用于重建骨細胞微環境的微流控芯片及其使用方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種用于重建骨細胞微環境的微流控芯片及其使用方法。
【背景技術】
[0002]骨質疏松癥會引起骨折等肢體功能缺失并發癥，嚴重影響患者獨立生活能力，降低生活質量。在中國就有6300萬人患有不同程度的骨質疏松癥。在骨組織的新陳代謝中，骨細胞能夠通過調控成骨細胞和破骨細胞的功能實現骨組織的重塑，被認為是能從本質上解決骨質疏松癥的潛在突破點，因此研究骨細胞具有非常重要的意義。
[0003]微流控技術作為一種新式研究工具，可在微觀尺度下控制、操作和檢測流體，由于其特征尺寸與細胞尺寸相比擬，具有在時空上精確控制細胞位置、細胞因子濃度和代謝物輸運等能力。
[0004]在骨細胞的機制研究中，細胞培養是基本實驗模型，通過一個能模擬體內環境的體外空間，配置以無菌、適當溫度、酸堿度和一定營養條件培養細胞，使之生長繁殖并維持其結構和功能。細胞體外培養過程中能夠獲取大量可靠的細胞層面和分子層面的信息，因此骨細胞體外培養的研究是十分必要的。
[0005]骨細胞在生理條件下處于有流體應力的環境中。現有的研究骨細胞在流體應力刺激下的實驗大多是將細胞接種于流體小室內，待細胞貼壁生長后，在小室內注入流體，進而觀察在流體刺激下的細胞響應。
[0006]在實現本發明的過程中，申請人發現上述現有技術存在如下技術缺陷:
[0007](1)骨細胞在體內有著特殊的微環境，細胞之間通過突觸連接成網絡結構，而傳統的流體小室內骨細胞所處環境與體內微環境相差甚大，細胞突觸無序生長、無法與周圍環境建立有效物理連接。
[0008](2)骨細胞包括位于陷窩中的細胞體和存在于納米尺度溝道中的細胞突觸，在生理條件下細胞突觸感受到的流體應力遠大于細胞體上感受到的流體應力。但是傳統的流體小室內骨細胞的細胞體和細胞突觸表面會形成相同的流體應力，在客觀上難以真實反映生理狀態骨細胞的生物學特征。
【發明內容】
[0009](一 )要解決的技術問題
[0010]鑒于上述技術問題，本發明提供了一種用于重建骨細胞微環境的微流控芯片及其使用方法，以更好的模擬人體骨細胞的特殊環境。
[0011](二)技術方案
[0012]根據本發明的一個方面，提供了一種用于重建骨細胞微環境的微流控芯片。該微流控芯片包括:至少一條骨細胞培養溝道，用于進行骨細胞的培養，其至少包含一主溝道，在該主溝道的底壁上形成有二維網格圖案。其中，在二維網格圖案中，網格節點位置以及相鄰網格節點橫向和縱向連接的位置修飾有膠原，在網眼位置沉積有金薄膜，并在該金薄膜上修飾有硫醇。其中，具有骨細胞的培養基被注入主溝道中，骨細胞貼附于膠原修飾的網格節點位置，并沿相鄰網格節點橫向和縱向連接的方向伸出細胞突觸，而硫醇修飾金薄膜的網眼位置骨細胞不能貼附。
[0013]優選地，上述微流控芯片中，骨細胞培養溝道還包括:中從溝道，正對主溝道設置，其前端連接至中流體進口 ；左從溝道，位于中從溝道的左側，其前端連接至左流體進口 ；右從溝道，位于中從溝道的右側，其前端連接至右流體進口 ；左從溝道和右從溝道在中從溝道的兩側對稱設置，中從溝道、左從溝道、右從溝道的末端連接至主溝道的前端，主溝道的末端連接至流體出口。
[0014]根據本發明的另一個方面，還提供了一種上述微流控芯片的使用方法。該制作方法包括:步驟S202:在骨細胞培養溝道中的主溝道的二維網格圖案上網格節點位置以及相鄰網格節點橫向和縱向連接的位置的表面上修飾膠原；步驟S204:在骨細胞培養溝道內進行骨細胞接種；步驟S206:在骨細胞培養溝道內對骨細胞進行培養；步驟S208:待細胞在主溝道內貼壁良好后，中流體進口通入第一物質的溶液，左流體進口和右流體進口通入第二物質的溶液，調整液體流速，以使第一物質和第二物質反應生成的固態聚合物覆蓋在骨細胞上，填充于溝道的中間位置并在兩側露出可供流體通過的通道，使靠近溝道兩側的骨細胞的突觸被露出；以及步驟S212:通過在左從溝道和右從溝道引入可控制流體，利用流體的沖刷對骨細胞產生應力刺激，觀測骨細胞在振蕩流體應力作用下的響應。
[0015](三)有益效果
[0016]從上述技術方案可以看出，本發明用于重建骨細胞微環境的微流控芯片及其使用方法將微流控技術與傳統骨細胞的培養技術相結合，可以實現基底修飾、片上接種，二維網格圖案形成，海藻酸鈣聚合物固定以及外加流體振蕩流刺激，具體來講，其具有以下有益效果:
[0017](1)通過構建以金為基底的二維網格圖案，通過浸泡硫醇對圖案表面進行疏水修飾，使細胞沿著圖案實現有序生長；
[0018](2)利用海藻酸鈣聚合物蓋住骨細胞細胞體，露出細胞突觸，這樣流體應力在突觸部位就有了放大的作用，解決了傳統的骨細胞流體應力刺激實驗中細胞體和細胞突觸表面會形成相同流體應力的難題，能更加真實地反映生理狀態骨細胞的生物學特征。
【附圖說明】
[0019]圖1為根據本發明實施例重建骨細胞微環境的微流控芯片的俯視圖；
[0020]圖2為圖1所示微流控芯片沿A-A’面的剖視圖；
[0021]圖3A為圖1所示微流控芯片的一條骨細胞培養溝道中主溝道的示意圖；
[0022]圖3B為圖3A所示主溝道表面二維網格圖案的示意圖；
[0023]圖3C為圖3A所示骨細胞培養溝道中流體進口、流體出口、從溝道和主溝道的示意圖；
[0024]圖4為微流控芯片的骨細胞培養溝道的主溝道中的細胞被固化后主溝道沿圖3A中B-B’面的剖視圖；
[0025]圖5為根據本發明實施例微流控芯片制備方法的流程圖；
[0026]圖6為圖5所示微流控芯片制備方法中執行各步驟后微流控芯片沿側切方向的剖視圖；
[0027]圖7為根據本發明實施例微流控芯片使用方法的流程圖。
【具體實施方式】
[0028]在對本發明進行介紹之前，首先對芯片設計的原理進行說明。請參照圖1，有一種功能基團為聚乙醇長鏈(PEG)的硫醇分子(EG-terminated th1ls，簡稱EG6，分子式為(HS(CH2)n(0CH2CH2)60H)。這種硫醇分子可以與金屬金(Au)發生反應，在硫原子⑶的一側形成金硫鍵。而硫醇的另一端因為有PEG的存在，可以起到抗蛋白吸附的作用，進而阻止細胞吸附在Au表面。
[0029]本發明將微流控芯片技術與骨細胞的培養技術結合，通過限定細胞突觸沿著納米尺寸溝道定向生長的方法，利用海藻酸鈣聚合物蓋住骨細胞細胞體并露出細胞突觸，最終引入流體振蕩流刺激，更好地模擬了骨細胞在生理條件下的微環境。
[0030]為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚明白，以下結合具體實施例，并參照附圖，對本發明進一步詳細說明。
[0031]在本發明的一個示例性實施例中，提供了一種用于重建骨細胞微環境的微流控芯片。請參照圖1，本實施例微流控芯片包括:基底；以及固定于基底上表面的溝道形成層。其中，在溝道形成層中形成三條骨細胞培養溝道。每條骨細胞培養溝道包括:主溝道，其末端連接至流體出口 ；中從溝道，正對主溝道設置，其前端連接至中流體進口，其末端連接至主溝道的前端；左從溝道，位于所述中從溝道的左側，其前端連接至左流體進口，其末端連接至主溝道的前端；右從溝道，位于所述中從溝道的右側，其前端連接至右流體進口，其末端連接至主溝道的前端。
[0032]以下對本實施例重建骨細胞微環境的微流控芯片的各個組成部分進行詳細說明。
[0033]請參照圖1，微流控芯片的面積為75mmX25mm，其溝道形成層上形成有三條的骨細胞培養溝道。該三條骨細胞培養溝道按照流體進/出口的方向交錯設置，以節約芯片面積，實現在較小芯片面積上盡可能多的骨細胞培養溝道。
[0034]需要說明的是，本實施例中微流控芯片的溝道形成層上形成有三條的骨細胞培養溝道，但本發明并不以此為限。本領域技術人員可以根據芯片面積以及實驗需要合理設置骨細胞培養溝道的數量，其可以為1條、2條、5條、10條、20條、50條，甚至上百條，均在本發明的保護范圍之內。
[0035]請繼續參照圖1，骨細胞培養溝道中，主溝道的長度為5_，寬度為300 μηι。中從溝道正對主溝道設置，左從溝道和右從溝道位于中從溝道的兩側，兩者相對于中從溝道對稱設置，三條從溝道的寬度均為100 μ m。三個流體進口的直徑為4mm，左/右流體進口與中流體進口之間的距離為9mm。
[0036]如圖2所示，整個溝道形成層的厚度為2mm，而主溝道和三條從溝道的高度均為100 μm0此外，本實施例中，主溝道和三條從溝道的縱剖面形狀均為圓形，但本發明并不以此為限。在本發明其他實施例中，主溝道和三條從溝道的縱剖面形狀還可以為橢圓形，矩形等形狀。
[0037]此外，關于細胞培養溝道、主溝道、從溝道等的形