用于檢測細胞死亡的組合物和其使用方法

專利名稱：用于檢測細胞死亡的組合物和其使用方法
用于檢測細胞死亡的組合物和其使用方法對相關申請案的引用本申請案依據35U. S. C. § 119(e)主張2008年7月30日申請的美國臨時申請案 第61/084，861號的權益和優先權，該案全文(包括所有圖式和說明書所有部分)以引用的 方式并入本文中。
背景技術：
細胞死亡是許多疾病以及治療方法(例如癌癥的治療)的一個特征。因此，需要 能夠測量細胞死亡，評估涉及細胞死亡的疾病的狀態或者誘導細胞死亡的治療的效果。近 年來，已經描述了兩種截然不同的細胞死亡機制，稱為凋亡和壞死。盡管這兩種細胞死亡形 式在某些方面存在不同，但它們也可視為一個連續區的兩種極端情況，由此晚期凋亡與壞
死一致。凋亡，也稱為程序性細胞死亡，一般描述為一種能量相關性遺傳控制過程，借助于 這一過程，經由內部調控的自殺程序而激活細胞死亡。凋亡的特征一般包括磷脂酰絲氨酸 外翻、膜完整性喪失、細胞質皺縮、染色質和核凝集、DNA降解，以及細胞經由出芽過程而分 裂成較小的凋亡小體。通常，由此產生的凋亡小體被巨噬細胞和鄰近細胞吞噬，而不會誘發 炎性反應。評估凋亡常用的方法包括利用經熒光標記的膜聯蛋白A5(也稱為膜聯蛋白V)染 色禾口末端尿苷脫氧核苷酸末端標記(terminal uridine deoxynucleotidylend-labeling, TUNEL)分析。壞死，也稱為事故性細胞死亡(accidental cell death)，通常是由多種突發的嚴 重非生理性損傷(例如物理、化學和局部缺血損傷)中任一者誘導。這一過程一般是以漸 進式細胞腫脹、胞漿蛋白變性和凝結、亞細胞器分解和質膜完整性不可逆破壞為特征。此后 一特征使得細胞毒性組分和其它細胞組分滲漏，從而誘發局部炎性反應。膜完整性喪失(凋亡和壞死共有的特征)致使細胞內組分從細胞漏出。因此，已 經將例如乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)蛋白質等細胞內組分的血清和血漿含 量用作細胞死亡(即，壞死和晚期凋亡)的代用標記。

發明內容
本發明至少部分基于本發明者得到的意外發現，S卩，包括LDH在內的脫氫酶不僅 會從死亡細胞中漏出，而且還會被死亡細胞吸收和保留。所述死亡細胞對脫氫酶的攝取使 得有可能借助經適當標記的脫氫酶檢測和監測死亡細胞。此外，所述死亡細胞對脫氫酶的 攝取同樣也使得有可能以選擇性方式靶向這些細胞，以便遞送以與脫氫酶的結合物形式提 供的試劑。以此方式遞送到死亡細胞的試劑可包括治療劑。本文描述的本發明的組合物和方法適用于在體內和體外檢測和監測死亡細胞。在 一個實施例中，本發明適用于檢測和監測經歷凋亡的細胞，尤其包括處于早期凋亡階段的 細胞。可使用所述檢測和監測來評估以細胞死亡為特征的病狀(尤其包括以凋亡性細胞死 亡為特征的病狀)的狀態。或者或另外，可使用所述檢測和監測來評估以細胞死亡為特征或伴隨細胞死亡的治療(尤其包括以凋亡性細胞死亡為特征或伴隨凋亡性細胞死亡的治 療)的效果。例如，可以使用所述檢測和監測來評估化療和放射療法在治療癌癥方面的效果。本文描述的本發明的組合物和方法還適用于將包括治療劑在內的各種試劑選擇 性遞送到死亡細胞。在一個實施例中，本發明適用于將包括治療劑在內的各種試劑選擇性 遞送到經歷凋亡的細胞，尤其包括處于早期凋亡階段的細胞。本文描述的本發明的組合物和方法還適用于治療以細胞死亡(尤其包括凋亡性 細胞死亡)為特征的多種病狀中的任一種。所述病狀可包括需要減少細胞死亡的病狀以及 需要增加細胞死亡的病狀。本發明在一方面是關于分離的由脫氫酶連接于可檢測標記構成的結合物，其中所 述可檢測標記不是免疫球蛋白或其脫氫酶結合片段。在本發明這一方面和其它方面，在一個實施例中，脫氫酶是乳酸脫氫酶(LDH)。在 本發明這一方面和其它方面，在一個實施例中，脫氫酶是人LDH。在本發明這一方面和其它方面，在一個實施例中，脫氫酶是醇脫氫酶 (alcoholdehydrogenase,ADH)。在本發明這一方面和其它方面，在一個實施例中，脫氫酶是 人 ADH。在本發明這一方面和其它方面，在一個實施例中，脫氫酶是醛脫氫酶 (aldehydedehydrogenase，ALDH)。在本發明這一方面和其它方面，在一個實施例中，脫氫酶 是人ALDH。在本發明這一方面和其它方面，在一個實施例中，脫氫酶是蘋果酸脫氫酶 (malatedehydrogenase, MDH)。在本發明這一方面和其它方面，在一個實施例中，脫氫酶是 人 MDH。在本發明這一方面和其它方面，在一個實施例中，可檢測標記選自由以下各物組 成的群組熒光標記、放射性同位素、納米粒子、發色團、染料、酶和造影劑，以及其任何組 合。在本發明這一方面和其它方面，在一個實施例中，可檢測標記是熒光標記。在本發明這 一方面和其它方面，在一個實施例中，可檢測標記是放射性同位素。在本發明這一方面和其 它方面，在一個實施例中，可檢測標記是納米粒子。在本發明這一方面和其它方面，在一個實施例中，本發明是關于一種包括本發明 的結合物的組合物。在一個實施例中，組合物是適于投予個體的藥物組合物。本發明在一方面是關于一種分離的由脫氫酶連接于至少一種治療劑構成的結 合物。在本發明這一方面和其它方面，在一個實施例中，治療劑是抗凋亡劑，其選自由以 下各物組成的群組環肌酸、磷酸環肌酸、輔酶Q10、L-肉堿、谷胱甘肽、α-硫辛酸、卡 斯帕酶(caspase)抑制肽，和抗凋亡蛋白或肽片段，例如凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptoticprotein, IAPs)和抗凋亡BCL-2家族成員，及其任何組合。本發明在一方面是關于編碼脫氫酶的多聚核苷酸，其可操作地連接到編碼可檢測 標記的多聚核苷酸。在一個實施例中，可檢測標記是熒光蛋白。在一個實施例中，可檢測標 記是酶。本發明在一方面是關于一種含有本發明的多聚核苷酸的載體。本發明在一方面是關于一種含有本發明的載體的宿主細胞。
本發明在一方面是關于一種檢測經歷細胞死亡的細胞的方法。根據本發明這一方 面的方法包括以下步驟使測試細胞群與由脫氫酶連接于可檢測標記構成的結合物在適于 所述測試細胞群攝取所述結合物的條件下接觸；和在所述測試細胞群中檢測所述標記，其 中所述測試細胞群中所述標記的存在指示經歷細胞死亡的細胞。在本發明這一方面和其它方面，在一個實施例中，細胞死亡是凋亡。在本發明這一 方面和其它方面，在一個實施例中，細胞死亡是壞死。在本發明這一方面和其它方面，在一個實施例中，方法步驟是在體外進行。在本發 明這一方面和其它方面，在一個實施例中，方法步驟是離體進行。在本發明這一方面和其它 方面，在一個實施例中，至少一個方法步驟是在體內進行。在本發明這一方面和其它方面， 在一個實施例中，方法步驟都是在體內進行。在本發明這一方面和其它方面，在一個實施例中，測試細胞群是從患有或懷疑患 有與凋亡或壞死相關的病狀的個體獲得。在本發明這一方面和其它方面，在一個實施例中，個體是人類。在本發明這一方面和其它方面，在一個實施例中，病狀選自由以下各病狀組成的 群組癌癥；實體腫瘤和血液腫瘤中化療、放射或激素誘導的細胞凋亡；對療法具抗性的腫 瘤；急性心臟同種異體移植物排斥；急性心肌梗塞；蒽環類誘發的心臟毒性；致心律失常性 右心室發育不良；骨骼肌細胞凋亡；充血性心力衰竭；冠狀動脈疾病；動脈粥樣硬化；感染 性心內膜炎；心肌炎；心肌功能障礙；心肌缺血再灌注損傷；非心臟同種異體移植物排斥； 移植物抗宿主疾病；細菌感染；病毒感染；多器官功能障礙綜合癥；膿毒性休克；腦缺血再 灌注損傷，包括中風；黃斑變性；神經退化性疾病；中樞神經系統外傷；自體免疫性糖尿病； 類風濕性關節炎；系統性紅斑狼瘡；炎性腸病；多發性硬化；其它自體免疫疾病；膜聯蛋白 病；骨關節炎；腎衰竭；慢性腎萎縮和腎纖維化；腎小球損傷；和多囊腎病；以及其任何組
I=I O在一個實施例中，所述方法進一步包括以下步驟測量在測試細胞群中檢測到的 標記的測試量；將在測試群中檢測到的標記測試量與在參考細胞群中檢測到的標記參考量 相比較；和確定(a)當測試量大于參考量時細胞死亡的量增加，或(b)當測試量小于參考量 時細胞死亡的量減少。本發明在一方面是關于一種治療與細胞凋亡相關的病狀的方法。根據本發明這一 方面的方法包括以下步驟對患有或懷疑患有與細胞凋亡有關的病狀的個體投予有效治療 所述病狀的量的藥物組合物，所述藥物組合物包含由脫氫酶連接于至少一種治療劑構成的 結合物。在一個實施例中，所述方法進一步包括監測個體體內的細胞凋亡的步驟。本發明在一方面是關于一種將試劑選擇性遞送到凋亡細胞的方法。根據本發明這 一方面的方法包括使凋亡細胞與由脫氫酶連接于至少一種試劑構成的結合物接觸的步驟。在一個實施例中，試劑是抗凋亡劑。本發明在一方面是關于一種鑒別抗凋亡劑的方法。根據本發明這一方面的方法包 括以下步驟使測試細胞與測試劑和由脫氫酶連接于可檢測標記構成的結合物在另外誘導 測試細胞凋亡的條件下接觸；測量測試細胞中標記的測試量；將標記的測試量與參考細胞 中標記的參考量相比較，所述參考細胞已與所述結合物在另外誘導測試細胞凋亡的條件下接觸；和當標記的測試量小于標記的參考量時，將測試劑鑒別為抗凋亡劑。本發明的每一限定都可涵蓋本發明的各種實施例。因此，預期涉及任一要素或要 素組合的本發明的每一限定都可以包括在本發明各方面中。本發明的應用并不局限于以下 描述中所陳述或各圖式中所說明的組分的構建和布置細節。本發明能夠以其它實施例實踐 或以不同方式進行。另外，本文使用的措辭和術語都是出于描述的目的，并且不應將其視為 限制。本文中使用的“包括”、“包含”或“具有”、“含有”、“涉及”和其變化形式將涵蓋后文 所列各項和其等效物以及額外各項。


圖 1 是一組熒光激活細胞分選(fluorescence-activated cell sorting, FACS) 柱形圖，描述了使用經異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)標記的膜聯 蛋白V和經Cy5. 5標記的LDH測量的海拉(HeLa)細胞隨時間的凋亡。圖2是一組FACS柱形圖，描述了使用經FITC標記的膜聯蛋白V和經Cy5. 5標記 的LDH測量的RS4 ；11細胞的凋亡。圖3是一組FACS柱形圖，描述了在含有鈣的膜聯蛋白緩沖液或不含鈣的磷酸鹽緩 沖的生理鹽水(phosphate-buffered saline, PBS)中使用經FITC標記的膜聯蛋白V和經 Cy5. 5標記的LDH測量的海拉細胞的凋亡。圖4是描述基于LDH的凋亡分析與基于膜聯蛋白V的凋亡分析對血清的不敏感性 的比較圖。圖5是一組FACS柱形圖，描述了經FITC標記的谷胱甘肽S-轉移酶(glutathione Stransferase, GST)無法使凋亡的海拉細胞染色，而經FITC標記的利用三種人LDH同工型 (LDH-A、LDH-B和LDH-C)中每一種制備的GST融合蛋白可使凋亡的海拉細胞染色，未結合 的LDH-B探針也如此。圖6是一組FACS柱形圖，描述了利用經Alexa 680標記的醇脫氫酶(ADH)、醛脫氫 酶(ALDH)和蘋果酸脫氫酶(MDH)進行的凋亡海拉細胞的檢測。圖7是一對攝影圖像，描述了用媒劑(左圖)或紫杉醇(Taxol)(右圖)處理的帶 有原位乳房異種移植(MDA-MB43Q腫瘤的小鼠體內經標記LDH探針的積累。箭頭指示腫瘤 的位置。圖8提供在暴發性肝衰竭模型中LDH-B探針的示范性使用。㈧提供用抗Fas或 對照IgG抗體進行處理的圖解以及由近紅外體內成像獲得的一系列圖像；(B、C)提供的兩 個圖顯示了在比較經抗Fas處理的動物與IgG對照處理的動物(每組η =幻時LDHB探針 和膜聯蛋白V探針的定量結果。圖9提供LDH探針用于使治療誘導的細胞死亡成像的示范性使用。(A)描述了用 ΑΜΝ107(尼羅替尼(nilotinib))處理KU812 (BCR-ABL+)腫瘤的圖解以及顯示經AMN107處 理的動物中腫瘤消退的圖；(B、C)提供的一系列圖像和圖說明了經AMN107處理的動物中 LDHB探針的攝取相比媒劑處理的對照組有所增加。箭頭指示腫瘤的位置。
具體實施例方式凋亡是程序性細胞死亡(programmed cell death, PCD)的一種高度保守形式，在如器官發育、組織穩態和免疫系統調控等多種生理過程中起到重要作用，因為許多生物體 使用這一機制來選擇性除去不必要的細胞。然而，當存活與死亡信號之間的生理平衡偏向 細胞死亡時，將進入凋亡程序并達到多種病理病狀的頂點。據悉，過度凋亡會導致組織功 能性的漸進性喪失，如在急性心肌梗塞、慢性心力衰竭、同種異體移植物排斥、中風、神經退 化性病癥(例如阿茲海默氏病(Alzheimer' s)、帕金森氏病(Parkinson' s)和亨廷頓 氏病(Huntington' s disease))和炎癥中所出現的情況。相比之下，如系統性紅斑狼瘡 (systemic lupus erythematosus，SLE)和類風濕性關節炎等自體免疫疾病是以凋亡不足 為特征，這使得免疫活性細胞(即，自體反應性淋巴細胞)能夠存活并且不適宜地損傷健康 器官。抗凋亡機制在癌癥形成過程中也起到關鍵作用。此外，許多藥物的有益或有害效應 都可能歸因于其對凋亡過程的作用。因此，在體內無創監測凋亡發生的速率和程度將為臨 床醫生提供有關疾病活動性和治療功效的相關臨床信息。凋亡可分為早期凋亡和晚期凋亡。處于早期凋亡階段的細胞通常對膜聯蛋白V染 色呈陽性，而對例如碘化丙啶(propidium iodide,PI)等所謂的活體染色劑染色不呈陽性。 相比之下，處于晚期凋亡階段的細胞以及壞死細胞常常對膜聯蛋白V和PI都呈陽性。已經進行了包括臨床試驗在內的多種嘗試來測量體外和體內的細胞凋亡。這些研 究中大部分都依賴于與將結合于磷脂酰絲氨酸的膜聯蛋白V形成的各種結合物。膜聯蛋白 V是結合鈣和磷脂的膜聯蛋白超家族的一個成員，這一家族中有至少13個成員已經在多種 生物體中得到鑒別。與其它膜聯蛋白成員相同，膜聯蛋白V廣泛表達于真核生物體中。這種 蛋白質主要是在細胞內質膜的胞質側上發現，但在健康人類的血液區室中的循環濃度極低 (l-6ng/ml)。此外，在多種細胞類型和組織中普遍表達這種蛋白質，包括心肌細胞、血管內 皮、紅細胞、凝血細胞、淋巴細胞、膠質細胞、星形細胞、少突膠質細胞、雪旺氏細胞Gchwarm cell)、骨胳肌細胞、肝細胞、支氣管、軟骨細胞和成骨細胞。在活細胞的質膜內，磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)殘基呈不對稱定 向，致使其僅僅暴露于細胞內區室，即，PS殘基朝向內部。在細胞凋亡級聯的早期，膜極性 喪失，由此導致PS殘基暴露于質膜的細胞外側。在這一階段，膜聯蛋白V結合于外部暴露 的PS殘基，但膜不能自由地透過。小分子染料，例如碘化丙啶(PI)或臺盼藍(trypanblue) (即活體染料)，無法自由地擴散到細胞中。因此，早期凋亡細胞對膜聯蛋白V染色呈陽性， 但對活體染料染色呈陰性。在晚期凋亡細胞和壞死細胞中，膜完整性喪失，由此使得活體染 料自由擴散到細胞中。因此，死亡細胞對于膜聯蛋白V和活體染料都呈陽性。根據這些觀察結果，最初曾用不同的熒光標簽(例如FITC)來標記膜聯蛋白V，而 現今常將膜聯蛋白V用于組織學和細胞分選研究中，以鑒別和定量凋亡細胞。然而，所有這 些檢測方法(例如顯微鏡檢查、免疫組織化學法、流式細胞測量術、高通量篩選法)或是在 檢測能力方面存在某些問題，或是在體外的適用性有限，并且通常需要如活組織檢查等創 傷性取樣技術。如TUNEL分析等其它方法在定量所述過程方面經常缺乏靈敏性，因為其檢 測機制僅靶向處于凋亡級聯的較晚階段的細胞，而此時凋亡細胞的吞噬作用已經在體內發 生了。也曾經用例如99mTc或123I等放射性核素標簽對膜聯蛋白V進行放射性標記，以便 在體內進行細胞凋亡的無創檢測和定量。最初利用正常和鐮狀紅細胞、激活的血小板和組 織因子(tissue factor, TF)表達性成纖維細胞或卵巢癌細胞進行的體外研究明確證實了一個觀點，即，可以利用經放射性標記的膜聯蛋白V成功地檢測早期凋亡。此后，在體內評 價動物和人體中經放射性標記的膜聯蛋白V方面進行了包括臨床試驗在內的深入研究。這些使用經標記的膜聯蛋白V測量細胞凋亡的嘗試的結果證實是令人失望的。由 這些方法得到的動態范圍相當有限，因為血清蛋白對膜聯蛋白V結合具有抑制作用，并且 膜聯蛋白V結合需要鈣。此外，膜聯蛋白V和相關試劑相當昂貴。本發明至少部分是基于經歷凋亡和壞死的細胞能夠吸收和保留脫氫酶。先前曾報 導過，死亡細胞會釋放多種酶，包括LDH。而先前尚不了解且出乎預期的是，死亡細胞也吸收 和保留LDH。除LDH外，本發明者還發現，類似地，經歷凋亡和壞死的細胞可吸收和保留各種 其它脫氫酶，至少包括醇脫氫酶、醛脫氫酶、蘋果酸脫氫酶和各種人LDH的同工型(LDH-A、 LDH-B和LDH-C)。相比之下且如本文所揭示，這一現象是專門針對脫氫酶，因為谷胱甘肽S 轉移酶(GST ；—種分子量大致等于LDH的非脫氫酶類酶)不能被死亡細胞吸收和保留，而 GST-LDH結合物能被死亡細胞吸收和保留。很明顯，如本文所描述的，LDH探針不僅僅通過在膜完整性喪失后被動擴散到死亡 細胞中而充當活體染料。第一，LDH探針使處于早期凋亡階段的細胞染色(即，膜聯蛋白V 陽性、活體染料陰性)。第二，在徹底洗滌后，LDH探針不會自由擴散到細胞外。脫氫酶是普遍存在的高度保守的酶，其催化一個質子和一對電子從供體分子轉移 到受體分子，由此氧化供體并還原受體。這些酶通常使用NAD/NADP或者黃素輔酶(例如 FAD或FMN)作為受體。脫氫酶特別包括(但不限于)乳酸脫氫酶、醇脫氫酶、醛脫氫酶和蘋 果酸脫氫酶。其它代表性脫氫酶列于表1中。表1.代表性脫氫酶的清單
權利要求
1.一種脫氫酶連接于可檢測標記的分離的結合物，其中所述可檢測標記不是免疫球蛋 白或其脫氫酶結合片段。
2.根據權利要求1所述的結合物，其中所述脫氫酶是乳酸脫氫酶(LDH)。
3.根據權利要求2所述的結合物，其中所述LDH為人LDH。
4.根據權利要求1所述的結合物，其中所述脫氫酶選自由以下組成的群組 醇脫氫酶(ADH)、醛脫氫酶(ALDH)和蘋果酸脫氫酶(MDH)。
5.根據權利要求4所述的結合物，其中所述脫氫酶為人脫氫酶。
6.根據權利要求1所述的結合物，其中所述可檢測標記選自由以下組成的群組 熒光標記、放射性同位素、納米粒子、發色團、染料、酶和造影劑。
7.根據權利要求6所述的結合物，其中所述標記為熒光標記。
8.根據權利要求6所述的結合物，其中所述標記為放射性同位素。
9.根據權利要求6所述的結合物，其中所述標記為納米粒子。
10.一種組合物，其包含根據權利要求1至9中任一權利要求所述的結合物。
11.一種脫氫酶連接于至少一種治療劑的分離的結合物。
12.根據權利要求11所述的結合物，其中所述脫氫酶是乳酸脫氫酶(LDH)。
13.根據權利要求12所述的結合物，其中所述LDH為人LDH。
14.根據權利要求11所述的結合物，其中所述脫氫酶選自由以下組成的群組 醇脫氫酶(ADH)、醛脫氫酶(ALDH)和蘋果酸脫氫酶(MDH)。
15.根據權利要求14所述的結合物，其中所述脫氫酶為人脫氫酶。
16.根據權利要求11所述的結合物，其中所述治療劑為抗凋亡劑，其選自由以下組成 的群組環肌酸、磷酸環肌酸、輔酶Q10、L_肉堿、谷胱甘肽、α -硫辛酸、卡斯帕酶(caspase)抑 制肽和凋亡抑制蛋白(IAP)。
17.—種組合物，其包含根據權利要求11至14中任一權利要求所述的結合物。
18.—種編碼脫氫酶的多聚核苷酸，其可操作地連接到編碼可檢測標記的多聚核苷酸。
19.根據權利要求18所述的多聚核苷酸，其中所述脫氫酶是乳酸脫氫酶(LDH)。
20.根據權利要求19所述的多聚核苷酸，其中所述LDH為人LDH。
21.根據權利要求18所述的多聚核苷酸，其中所述脫氫酶選自由以下組成的群組 醇脫氫酶(ADH)、醛脫氫酶(ALDH)和蘋果酸脫氫酶(MDH)。
22.根據權利要求21所述的多聚核苷酸，其中所述脫氫酶為人脫氫酶。
23.根據權利要求18所述的多聚核苷酸，其中所述可檢測標記為熒光蛋白。
24.根據權利要求18所述的多聚核苷酸，其中所述可檢測標記是酶。
25.—種載體，其包含根據權利要求18至M中任一權利要求所述的多聚核苷酸。
26.一種宿主細胞，其包含根據權利要求25所述的載體。
27.一種用于檢測正經歷細胞死亡的細胞的方法，所述方法包含使測試細胞群與脫氫酶連接于可檢測標記的結合物在適于所述測試細胞群攝取所述 結合物的條件下接觸；和在所述測試細胞群中檢測所述標記，其中在所述測試細胞群中所述標記的存在指示正經歷細胞死亡的細胞。
28.根據權利要求27所述的方法，其中所述脫氫酶是乳酸脫氫酶(LDH)。
29.根據權利要求觀所述的方法，其中所述LDH為人LDH。
30.根據權利要求27所述的方法，其中所述脫氫酶選自由以下組成的群組 醇脫氫酶(ADH)、醛脫氫酶(ALDH)和蘋果酸脫氫酶(MDH)。
31.根據權利要求30所述的方法，其中所述脫氫酶為人脫氫酶。
32.根據權利要求27所述的方法，其中所述細胞死亡是凋亡。
33.根據權利要求27所述的方法，其中所述細胞死亡是壞死。
34.根據權利要求27所述的方法，其中所述接觸和所述檢測都是在體外進行的。
35.根據權利要求27所述的方法，其中所述接觸和所述檢測都是離體進行的。
36.根據權利要求27所述的方法，其中所述接觸和所述檢測中至少一者是在體內進行的。
37.根據權利要求36所述的方法，其中所述接觸和所述檢測都是在體內進行的。
38.根據權利要求27所述的方法，其中所述測試細胞群是從患有或懷疑患有與細胞凋 亡有關的病狀的個體獲得。
39.根據權利要求38所述的方法，其中所述病狀選自由以下組成的群組癌癥；實體腫瘤和血液腫瘤中化療、放射或激素誘導的細胞凋亡；對療法具抗性的腫 瘤；急性心臟同種異體移植物排斥；急性心肌梗塞；蒽環類誘發的心臟毒性；致心律失常性 右心室發育不良；骨骼肌細胞凋亡；充血性心力衰竭；冠狀動脈疾病；動脈粥樣硬化；感染 性心內膜炎；心肌炎；心肌功能障礙；心肌缺血再灌注損傷；非心臟同種異體移植物排斥； 細菌感染；病毒感染；多器官功能障礙綜合癥；膿毒性休克；腦缺血再灌注損傷；黃斑變性； 神經退化性疾病；中樞神經系統外傷；自體免疫性糖尿病；類風濕性關節炎；系統性紅斑狼 瘡；炎性腸病；多發性硬化；其它自體免疫疾病；膜聯蛋白病；骨關節炎 ’腎衰竭；慢性腎萎 縮和腎纖維化；腎小球損傷；和多囊腎病。
40.根據權利要求27所述的方法，其進一步包含 測量在所述測試細胞群中檢測到的標記的測試量；將在所述測試細胞群中檢測到的所述標記測試量與在參考細胞群中檢測到的標記參 考量相比較；和確定(a)當所述測試量大于所述參考量時細胞死亡的量增加，或(b)當所述測試量小 于所述參考量時細胞死亡的量減少。
41.根據權利要求40所述的方法，其中所述細胞死亡是凋亡。
42.根據權利要求40所述的方法，其中所述細胞死亡是壞死。
43.一種用于治療與細胞凋亡有關的病狀的方法，所述方法包含對患有或懷疑患有與細胞凋亡相關的病狀的個體投予有效治療所述病狀的量的藥物 組合物，所述藥物組合物包含脫氫酶連接于至少一種治療劑的結合物。
44.根據權利要求43所述的方法，其中所述脫氫酶是乳酸脫氫酶(LDH)。
45.根據權利要求44所述的方法，其中所述LDH為人LDH。
46.根據權利要求43所述的方法，其中所述脫氫酶選自由以下組成的群組 醇脫氫酶(ADH)、醛脫氫酶(ALDH)和蘋果酸脫氫酶(MDH)。
47.根據權利要求46所述的方法，其中所述脫氫酶為人脫氫酶。
48.根據權利要求43所述的方法，其中所述病狀選自由以下組成的群組癌癥；實體腫瘤和血液腫瘤中化療、放射或激素誘導的細胞凋亡；對療法具抗性的腫 瘤；急性心臟同種異體移植物排斥；急性心肌梗塞；蒽環類誘發的心臟毒性；致心律失常性 右心室發育不良；骨骼肌細胞凋亡；充血性心力衰竭；冠狀動脈疾病；動脈粥樣硬化；感染 性心內膜炎；心肌炎；心肌功能障礙；心肌缺血再灌注損傷；非心臟同種異體移植物排斥； 細菌感染；病毒感染；多器官功能障礙綜合癥；膿毒性休克；腦缺血再灌注損傷；黃斑變性； 神經退化性疾病；中樞神經系統外傷；自體免疫性糖尿病；類風濕性關節炎；系統性紅斑狼 瘡；炎性腸病；多發性硬化；其它自體免疫疾病；膜聯蛋白病；骨關節炎 ’腎衰竭；慢性腎萎 縮和腎纖維化；腎小球損傷；和多囊腎病。
49.根據權利要求43至48中任一權利要求所述的方法，其進一步包含監測所述個體體 內的細胞凋亡。
50.一種用于將試劑選擇性遞送到凋亡細胞的方法，所述方法包含 使凋亡細胞與脫氫酶連接于至少一種試劑的結合物接觸。
51.根據權利要求50所述的方法，其中所述脫氫酶是乳酸脫氫酶(LDH)。
52.根據權利要求51所述的方法，其中所述LDH為人LDH。
53.根據權利要求50所述的方法，其中所述脫氫酶選自由以下組成的群組 醇脫氫酶(ADH)、醛脫氫酶(ALDH)和蘋果酸脫氫酶(MDH)。
54.根據權利要求53所述的方法，其中所述脫氫酶為人脫氫酶。
55.根據權利要求50所述的方法，其中所述試劑為抗凋亡劑。
56.根據權利要求55所述的方法，其中所述抗凋亡劑選自由以下組成的群組 環肌酸、磷酸環肌酸、輔酶Q10、L_肉堿、谷胱甘肽、α -硫辛酸、卡斯帕酶抑制肽和凋亡抑制蛋白(IAP)。
57.一種用于鑒別抗凋亡劑的方法，其包含使測試細胞與測試劑和脫氫酶連接于可檢測標記的結合物在另外誘導所述測試細胞 凋亡的條件下接觸；測量所述測試細胞中標記的測試量；將所述標記測試量與參考細胞中標記的參考量相比較，所述參考細胞已與所述結合物 在另外誘導所述測試細胞凋亡的條件下接觸；和當所述標記測試量小于所述標記參考量時，將所述測試劑鑒別為抗凋亡劑。
58.根據權利要求57所述的方法，其中所述脫氫酶是乳酸脫氫酶(LDH)。
59.根據權利要求58所述的方法，其中所述LDH為人LDH。
60.根據權利要求57所述的方法，其中所述脫氫酶選自由以下組成的群組 醇脫氫酶(ADH)、醛脫氫酶(ALDH)和蘋果酸脫氫酶(MDH)。
61.根據權利要求60所述的方法，其中所述脫氫酶為人脫氫酶。
62.根據權利要求57所述的方法，其中所述可檢測標記選自由以下組成的群組 熒光標記、放射性同位素、納米粒子、發色團、染料、酶和造影劑。
63.根據權利要求62所述的方法，其中所述標記為熒光標記。
64.根據權利要求62所述的方法，其中所述標記為放射性同位素。
65.根據權利要求62所述的方法，其中所述標記為納米粒子。
全文摘要
本發明提供在體外和體內檢測細胞凋亡和壞死的化合物和其使用方法。還提供將試劑選擇性遞送到正經歷細胞凋亡或壞死的細胞的化合物和其使用方法。所述化合物和方法是基于與例如乳酸脫氫酶、醇脫氫酶、醛脫氫酶和蘋果酸脫氫酶等脫氫酶形成的結合物。所述化合物和方法適用于診斷和治療以細胞凋亡為特征的病狀，包括癌癥、心臟病、神經病(包括中風)和自體免疫性。所述化合物和方法將提供超越與基于膜聯蛋白V的相應化合物和方法的截然不同的優勢。本發明還提供用于篩選可調節(即，抑制或促進)細胞凋亡的化合物的方法。
文檔編號C12Q1/32GK102105594SQ200980129095
公開日2011年6月22日 申請日期2009年7月29日 優先權日2008年7月30日
發明者安德魯·孔, 帕拉布·班納吉 申請人:達納-法伯癌癥研究所有限公司