥物集中于局部，已嘗試了各種方法，其中之一為使用磁 性粒子，通過外部的磁力使藥物集中于局部的方法。例如，將磁性體與 藥物一同包含在脂質體內給藥，并通過磁力向局部誘導，從而能夠提高
藥物的局部濃度。(例如參照日本口腔外科學會志1997年2月號p55 -、 61)。
另外，已知有將由磁鐵礦等鐵磁體和高分子形成的磁珠表面以抗體 修飾、利用抗原抗體反應進行細胞分離形成的技術，該技術用于HLA 的定型、造血干細胞的選擇等(例如參照Biomaterial 2003年2月號p113. -119)。

發明內容
但是還沒有在可應用于再生醫療等之中的間葉細胞或軟骨細胞等 細胞中結合了磁性粒子的實例。因此在結合了磁性粒子的細胞給藥后能 否通過外部的磁力而在局部滯留、或者細胞能否發揮其本來的作用等方'— 面還存在有較多需要解決的未知問題。
本發明人等經過深入研究，結果著眼于細胞表面的性能而完成了本 發明。即，本發明的第一種方案為提供一種在細胞表面具有磁性粒子的' 磁性細胞。通過該細胞的構成，能夠利用磁性粒子的磁性將細胞移動至理想的部位。
本發明的磁性細胞的優選方案中，前述表面與前述磁性粒子通過連
接體(linker)結合，或者前述表面通過前述磁性粒子具有的特定氨基酸 序列粘合。作為前述特定的氨基S吏序列，例如可以舉出精氨酸-甘氨酸 -天冬氨酸-絲氨酸的四個氨基酸構成的肽(RGDS )、或者甘氨酸-精 氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-絲氨酸的五個氨基酸構成的肽(GRGDS )。
本發明的；茲性細胞的優選方案中前述表面和前述連4妄體通過抗原 抗體反應進行結合。
本發明的磁性細胞的優選方案中，前述連接體和前述》茲性粒子通過 化學鍵結合。
本發明的磁性細胞的優選方案中，前述磁性粒子中至少包含磁性體。
本發明的磁性細胞的優選方案中，前述磁性粒子中還包含藥物。
本發明的磁性細胞的優選方案中，前述細胞選自軟骨培養細胞、間 葉細胞、淋巴細胞及表達整聯蛋白的細胞。
本發明的第二種方案為提供一種培養磁性細胞的方法，所述方法包 括制備前述磁性細胞的步驟和培養前述磁性細胞的步驟。
另外，本發明的第三種方案為提供一種滯留磁性細胞的方法，所述 方法包括下述步驟，即，使前述磁性細胞向病灶部位移動并保留在該部 位的步驟，和通過磁場使前述磁性細胞長時間滯留在前述病灶部位的步 驟。
本發明的滯留方法的優選方案中，前述滯留步驟通過在體外對病灶 部位施加前述磁場或將磁石埋入體內而得以實施。
另外，本發明的第四種方案為提供一種控制磁性細胞活動的方法， 所述方法包括以下步驟，即，將前述磁性細胞和含有藥物的磁性粒子同 時或者分別給予病灶部位的步驟，和從前述磁性粒子中釋放前述藥物的 步驟。
本發明的控制方法的優選方案中，前述藥物選自促骨形成藥、癌治 療藥、或者癡呆癥治療藥。.另外，本發明的第五種方案為提供一種治療方法，所述方法包括以 下步驟，即，將前述磁性細胞和含有藥物的磁性粒子同時或者分別給予 病灶部位的步驟，和從前述磁性粒子中釋放出前述藥物的步驟。
本發明的治療方法的優選方案中，前述藥物選自促骨形成藥、癌治 療藥、或者癡呆癥治療藥。 ，
通過將本發明的磁性細胞導入生物體內，并利用體外的磁場作用，
可以將其長時間保留在病灶部位，因而能夠有效發揮該細胞本來具有的 功能。另外，通過利用本發明中的磁性細胞，可根據治療的需要，適用
于軟骨形成等再生醫療或抗癌藥等的藥物釋;^文系統。'


圖l示出本發明的第一種實施方案中磁性細胞的簡圖。 圖2示出本發明的第二種實施方案中磁性細胞的筒圖。
圖3示出作為再生醫療的軟骨修復說明圖。
圖4示出將本發明的磁性細胞注射到關節內l個月后，約72小時不存 在外部磁場的情況(A)以及存在外部磁場的情況(B)觀測到的顯樣吏鏡 照片(50倍)。
圖5示出在大鼠骨髓間葉干細胞中觀測到的、本發明磁性細胞的制 備例2 (A)及3. (B)中制備的磁性細胞的顯《鼓鏡照片(4S0倍)。
圖6示出用軟骨誘導培養基對本發明中通過CD44或RGDS肽制成的 磁性細胞(大鼠骨髓間葉干細胞)進行21天沉淀培養后，利用RT-PCT 法研究II型膠原蛋白、聚集蛋白聚糖(來自軟骨)的mRNA (基因)表 達的結果。
圖7為利用大鼠的神經干細胞說明本發明磁性細胞的形成狀態的照 片，(A)為400倍的照片，(B)為1600倍的照片。
具體實施例方式
下述實施方案是用于說明本發明的示例，本發明不僅限于所述實施 方案。只要不脫離本發明的要點，也可以通過各種方案實施本發明。(第一種實施方案) 本發明的磁性細胞是基于對存在于細胞表面的粘合成分的利用而 得到的。圖1為本發明的第一種實施方案中磁性細胞10的簡圖。該磁
性細胞10含有it性粒子60,所述磁性粒子60通過連接體50與糖蛋白 質40結合，所述糖蛋白質40表達在含有核30的細胞20的表面。本發 明中利用的糖蛋白質40并不限定于下述物質，但優選CD44或HLA。 ■
作為本發明的磁性粒子60,例如可以舉出含有磁性體70的脂質體。 所述脂質體中可以進一步含有能夠控制細胞功能的藥物80,另外，磁性 體及藥物也可以使用其它類型的包封材料進行包封。
此處，脂質體為具有水性內部的球形脂質雙層。形成脂質體時，存 在于水性溶液中的分子進入水性內部。脂質體的內容物被保護于外部的 微環境之外，并且由于脂質體與細胞膜融合因而該內容物可被有效輸送 至細胞質內。
本發明中使用的脂質體只要是普通的公知脂質體即可，尤其可以舉 出能夠用于口服給藥或者注射的脂質體。可以適用上述脂質體，也可以 利用公知的材料重新設計、形成脂質體。具體而言，優選使用含有磷脂、 甘油醚磷脂(ether glycerophosphatide )、.(神經)鞘磷脂、甘油糖脂、神 經鞘糖脂作為脂質體膜的主要構成成分，并含有甾醇類或生育酚類等作 為使脂質體膜穩定化的脂質成分的脂質體等。
作為上述磷脂，可以使用天然磷脂、合成磷脂等普通的公知磷脂。 優選使用下述磷脂，例如(1)磷脂酰膽堿、(2)磷脂酰乙醇胺、(3) 磷脂酰甘油、(4)磷脂酰絲氨酸、(5)磷脂酸、以及(6)磷脂酰肌醇 等。
上述(1)的磷脂酰膽堿可以舉出，例如蛋黃卵磷脂、大豆卵磷脂、 氫化蛋黃卵磷脂、氫化大豆卵磷脂、源自大豆的磷脂酰膽堿、源自大豆 的氫化磷脂酰膽堿等天然磷脂酰膽堿類；含有碳原子數為7~22的飽和 或者不飽和羧酸作為構成成分的磷脂酰膽堿等合成磷脂酰膽堿類。作為 具體例可以舉出二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二油酰 磷脂酰膽堿等。作為上述脂肪酸殘基可以舉出辛酰基(octanoyl)、壬酰
基(nonanoyl)、癸酰基(decanoyl)、十一烷酰基(undecanoyl )、十二烷 酰基(rauroyl )、 肉豆蔻酰基(myristovl )、棕櫚酰基(palmitoyl )、油基 (oleyl )、硬脂基(stearyl )、棕櫚油酰基(palmitoleyl )、亞油酰基(linoleyl )、 亞麻酰基(linolenyl)、花生四烯酰(arachidonyl)等基團。另外，結合 在甘油的1-位、2-位的脂肪酸殘基部分可以相同也可以不同。
前述(2)的磷脂酰乙醇胺可以舉出例如，源自大豆的磷脂酰乙醇 胺、源自大豆的氬化磷脂酰乙醇胺等天然磷脂酰乙醇胺類；含有碳原子 數為7 22的飽和或者不飽和羧酸的磷脂酰乙醇胺等合成磷脂酰乙醇胺 類。作為具體例可以舉出二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰磷脂酰乙 醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺等。作為脂肪酸殘基，可以舉出與前述(l) 同才羊的基團。
前述(3)的磷脂酰甘油可以舉出例如，含有碳原子數為7~22的
飽和或者不飽和羧酸的磷脂酰甘油等合成磷脂酰甘油類。作為具體例可 以舉出二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二棕櫚酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘
油等。作為構成脂肪酸殘基，可以舉出與前述(l)同樣的基團。
前述(4)的磷脂酰絲氨酸可以舉出例如，源自大豆的磷脂酰絲氨 酸、源自大豆的氫化磷脂酰絲氨酸等天然磷脂酰絲氨酸類；含有碳原子 數為7 ~ 22的飽和或者不飽和羧酸的磷脂酰絲氨酸等合成磷脂酰絲氨酸 類。作為具體例可以舉出二肉豆蔻酰磷脂酰絲氨酸、二棕櫚酰磷脂酰絲 氨酸、二油酰磷脂酰絲氨酸等。作為構成脂肪酸殘基，可以舉出與前述 (1)同樣的基團。
前述(5)的磷脂酸可以舉出例如，含有碳原子數為7~22的飽和 或者不々包和羧酸的磷脂酸等合成磷脂酸類。作為具體例可以舉出二肉豆 蔻酰磷脂酸、二棕櫚酰磷脂酸、二油酰磷脂酸等。作為構成脂肪酸殘基， 可以舉出與前述(l)同樣的基團。前述(6)的磷脂酰肌醇可以舉出例 如，源自大豆的磷脂酰肌醇、源自大豆的氬化磷脂酰肌醇等天然類磷脂 酰肌醇；也可以使用合成類磷脂酰肌醇。作為構成脂肪酸殘基，可以舉 出與前述(1 )同樣的基團。 另外，作為本發明中使用的脂質體膜的構成成分，也可以使用甘油 磷脂、(神經)鞘磷脂、甘油糖脂、神經鞘糖脂等。本發明中作為使脂 質體膜穩定化的脂質成分，可以使用甾醇類或生育酚類。作為前述甾醇 類，只要是普通公知的甾醇類即可，可以舉出例如，膽甾醇、谷甾醇、 菜油甾醇、豆甾醇、菜籽甾醇等，從購入性方面考慮，優選使用膽甾醇。 作為前述生育酚類，只要是普通公知的生育酚類即可，從購入性方面考 慮，優選使用市售的CC-生育酚。
作為本發明中使用的包封材料，可以使用離子交換樹脂、結晶性陶 瓷、生物體可適性玻璃、膠乳，也可以與'各種表面活性劑一同制成微球 進行使用。而且，也可以使用毫微球、及其它脂質、聚合物或者蛋白質
材料作為前述包封材料。包封材料的直徑優選為數十~數百nm,沒有
特別的限制。另外，所述藥物的包封材料至少含有磁性體，可以包含藥 物，也可以不包含藥物，但是從細胞控制方面考慮，優選包含藥物。
另外，本發明的藥物包封材料也可設置用于控制藥物釋放的藥物釋 放控制成分，作為控制藥物釋放速度的成分，可以舉出高分子、溫度敏
感性分子、超聲波及/或磁敏感性物質。具體可以舉出特開平5 -228358 記載的具有濁點的高分子化合物(聚丙烯酸類聚合物)，特開平11-92360記載的超聲波敏感性物質(外啉衍生物、.卩占噸衍生物)等。
作為本發明中利用的磁性體，只要是具有磁性的物質即可，無任何 限制，常磁性、超常磁性、強磁性均可，強磁性中除了亞鐵磁性，也包 括鐵磁性。作為磁性體的具體例，除了磁鐵礦(Fe304)、磁赤鐵礦之外， 還可以舉出鐵、鈷、鎳等強磁性元素的化合物粒子。所述強磁性化合物 中，磁鐵礦、磁赤鐵礦未表現出對生物體的毒性，并且穩定，因此被優 選4吏用。特別優選磁鐵礦。
前述磁性體不僅包括前述強磁性化合物單獨存在的情況，也可以包 括用纖維素、淀粉、糊精、瓊脂、甲基丙烯酸酯或苯乙烯等進行包埋或 由磁性細菌生物合成、經磷脂被覆磁鐵礦得到的磁性粒子。
下面說明本發明中使前述細胞的表面具有磁性粒子的方法。作為該 方法，可以舉出細胞表面的反應性官能團和磁性粒子的反應性官能團通
過共價4建結合的方法、或通過連接體使其結合的方法等。作為本發明中 使用的連接體，可以舉出兩個末端具有羧基或氨基等反應性官能團的化
合物(以下，簡稱為"雙官能性間隔體(bifimctional spacer)")或者抗 體。作為細胞與磁性粒子通過連接體結合的方法，可以舉出下述優選例， 例如，使粉碎磁性細菌得到的被覆有磷脂膜的磁性粒子通過雙官能性間 隔體與細胞表面的反應性官能團結合的方法；或者通過抗原抗體反應使 細胞表面的HLA或CD44等粘合分子結合在下述結構上的方法等，前述 結構為使表面經羧基修飾的磁性粒子和用作連接體的抗體的氨基鍵合 成酰胺《定而形成的結構。
本發明的磁性細胞可以為下述任一形式，即，磁性粒子含有在細胞 內部，^磁性粒子結合在細胞表面，或者磁性粒子通過連接體結合在細胞 表面。作為使磁性粒子含有在細胞內部的方法，可以通過對磁性粒子實 施例如特開平6 - 133784記載的利用粒子槍的方法而實現。.
本發明的第一種實施方案中，作為前述磁性粒子60中含有的藥物 80,可以舉出以細胞因子(cytokin)等負責細胞信息傳遞體系的物質為 代表的生理活性物質等，但是并不限定于此。作為細胞因子的具體例， 可以舉出干擾素類(IFN- a 、 IFN- (3 、 IFN- y等)、白細胞介素類(IL-1 ~ 18等)、淋巴毒素類、腫瘤壞死因子(TNF-cx等)、粒細胞巨噬細胞集落 刺激因子(GM-CSF)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF、 CSF-1 )、粒細胞 集落刺激因子(G-CSF)、促紅細胞生成素、血栓形成素、造血干細胞因 子(SCF)、單核細胞趨化活化因子(MCAF)、轉化生長因子(TGF-a、 TGF-P )、成纖維細胞生長因子(FGF)、上皮細胞生長因子(EGF)、血 小板衍生生長因子(PDGF)、神經細胞生長因子(NGF)等。特別優選 干擾素類、白細胞介素類、肺瘤壞死因子、促紅細胞生成素、血栓形成 素、轉化生長因子、成纖維細胞生長因子、上皮細胞生長因子、血小板 衍生生長因子、神經細胞生長因子等。
另外，作為前述藥物80,也可以舉出需要對病灶部位進行預防及/ 或治療的疾病的藥物等，作為藥物的具體例，抗癌藥可以舉出伊立替康 三水鹽酸鹽(Irii德can HC1 Trihydmte)、自力霉素(mitomycin )、 5-氟
尿嘧咬、順氯氨柏(cisplatin )、鹽酸吉西他濱(gemcitabine hydrochloride )、 阿霉素(doxorubicin),紫杉醇(taxol)等，但并不局限于此。另外作為 阿爾茨海默病(Alzheimer)治療藥可以舉出鹽酸多奈哌齊(donepezil hydrochloride)等。通過將所述藥物80置于構成磁性細胞的脂質體內， 可以將本發明的磁性細胞活用為藥物釋放系統。
前述藥物80也可以形成鹽。所述鹽的優選例可以舉出與無機酸形 成的鹽、與有機酸形成的鹽、與無機堿形成的鹽、與有機堿形成的鹽、 與酸性或者^ 威性氨基酸形成的鹽等，其中優選藥理學允許的鹽。作為與 無機酸形成的鹽的優選例，可以舉出例如與鹽酸、氬溴酸、硫酸、硝酸、 磷酸等形成的鹽。作為與有機酸形成的鹽的優選例，可以舉出例如與醋 酸、琥珀酸、富馬酸、馬來酸、酒石酸、枸櫞酸、乳酸、硬脂酸、苯曱 酸、曱磺酸、乙磺酸、對曱苯磺酸等形成的鹽。作為與無機堿形成的鹽 的優選例可以舉出，例如鈉鹽、鉀鹽等堿金屬鹽；釣鹽、鎂鹽等堿土類 金屬鹽；鋁鹽、銨鹽等。與有機堿形成的鹽的優選例可以舉出，例如與 二乙胺、二乙醇胺、葡甲胺(meglumine), N, N， -二千基乙二胺等形
前述藥物80在作為相關疾病的預防或者治療藥給予患者時，給藥 途徑、給藥量、給藥次數因患者的癥狀、疾病的種類.程度、年齡、 心'肝'腎功能等而異，無法進行限定。例如，用于治療人類癌癥時， 成人口服給藥量為0.01mg~ 1000mg/日、優選為0.1mg~ 1000mg/日、更 優選為0.1mg~ 100mg/日，成人靜脈給藥量為0.01mg 500mg/日、優 選為0.1mg 500mg/日、更優選為O.lmg ~ 100mg/日，可根據癥狀，一 曰分成1次至5次進行給藥。
也可以制成含有前述藥物80的藥物組合物導入磁性細胞，前述組 合物可以使用賦形劑、潤滑劑、粘合劑、崩解劑、穩定劑、矯味矯臭劑、 稀釋劑等添加劑,.以公知的方法進行制備。賦形劑的具體例可以舉出乳 糖、白糖、葡萄糖、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、oc-淀粉、糊精等淀粉衍生 物；結晶纖維素等纖維素衍生物；阿拉伯膠、糊精、支鏈淀粉等有^i類 賦形劑；及輕質硅酸酐、合成硅酸鋁、硅酸4丐、硅酸鋁酸鎂等硅酸鹽衍
生物；磷酸氬鉤等磷酸鹽；碳酸釣等碳酸鹽；硫酸4丐等硫酸鹽等無機類 賦形劑等。潤滑劑的具體例可以舉出硬脂酸、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂等硬 脂酸金屬鹽；.滑石粉；膠態二氧化硅；硅酸鋁鎂、鯨蠟等蠟類；硼酸； 己二酸；硫酸鈉等硫酸鹽；乙二醇；富馬酸；苯曱酸鈉；DL亮氨酸； 脂肪酸鈉鹽；月桂基硫酸鈉、月桂基硫酸鎂等月桂基硫酸鹽；硅酸酐、 硅酸水合物等硅酸類；以及上述淀粉衍生物。作為粘合劑的具體例，可 以舉出鞋基丙基纖維素、羥丙曱基纖維素、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙(烯) 二醇(macrogol)、及與前述賦形劑相同的化合物。作為崩解劑的具體例， 可以舉出低取代羥基丙基纖維素、羧基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈣、 內交聯羧甲基纖維素鈉等纖維素衍生物；羧甲基淀粉、羧甲基淀粉鈉、 交聯聚乙烯基吡咯烷酮等經過化學修飾的淀粉、纖維素類等。作為穩定 劑的具體例可以舉出對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯曱酸丙酯等對羥基苯 甲酸酯類；氯丁醇、節醇、苯乙醇等醇類；苯扎氯銨；苯酚、甲(苯) 酚等酚類；乙基汞硫代水楊酸鈉(thimerosal);脫氳醋酸；及山梨酸等。 作為矯味矯臭劑的具體例可以舉出通常用于制劑中的甜味劑、酸味劑、 香料等。
■作為本發明中使用的細胞，優選淋巴細胞、間葉干細胞、軟骨培養 細胞等，但并不局限于此。 (第二種實施方案)
圖2為本發明的第二種實施方案中磁性細胞的簡圖。本發明的第二 種實施方案中利用了存在于細胞表面的整聯蛋白110和對于該整聯蛋白 有粘合活性的肽120。作為前述肽可以舉出RGDS (由精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-絲氨酸四種氨基酸構成的肽，分子量433.42),但不限定于此。
本發明的第二種實施方案通過使用以RGDS的氨基酸序列修飾》茲珠 表面而得到的活化磁珠130,提供了表面具有磁性粒子的磁性細胞200。
所述磁性細胞的制備方法如下。第一，利用試劑將表面預先經羧基 修飾的磁珠活化。該活化步驟中只要使用可活化羧基的試劑即可，沒有 特別的限制，但優選使用碳二亞胺類。第二，使存在于磁珠表面的活化 羧基和肽的氨基反應，形成酰胺鍵，從而能夠在磁珠的表面導入肽。
對于本發明的磁珠上的肽被覆量而言，相對于3mg磁珠，作為配體 的肽或者抗體能夠被覆至10ng 20Mg，優選為15ng~15jig,進一步 優選為20ng~ 10jug。因此相對于每單位重量的磁珠，即，相對于每lmg 的^茲珠，可被覆3ng 6.6jag。當肽在磁珠上的襪覆量過多時，使最終 的磁性纟田胞之間相互粘合，由此使其難以向作為革巴部位的病灶部位移 動。如果被覆量過少，則可能無法發揮磁性細胞本身的性能。
然后，使導入了肽的磁珠和所希望的細胞表面的粘合分子發生反 應，從而可以制備出本發明的磁性細胞。發生上述反應時雖然也受到所 導入肽的比例的影響，但相對于數量為2x 105的前述所希望的細胞而 言，導入了肽的萬茲珠的量優選為0.1 |ul~20|Lil,更優選為0.2|ul~ 18jlU, 進一步優選為0.5yl~15pl。如果導入了肽的磁珠量為0.1 Ml以下，則 不能發揮磁性細胞自身的功能；如果導入了肽的磁珠量為20jul以上， 則f茲性細胞之間相互粘合，難以向作為耙部位的病灶部位移動。
作為導入了肽的磁珠與存在于細胞表面的粘合分子的反應溶液，可 以舉出BSA (牛血清白蛋白)的磷酸緩沖食鹽水(以下稱為 "BSA/PBS"),更優選使用在BSA/PBS中添加EDTA (乙二胺四乙酸) 而得到的溶液、0.5%BSA4.4jaMEDTAinPBS(-) (EDTA濃度為4.4 ja M 2mM),"怛不限于上述溶液。
另外，在本發明的第二種實施方案中，可以同樣利用前述第一種實 施方案中的磁性體和藥物，這是本領域技術人員容易理解的。
下面說明本發明的磁性細胞的使用方法。通過將上述制備的磁性細 胞在各種細胞中進行培養，可以將其用于后述的治療之中。需要說明的 是，可以適當選擇培養中使用的培養液及培養溫度。培養液因所用細胞 不同而不同，例如，對于軟骨培養細胞而言，適用DMEM (Dulbeccos Modified Eagle Medium)為基礎的i喬養液。
可以通過使本發明的磁性細胞在所希望的病灶部位長期滯留，根據 所述細胞的種類而用于治療。例如，使用骨髓間葉干細胞時，可以在病 灶部位形成軟骨樣組織。因此，在所希望的病灶部位長期滯留較為重要。
本發明中的用語"使磁性細胞在病灶部位長期滯留"是指滯留足夠長的時間以使磁性細胞發揮其具有的功能，該時間優選為1~90日的期
間，更優選1 ~ 80日的期間，進一步優選1 ~ 50日的期間。作為本發明 磁性細胞的給藥部位，只要是體內存在病灶的部位、或者實施治療的部 位即可，例如，可以舉出例如腦、骨、肝臟、心臟、關節等。作為疾病 的具體例，可以舉出中風、惡性胂瘤、脊髓損傷、軟骨缺損、肌肉缺損、 韌帶損傷等。
作為使本發明的磁性細胞存留于體內的給藥方法，可以通過外科手 術進行給藥，也可以通過注射進行給藥。此處所謂外科給藥是指例如在 骨中開孔進行給藥；注射給藥是指通過注射對患部直接給藥或者經靜脈 注射對全身給藥。
為了^t化磁性粒子，本發明中所使用的用語"磁場"優選為60高 斯(以下記為"G")或60高斯以上，為了防止磁性粒子在體內擴散而 使其在局部滯留，更優選為70G或70G以上。可以從體外施加磁場，也 可以通過在體內埋置磁石而施加磁場。此時從磁力、穩定性、強度方面 考慮，》茲石優選為釹磁石。
圖3示出適用本發明磁性細胞的治療的模式簡圖。如圖3所示，本 發明的磁性細胞經關節內注射而導入生物體內。由于在磁性細胞應該移 動、存留的位置配置永磁鐵，因此可以使本發明的磁性細胞在前述永磁 鐵的磁力作用下向理想的位置移動。圖3中磁性細胞可被移至關節軟骨 的缺損部位并存留于該部位。本發明的磁性細胞所使用的細胞只要是骨 髓間葉干細胞，就可以在上述部位形成軟骨樣組織而修復前述缺損部 位。
圖3中說明了作為再生醫療而受到關注的軟骨修復，如果治療郜位 為癌細胞，則可以通過使構成磁性細胞的磁性粒子中含有抗癌藥而使藥 物集中于局部。
給予至生物體內的本發明的磁性細胞通過酶等的作用或溫度等釋 方文出藥物。
本發明中"控制磁性細胞的活動"是指利用細胞因子等藥物控制分 化、生長等細胞活動。
磁性細胞和藥物包封材料可以同時給予也可以分別給予，例如可以 舉出以下方式，即將磁性細胞及藥物包封材料分別制成注射劑，裝入 一個包裝盒中制成藥物試劑盒等。
用下述實施例進一步詳細地說明本發明， <旦本發明的范圍并不局限 于此。本領域技術人員能夠基于本發明的記載實施各種變更、修改，上 述變更、修改也包括在本發明之中。
實施例 (磁性細胞的制備之一)
1. 》茲^朱的活化
從作為磁珠的Ferri Sphere 100C原液(50mg/ml)(日本Paint)中取 出相當于3mg (60yl)的量，加入0.01NNaOH,用攪拌器在室溫下攪拌 IO分鐘后進行洗滌。重復進行一次上述洗滌操作后加入去離子水，用攪 拌器在室溫下攪拌5分鐘后洗滌。將上述洗滌操作重復3次。為了使磁珠 活化，在除去剩余的水分之后，先將25mM 2- [ N-嗎啉代]乙磺酸(以 下稱為"MES，， ) ( SIGMA社制)、pH5.0下制備的50mg/ml的l-乙基-3國 (3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(以下稱為"EDC" ) ( SIGMA社 制)和N-羥基琥珀酰亞胺(以下稱為"NHS，， ) ( SIGMA社制)各50 ja 1 與磁珠在試管.中充分混合，然后在室溫下緩慢翻轉攪拌30分鐘。將反應 后的試管在釹磁石上放置2分鐘，除去上清液。最后用25mMMES、 pH5.0 下洗滌2次，使最終溶液的體積為40 M 1。
2. 活化后的抗體的固定
用60 y l的25mM MES溶解大鼠的CD44抗體(20 y g) ( CHEMICON 社制)，加入上述活化磁珠，在室溫下緩慢翻轉攪拌3小時，將抗體固定 在活化磁珠上。將反應后的試管在釹磁石上放置2分鐘，除去上清液。 為了除去未與磁珠反應的抗體，添加處于磷酸緩沖液中的0.05M乙醇 胺，并在室溫下緩慢翻轉攪拌l小時。將固定后的磁珠用0.5 %BSA (SIGMA社制)的磷酸緩沖液在4。C下洗滌5分鐘。將上述洗滌操作反復 進行4次后，懸浮在lml的0.5。/。BSA磷酸緩沖液中，在4。C下保存。
3. 將固定化磁珠結合在細胞上
將培養的大鼠骨髓間葉干細胞從皿(dish)中剝離并移至試管中， 在4。C下保存10分鐘。添加60jal配制成細胞懸浮液(lX106cells)的上 述磁珠后，在4。C下緩慢地翻轉攪拌1小時使其發生抗原抗體反應。將反 應后的試管在釹磁石上放置2分鐘后除去上清液。用0.5。/。BSA的磷酸緩 沖液使其重懸。將該洗滌操作進行4次。然后使其懸浮在磷酸緩沖液等 之中用于試驗。
(具有磁性脂質體的磁性細胞的制備例l )
1. N- [3- (2-吡啶基二硫代).丙酰基]磷脂酰乙醇胺(以下稱為 "PDP-PE，，)的合成
在3ml無水乙醇中溶解25mg N-琥珀酰亞胺基3- ( 2-吡咬基二硫代) 丙酸酯和50jumol三乙醇胺，進一步溶解50jumol磷脂酰乙醇胺，并進行 攪拌。5小時后減壓除去無水乙醇，并將殘留物溶解于氯仿中。用氯仿 洗滌150。C下活化了 一夜的硅膠柱(10ml )。洗柱后使反應物流過柱子， 進一步用20ml氯仿洗滌。分別流過氯仿:'曱醇的比例為40: 1、 30: 1、 25: 1、20: 1及15: l的混合溶液各20ml，最后流過10: l的混合溶液60ml。 將15: 1及10: l的洗出液合并，進行減壓濃縮。
2. 脂質體的制備
將10 )i mo 1蛋黃磷脂酰膽石威(Egg phosphatidylcholin) 、 10 n mol月旦 甾醇及l jumolPDP-PE溶解于3ml的乙醚中，將乙醚減壓氣化。加入lml 含有磁牲體鐵(Fe203 ) 5mg及包封藥物(TGF-P、 bFGF )的0.9%生理 鹽水、以及硼酸/枸櫞酸緩沖液(pH6.0 )，用渦流混合器(Vortex mixer) 進行震蕩，使燒杯內附著的薄層被膜完全剝離。在水浴超聲波儀(Bath sonicator)(同上)中進行50分鐘超聲處理。用0.45T的永^茲鐵(同上) 將制成的磁性體脂質體及未包封的磁性體從溶液中分離出來。在1000xg (ppm)下離心分離15分鐘，將作為上清液的磁性體脂質體和作為沉淀 的未被封入的磁性體分離。
3. 脂質體與抗體的結合
在60 n l的25mM MES中溶解人的CD44抗體(20 m g),加入制成的 脂質體，在室溫下緩慢地翻轉攪拌3小時將抗體固定在脂質體上。反應
后在釹磁石上放置2分鐘，除去上清液。為了除去未反應的抗體，加入
0.05M乙醇胺的磷酸緩沖液，在室溫下緩慢地翻轉攪拌l小時。在4。C下 用0.5。/。BSA的磷酸緩沖液洗滌5分鐘。將該洗滌操作反復進行4次，使其 在lml 0.5 % BSA的磷酸緩沖液中懸浮穩定，在4。C下保存。 4.將固定了抗體的脂質體結合在細胞上
將培養的人骨髓間葉干細胞從皿(dish).中剝離并移至試管中，在4 。C下保存10分鐘。添加配制成細胞懸浮液(lX106cells)的脂質體后， 在4。C下緩慢地翻轉攪拌1小時使其發生抗原抗體反應。將反應后的試管 在釹磁石上放置2分鐘，除去上清液。用0.5。/。BSA磷酸緩沖液重懸。將 該洗滌操作進行4次。然后使其懸浮在磷酸緩沖液等之中直接用于試驗。
試驗例1 (體外試驗)
將結合了以前述方法制備的磁性粒子的骨髓間葉干細胞4X 106cells 》文入培養i中。本實施例中，在培養皿的下部中央設置了4300G的圓形 (直徑5mm )釹磁石；然而在比較例中未設置磁石。在培養皿中加入TGF畫 P和地塞米松。培養21天后，用曱苯胺藍染色進行評價。實施例中，以 》茲石對應的位置為中心，局部形成了軟骨樣組織。然而在比較例中未在 局部形成軟骨樣組織。
圖4示出將本發明的磁性細胞注射到關節內1個月后，約72小時不存 在外部磁場(A)及存在外部磁場(B )的情況下觀測到的顯微鏡照片(50 倍)。由圖4 (A)可知，用黑點表示的磁性細胞在細胞中任意位置均能 被觀測到，然而，由圖4(B)可知，用黑點表示的磁性細胞集中存在于 圖4 (B)的左上方。需要說明的是，圖4 (A)及(B)實際是用蘇木精 -伊紅(hematoxylin-eosine)進行了染色，在圖4中表示為灰色。
從以上結果可知，本發明的磁性細胞可以通過磁石的作用向局部移 動。并且，受到外部磁場作用的細胞中可以觀測到利用玻璃軟骨進行的 修復。
試驗例2
(家兔的膝間部骨缺損修復)
在家兔的膝關節部，按照Bioindustry2002.Vol.l9.No.6p47-53記載的
方法制作2處寬5mm的骨缺損。在該缺損部位注射3.0 ju g實施例中得到的 磁性細胞。然后將具有700G磁場的磁石置留在缺損部位對應的表面，置 留9周。在比較例中不施加外部磁場地給予磁性細胞。結果發現，實施 例中軟骨細胞局部存在于骨缺損部位并通過形成新生骨的交聯而修復 骨缺損，然而未施加外部磁場的比較例中未發現骨缺損的修復。 (磁性細胞的制備例2) 1.使用EDC和NHS進行的磁珠活化
從Ferri Sphere IOOC原液(50mg/ml)(日本Paint^土 )中取出相當于 3mg(60yl)的量，加入0.01NNaOH,用攪拌器在室溫下攪拌10分鐘后 洗滌。重復進行一次上述洗滌操作后加入去離子水，用攪拌器在室溫下 攪拌5分鐘后洗滌。將上述洗滌操作重復3次。為了使磁珠活化，在除去 了剩余的水分之后，先將25mMMES、 pH5.0下制備成的50mg/ml EDC、 和NHS各50y l與磁珠充分混合，并在室溫下緩慢翻轉攪拌30分鐘。將 反應后的試管在釹磁石上放置2分鐘后除去上清液。最后用25mMMES、 在pH5.0下洗滌2次(使最終溶液的體積為40 ja 1 )。
2..活化后的抗體的固定
用60 w 1的25mM MES 、在pH5.0下溶解大鼠的CD44抗體 (CHEMICON社制)、或者RGDS peptides ( peptide研究所)(20 n g )， 加入活化磁5朱(40ja l的25mM MES pH5.0下懸浮)，在室溫下緩慢翻轉 攪拌3小時，將抗體固定在活化磁珠上。將反應后的試管在釹磁石上放 置2分鐘，除去上清液。為了除去未與磁珠反應的抗體，添加處于PBS (-)pH8.0中的0.05M乙醇胺，并在室溫下緩慢地翻轉攪拌l小時。將固 定后的磁珠用處于PBS (-)中的0.5。/。BSA在4。C下洗滌5分鐘。將上述洗 滌操作反復進行4次后，懸浮在lml處于PBS (-)中的0.5。/。BSA中，在4 。C下保存。
3,將固定了抗體的磁珠結合在細胞上
將培養的大鼠骨髓間葉干細胞從皿中剝離并移至試管中。添加15 p l配制成500ja l細胞懸浮液(2X105cells)的磁珠后，在4。C下間斷進行翻轉攪拌，共計l小時，使其發生抗原抗體反應。此時的反應緩沖液為
處于PBS (-)中的0.5。/。BSA。將反應后的試管在釹磁石上放置2分鐘后 除去上清液。用處于PBS(-)中的0.5。/。BSA將其重懸。將該洗滌操作進 行3 4次。然后使其懸浮在PBS (-)等之中用于試驗。 (磁性細胞的制備例3 )
1. 利用EDC和NHS進行的磁珠活化
從Ferri Sphere IOOC原液(50mg/ml)(日本Paint社)中耳又出相當于 3mg (60|ul)的量，加入0.01NNaOH,用攪拌器在室溫下攪拌10分鐘后 洗滌。重復進行一次上述洗滌操作后加入去離子水，用攪拌器在室溫下 攪拌5分鐘后洗滌。將上述洗滌操作重復3次。為了使磁珠活化，在除去 了剩余的水分之后，先將25mMMES、 pH5.0下制備成的50mg/ml EDC、 和NHS各50n l與磁工朱充分混合，并在室溫下緩慢翻轉攪拌30分鐘。將 反應后的試管在釹磁石上放置2分鐘后除去上清液。最后用25mM MES、 pH5.0下洗滌2次(使最終溶液的體積為40ju 1 )。
2. 活化后的抗體的固定
用60 in 1的25mM MES pH5.0溶解大鼠CD44抗體(CHEMICON社制) 或者RGDS peptides (peptide研究所)(lOng),加入活化磁珠(40n l的 25mM MES pH5.0下懸浮)，在室溫下緩慢翻轉攪拌3小時，將抗體固定 在活化磁珠上。將反應后的試管在釹磁石上放置2分鐘后除去上清液。 為了除去未與磁珠反應的抗體，添加處于PBS (-) pH8.0中的0.05M乙醇 胺，并在室溫下緩慢地翻轉攪拌l小時。將固定的磁珠用處于PBS (-) 中的0.5。/。BSA在4。C下洗滌5分鐘。將上述洗滌操作反復進行4次后，懸 浮在lml處于PBS (-)中的0.5。/。BSA中，在4。C下保存。
3. 將固定了抗體的磁珠結合在細胞上
將培養的大鼠骨髓間葉干細胞從皿中剝離并移至試管中，添加l H 1 配制成500 n l細胞懸浮液(2X105ceUs)的磁珠后，在使用CD44抗體的 情況下，在冰箱中(4~10°C)間斷進行翻轉攪拌，共計l小時，使其發 生抗原抗體反應。'在使用RGDS peptides的情況下，在37。C下用1小時間 斷進行翻轉攪拌，使其與細胞發生反應。此時的反應緩沖液為處于PBS
(-)中的0.5。/。BSA4.4nMEDTA。將反應后的試管在釹磁石上放置2分 鐘，除去上清液。用處于PBS(-)中的0.5。/。BSA將其重懸，將該洗滌操 作進行3 4次，然后使其懸浮在PBS (-)等之中用于試驗。
圖5示出在大鼠骨髓間葉干細胞中觀測在前述制備例2 (A)、 3 (B) 中制備的磁性細胞(通過整聯蛋白和RGDS肽連接的磁性細胞)的顯微 .鏡照片(480倍)。由圖5可知，本發明磁性細胞的行為受到下述因素的 影響，即，具有磁性體的RGDS肽在磁珠上的導入壹，即，前述肽在磁 珠上的被覆量，和制備磁性細胞時細胞上的磁珠量。當前述導入量或磁 珠量較高時，最終在生物體內的細胞中磁性細胞之間具有凝集的傾向。'
圖6示出用軟骨誘導培養基對本發明通過CD44或者RGDS肽制成的 磁性細胞(大鼠骨髓間葉干細胞)進行沉淀(pellet)培養21天后，利用 RT-PCT法，研究II型膠原蛋白、聚集蛋白聚糖(來自軟骨)的mRNA (基 因)表達的結果。在添加了TGF-e和地塞米松進行分化誘導的組(D + 組)中能夠確認到兩個基因的表達，在未添加TGF-(3和地塞米松進行培 養的組(D-組)中不能確認兩個基因的表達。從圖6的結果可以推測， 通過RT-PCR復合體的軟骨形成作用，以CD44抗原或RGDS肽作為連接體 的磁性細胞(骨髓間葉干細胞)可以分化誘導成軟骨細胞。
圖7為說明利用大鼠神經干細胞形成本發明的磁性細胞的狀態的照 片。從圖7的結果可以確認，通過移液管(pipetting)將凝集的大鼠神經 干細胞離散開，然后使前述經RGDS肽修飾后的磁珠作用于該細胞，能 夠通過神經干細胞的整聯蛋白形成利用大鼠神經干細胞的磁性細胞。
產業實用性
根據本發明的^茲性細胞，通過將其導入生物體內并利用從體外施加 的磁場作用，能夠使其長期存留于病灶部位，因此能夠有效發揮該細胞 本來具有的功能。另外，根據治療的需要，本發明的磁性細胞可以適用 于軟骨形成等再生醫療、抗癌藥等的藥物釋放系統之中。
權利要求
1.一種磁性細胞，所述磁性細胞包含細胞和磁性粒子，所述磁性粒子具有由所述細胞表面粘合的特定氨基酸序列構成的肽，且至少包含磁性體，相對于1mg所述磁性粒子，所述肽在所述磁性粒子上的被覆量為3ng～6.6μg。
2. 如權利要求1所述的磁性細胞，其特征為，所述細胞選自軟骨培 養細胞、間葉細胞、神經干細胞、淋巴細胞及表達整聯蛋白的細胞。
3. 如權利要求1或2所述的磁性細胞，其特征為，所述磁性粒子中 還包含藥物。
4. 一種培養磁性細胞的方法，其特征為，所述方法包括制備權利要 求1 ~3中任一項所述的磁性細胞的步驟和培養所述磁性細胞的步驟。.
全文摘要
由于目前還沒有在可應用于再生醫療等之中的在間葉細胞或軟骨細胞等細胞中結合了磁性粒子的實例，因此本發明研究了將結合了磁性粒子的細胞給藥后能否通過外部的磁力而在局部滯留、或者細胞能否發揮其本來的作用。本發明提供了一種磁性細胞，所述磁性細胞包含細胞和磁性粒子，所述磁性粒子具有由細胞表面粘合的特定氨基酸序列構成的肽，至少包含磁性體，相對于1mg磁性粒子，所述肽在所述磁性粒子上的被覆量為3ng～6.6μg。
文檔編號C12N5/00GK101173250SQ20071016707
公開日2008年5月7日 申請日期2004年6月25日 優先權日2003年6月30日
發明者越智光夫 申請人:衛材R&D管理有限公司;越智光夫